全 文 ：中国药业 China Pharmaceuticals·20·
2011年第 20卷第 18期
尼泊尔菊三七的离体快繁技术研究
高 倩，李 娜，贾景明
(沈阳药科大学，辽宁 沈阳 110016 )
摘要:目的 依据尼泊尔菊三七野生资源开发利用情况，以尼泊尔菊三七的茎段为外植体，建立其离体快繁体系。方法 通过正交设计法，添
加不同浓度激素 [6 －苄氨基嘌呤 (6 － BA)和萘乙酸 (NAA) ]、无机元素和活性炭，建立包括丛生芽诱导、生根、壮苗以及移栽的离体快繁体系。
结果 用 75%乙醇和 0． 1%升汞对外植体消毒的时间分别为 20 s，6 min; 尼泊尔菊三七离体快繁的最佳增殖培养条件为MS +萘乙酸
0． 5 mg / L + 6 －苄氨基嘌呤 1． 0 mg / L +蔗糖 30 g / L +琼脂 5． 0 g / L，pH = 6． 0;壮苗生根的最佳培养条件是1 /2 MS +萘乙酸 0． 5 mg / L +
6 －苄氨基嘌呤 1． 0 mg / L +蔗糖 30 g / L +活性炭 2． 0 g / L +琼脂 5． 0 g / L，pH = 6． 0;移栽期间的最佳基质是腐殖土∶木炭土 = 3 ∶ 2。结论
成功建立尼泊尔菊三七离体快繁体系，为将来大规模生产奠定了基础。
关键词:尼泊尔菊三七;离体快繁;茎段
中图分类号:S567． 23 +6;R282． 71 文献标识码:A 文章编号:1006 － 4931 (2011 )18 － 0020 － 03
Study on Rapid Micropropagation Technique in Vitro of Medical Plant Gynura nepalensis DC．
Gao Qian， Li Na， Jia Jingming
( Shenyang Pharmaceutical University， Shenyang， Liaoning， China 110016 )
Abstract:Objective To establish the method of rapid micropropagation system according to the exploitative situation of Gynura nepalensis
DC． wild resources for getting the best culture conditions． Methods The orthogonal methods were used to determine the optimal concentration
of different hormones (6 － BA and NAA) in the differentiation medium with different concentrations of inorganic elements and activated
carbon to establish the rapid micropropagation system including multiple shoot clumps induction， rooting， strong seedling and trans-
planting． Results The sterilizing time of explants in 75% ethanol and 0． 1% mercuric chloride was 20 s and 6 min respectively． The best
culture conditions for rapid micropropagation were MS media supplemented with 0． 5 mg / L NAA，1． 0 mg / L 16 － BA，30 g / L sucrose and
5． 0 g / L agar． The pH value of media was adjusted to 6． 0． The optimal media for rooting and strong seedling was as follows: 1 / 2 MS
media supplemented with 0． 5 mg / L NAA，1． 0 mg / L 6 － BA，30 g / L sucrose，2． 0 g / L activated carbon and 5． 0 g / L agar with pH adjusted
to 6． 0． The best substrates of transplanting were humus and charcoal soil (3 ∶ 2 ) ． Conclusion The rapid micopropagation system of Gynura
nepalensis DC． is established successfully，which lays the foundation for large － scale production in future．
Key words: Gynura nepalensis DC． ; rapid micropropagation in vitro; stem segment
药物研究
尼泊尔菊三七 Gynura nepalensis DC． 为菊科菊三七属植物，以
地上部位入药，为多年生草本植物，是我国最新发现的极具药用价
值的珍贵物种。该植物中含有大量具有药理活性的生物碱、萜烯、
苷类、黄酮、糖类、有机酸等化学成分 [ 1 ]，其中黄酮类和多糖类成分
具有明显的降血糖作用。其主要分布在尼泊尔、缅甸、不丹、锡金和
我国的贵州、云南等地，生长于海拔 1 100 ～ 2 100 m 的地区，见于
溪边岩石上和田边 [ 2 ]。由于其对气候要求高，受繁殖方法和繁殖速
度的影响，目前尚未人工引种栽培，而野生资源已远不能满足市场
需求。离体快繁技术通常包括 4 个环节:无菌培养体系的建立，培
养物的增殖，器官的分化，植株的生成和移栽 [ 3 ]。笔者通过茎段诱导
丛生芽建立的离体快繁体系能在短时间内提供优质种苗，实现人
工大规模栽培，对开发该药用植物具有重要意义，报道如下。
1 材料和试剂
尼泊尔菊三七新鲜野生植株，采集于云南腾冲，经沈阳药科大
学孙启时教授鉴定为尼泊尔菊三七。MS 培养基，6 －苄氨基嘌呤
( 6 － BA)，萘乙酸 ( NAA)，蔗糖，琼脂，酒精，升汞。
2 方法与结果
2．1 外植体的准备
将 3 ～ 6 个月尼泊尔菊三七的幼嫩茎段用洗洁精清洗干净后，
再用蒸馏水浸泡数小时，沥干水滴，备用。
2．2 外植体的灭菌与接种
将清洗好的尼泊尔菊三七茎段，放入烧杯中，用 75%的乙醇溶
液处理 10 ～ 40 s，用 0． 1%的升汞溶液浸泡 4 ～ 8 min，浸泡期间不
断摇动，使灭菌剂升汞和外植体充分接触，进行表面消毒，再用无
菌蒸馏水清洗 5 ～ 6 次，将经过消毒后的茎段切成 0． 5 ～ 1． 0 cm且
含有一个茎节的茎段，进行接种诱导正交试验，确定其最佳消毒时
间。以 75%乙醇 (因素 A)、0． 1%升
汞 (因素 B )消毒时间为考察因素，
诱导率和染菌率为指标进行正交试
验，因素水平表见表 1，试验结果见
表 2。可见，最佳搭配为 A2B3，即用
乙醇消毒 20 s和升汞消毒 6 min，诱
导率最高且染菌数目最少。
2．3 试管苗的增殖培养
采用MS培养基，其中含有 3%蔗糖、0． 5%琼脂，pH为 6． 0。培养温
度为(25 ±1)℃，光照时间为每天 12 h，光照强度为 1400μmol / (m2·s)。
设定好乙醇和升汞灭菌时间的同时，在 MS培养基上，分别添加不同
质量浓度的 NAA(0，0． 2，0． 5，1． 0 mg /L)和 6 － BA(1． 0，2． 0，3． 0，
4． 0 mg /L)。培养 45 d 后，进行幼芽增殖统计，计算芽诱导率(出芽
的外植体数 /接种的外植体数)，确定最佳外源激素配比。以 6 － BA
(因素 A)、NAA(因素 B)的质量浓度为考察指标，繁殖率为指标进
行正交试验，因素水平表见表 3，试验结果见表 4。在培养过程中，
尼泊尔菊三七的茎段诱导成苗需要较长的时间，一般 20 d 后肉眼
才能观察到其形态变化。最初生长的小芽为嫩黄白色，随着时间的
延长逐渐转变为黄绿色。经过 45 d 的继代培养，细胞分裂素 6 －
BA均能诱导含有腋芽的尼泊尔菊三七茎段产生腋芽苗。由表 4 可
知，各因素的最优水平为 A1 和 B3，即尼泊尔菊三七的继代培养基
添加剂素分别为 NAA 0． 5 mg /L和 6 － BA 1． 0 mg / L，该激素浓度下
水平
1
2
3
4
因素 A(s)
10
20
40
50
因素 B(min)
4
6
8
10
表 1 尼泊尔菊三七的
灭菌供试因素水平表
中国药业 China Pharmaceuticals ·21·
2011年第 20卷第 18期 药物研究
培养基
种类
MS
1 / 2 MS
1 / 4 MS
1 / 6 MS
接种数
(棵)
100
100
100
100
生根苗数
(棵)
80
85
42
40
生根率
(%)
80
85
42
40
生根总数
(条)
280
300
120
140
平均每株根数
(条)
3． 5
4． 6
2． 9
3． 5
平均根长
(cm)
0． 9
1． 1
0． 8
0． 9
表 5 无机元素浓度对尼泊尔菊三七生根的影响
活性炭
(g / L)
1． 0
2． 0
5． 0
接种数
(棵)
100
100
100
生根苗数
(棵)
56
87
67
生根率
(%)
56
87
67
生根总数
(条)
207
339
214
平均每株根数
(条)
3． 7
3． 9
3． 2
平均根长
(cm)
1． 9
1． 5
0． 8
表 6 活性炭浓度对尼泊尔菊三七生根的影响
移栽基质
腐殖土 ∶木炭土(3 ∶ 2)
蛭石
腐殖土
泥炭藓覆盖腐殖土
炼苗天数(d)
5
7
5
7
成活率(%)
92
80
82
78
幼苗长势
苗健壮，叶片深绿，植株较高
苗比较健壮，叶片偏黄
苗瘦弱，生长缓慢
苗矮小，成活率低
表 7 试管苗在不同移栽基质中的生长情况
的增殖倍数最大，达到 4． 8倍。
2．4 壮苗与生根培养
将 2． 5 ～ 3． 0 cm 高的试管小
苗接种于 1，1 /2，1 /4，1 /6 MS 4种
培养基并附加 6 － BA1． 0 mg /L、
NAA 0． 5 mg / L、30 g / L 蔗糖、
2 g / L活性炭进行生根培养，45 d
后观察生长情况，统计生根率并
确定无机元素最适合浓度。同时
考察添加不同浓度的活性炭(1，
2，5 g / L)对其壮苗和生根培养的
影响，培养 60 d，统计生根率并且
确定添加活性炭最佳浓度(生根
率 =接种后的生根苗数 /接种的
试管苗数)。结果见表 5 和表 6。
在植物离体快繁过程中，试管苗
生根培养是最重要的步骤，是进行移栽成苗的基础 [ 4 ]。通过调整基
本培养基中的无机元素成分和含量，可以解决植物繁殖困难、生根
率低的问题 [ 5 ]。由表 5 可知，1 /2MS 培养基中根最长，须根生长旺
盛，生根率最高，为 85%。活性炭的浓度在一定程度上会影响无菌
苗的生根情况 [ 5 ]。由表 6可知，活性炭质量浓度为 2． 0 g / L时，植株
的生理状态最佳，生根率最高，平均每株根数最多，主根比较长，须
根也生长旺盛。
2．5 炼苗与移栽
尼泊尔菊三七在壮苗与生根培养基上生长 45 d 后，苗高度达
到 10 cm 左右时，选取其中植株健壮、根系发达的组培苗，将敞开
的组培瓶置室温炼苗 5 ～ 7 d 后，除去根部的残留培养基并植于含
细砂的腐殖土中，保湿 10 ～ 15 d，直接移栽到不同组成的基质中考
察其在不同基质中的生长情况，待苗生长健壮后，移植于大地栽
培。结果见表 7。
3 讨论
以尼泊尔菊三七的茎段作为外植体，在以往文献报道的配方基
础上 [6 ]，改变消毒时间诱导得到无菌苗，最佳条件为乙醇消毒 20 s，
升汞消毒 6 min。消毒时间越长，消毒剂对外植体的影响越大，外植
体的染菌率虽能有所下降，但试管苗诱导率、长势与污染率成反比。
由外植体诱导的试管苗通过更换激素种类和浓度，运用 16种培养基
对腋芽试管苗进行增殖培养，其中 MS + NAA 0． 5 mg / L + 6 － BA
1． 0 mg / L + 30 g / L蔗糖 + 2 g / L活性炭最适合尼泊尔菊三七的试
管苗增殖培养。其中 6 － BA的质量浓度不宜过高，否则会刺激外植
体的多酚氧化酶活性，加之试管苗在瓶中生长，容易产生乙烯，使
得试管苗褐变现象加深，而且容易出现玻璃化现象 [ 7 ]，其茎不易生
根且繁殖系数下降。含有不同浓度无机元素的培养基和不同浓度
活性炭对生根的试验表明，1 / 2 MS 是最适宜的生根基本培养基，
当活性炭质量浓度为 2 g / L 时，尼泊尔菊三七生根速度最快 [ 8 ]。添
加活性炭浓度过高时，培养基中的成分被其吸附，使苗的生长发育
受阻; 浓度适当，可以使培养基环境变黑，有利于试管苗的生根和
阻止在生长过程中释放酚类物质，促进生长。关于尼泊尔菊三七的
研究还比较少，本试验结果为保护该物种及今后更全面的研究与
开发奠定了基础。
表 3 尼泊尔菊三七丛生芽
诱导供试因素水平表
水平
1
2
3
4
因素 A(mg / L )
1． 0
2． 0
3． 0
4． 0
因素 B(mg / L )
0
0． 2
0． 5
1． 0
表 4 尼泊尔菊三七的增殖培养
基正交试验表 L16(45)
水平
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
Mean1
Mean2
Mean3
Mean4
Range
因素 A
6 － BA
1
1
1
1
2
2
2
2
3
3
3
3
4
4
4
4
4． 075
3． 775
3． 775
3． 675
0． 400
因素 B
NAA
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
3． 625
4． 000
3． 975
3． 700
0． 375
繁殖率
(% )
3． 4
4． 0
4． 8
3． 9
3． 6
3． 7
3． 9
4． 1
3． 6
4． 1
3． 8
3． 6
4． 0
4． 2
3． 4
3． 2
染
菌
率
诱
导
率
表 2 尼泊尔菊三七的灭菌正交试验表 L16(45)
编号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
Mean1
Mean2
Mean3
Mean4
Range
Mean1
Mean2
Mean3
Mean4
Range
因素 A(s)
1
1
1
1
2
2
2
2
3
3
3
3
4
4
4
4
50． 000
59． 500
64． 250
49． 750
14． 500
45． 250
37． 500
38． 000
25． 250
20． 000
因素 B(min)
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
48． 500
56． 500
57． 500
61． 000
12． 500
58． 250
33． 250
30． 250
24． 250
34． 000
诱导率(%)
40
50
50
60
45
55
70
68
55
67
67
68
54
54
43
48
染菌率(%)
74
55
30
22
78
20
20
32
51
39
41
21
30
19
30
22
中国药业 China Pharmaceuticals·22·
2011年第 20卷第 18期
国槐槐枝及槐叶中芦丁含量比较
熊维政 1，2，金燕飞 1，2，姜家书 1，石 磊 1，张春霞 1
(1． 河南羚锐制药股份有限公司，河南 信阳 465550; 2． 河南中医学院，河南 郑州 450008)
摘要:目的 为获得优质药材，充分利用槐枝和槐叶，扩大芦丁资源提供参考依据。方法 按照 2010 年版《中国药典(一部)》槐花项下含量测
定方法，测定槐枝不同部位及槐叶中芦丁的含量。结果 不同生长年限的槐枝，嫩枝中芦丁含量最高;槐枝的不同部位中，枝皮的含量最高，
木质部中也含有芦丁;不同植株槐叶中芦丁含量不同。结论 该研究揭示了不同生长年限槐枝、槐枝不同部位以及槐叶中芦丁含量的差异，
为获得优质药材和芦丁的开发提供了参考依据。
关键词:高效液相色谱法;槐枝;槐叶;芦丁
中图分类号:R284． 1;R282． 71 文献标识码:A 文章编号:1006 － 4931 (2011 )18 － 0022 － 02
Comparative Study on Rutin Content in Branches and Leaves of Sophora Japonica L．
Xiong Weizheng1， 2， Jin Yanfei1， 2， Jiang Jiashu1， Shi Lei1， Zhang Chunxia1
( 1． Henan Lingrui Pharmaceutical Co．，Ltd．，Xinxian， Henan， China 465550;
2． Henan University of Traditional Chinese Medicine， Zhengzhou， Henan， China 450008 )
Abstract:Objective To provide the theoretic reference for obtaining high quality medical materials，making full use of Sophora japonica
L． branches and leaves and expanding the resources of rutin． Methods According to the Chinese Pharmacopeia ( edition 2010，VolⅠ) ，the
rutin content in different parts of Sophora japonica L． branches and leaves was determined． Results Among the branches with different
growth years，the rutin content was the highest in young branches． Among the different parts of branches，the rutin content was the highest
in skin of branch． Xylem also contained rutin． The leaves in different plants had different contents of rutin． Conclusion The result revealed
the diversity of the rutin content in different growth years of branches，different parts of branches and leaves，which provides the reference
basis for choosing the best medicinal materials and developing rutin．
Key words:HPLC; sophora japonica L． branch; sophora japonica L． leave; rutin
檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨檨
槐枝为豆科植物中槐 Sophora japonica L． 的干燥嫩枝，其叶
为槐叶。槐枝最早收载于《名医别录》，槐叶最早收载于《食疗本
草》，二者在《本草纲目》等一些本草文献中均有论述 [ 1 ]。近年来民
间用槐枝治疗烧伤有较好的疗效，也是治疗烧伤药紫槐烧伤膏的
主要药物组成之一; 适量地食用槐叶及其制剂，对人体保健能起
到积极的作用 [ 2 ]。槐枝、槐叶均含有较多的黄酮类化合物，其中以
芦丁为主 [ 3 － 4 ]。芦丁又名芸香苷，有镇痛作用 [ 5 ]，还具有抗癌、抗感
染、抗过敏、抗菌、抗病毒、抗糖尿病、抗骨质疏松、抗血栓、抗辐射、
抑制增生、保护肝脏和心血管等多种生理活性，因而在药品及食品
的开发应用中越来越受到关注。为获得优质药材，更好地开发和利
用芦丁资源，笔者对槐枝、槐叶中的芦丁含量进行了考察，现报道
如下。
1 仪器和材料
岛津 LC － 2010AHT 型高效液相色谱系统，包括四元泵、在线
真空脱气机、自动进样器柱温箱、LC － Solution 色谱工作站 (日本
Shimadzu 公司);KQ － 250DE 型数控超声波清洗器 (昆山市超声仪
器有限公司 )。芦丁对照品 (中国药品生物制品检定所，供含量测定
用，批号为 100080 － 200707 );甲醇为色谱纯(天津市四友精细化学
品有限公司)，冰醋酸为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)，水
为娃哈哈纯净水。槐枝为采集在同一植株、同为春季、不同生长年
限的枝条，同一植株、嫩枝的枝条木质部，同为春季、不同植株的嫩
枝;槐叶，采集时间为槐叶中芦丁含量高的五月[2 ]。将所采集的槐枝
(切段)、槐叶低温干燥，粉碎，过三号筛备用。采集地点为河南省信
阳市新县城郊，原植物经河南省信阳市药品检验所潘永峰教授鉴
定均为豆科植物中槐 Sophora japonica L．。
2 方法与结果
2．1 色谱条件 [ 6 ]与系统适用性试验
色谱柱:Agilent C18 柱 ( 250 mm × 4． 6 mm，5 μm ); 流动相: 甲
醇 － 1%冰醋酸 ( 32 ∶ 68 );检测波长:257 nm;流速:1． 0 mL /min;柱
温:35 ℃;进样量:10 μL。在此条件下，色谱图见图 1。
作者简介:高倩，女，硕士研究生，主要研究方向为濒危和道地
药材的培育与分子生物学研究，(电话)024 － 23986501(电子信箱)
a072885@ 126． com; 贾景明，男，博士研究生，教授，博士研究生导
师，主要研究方向为濒危和道地药材的培育与分子生物学研究，本
文通讯作者，(电话)024 － 23986501(电子信箱)jmingjia@ sina． com。
参考文献:
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1 322 － 1 325．
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社，1988，77 (1 ):314．
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(收稿日期:2011 － 04 － 22 )
药物研究