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平卧菊三七快繁体系优化研究



全 文 :第33卷 第2期 农 业 科 学 研 究 2012年6月
Vol.33No.2 Journal of Agricultural Sciences  June 2012
文章编号:1673-0747(2012)02-0069-04
平卧菊三七快繁体系优化研究
石泰雷,赵冬冬,禹波宁,翟 静,韩玉玉,刘 萍
(宁夏大学 农学院,宁夏 银川 750021)
摘 要:本研究在已有分化培养基和生根培养基的基础上,用市售普通白糖替代分析纯蔗糖,并去除部分有机成
份,对平卧菊三七的快繁体系进行优化.结果表明:在平卧菊三七的快繁过程中,普通白糖可以替代分析纯蔗糖,且
以25g·L-1的白糖增殖系数最高,分化苗健壮、根系发达;有机成份中的肌醇和VB1 对不定芽的分化不可缺少;试
管苗无须经过炼苗即可移栽.优化后的快繁体系比原体系可节省成本84%,有助于工厂化生产成本的降低.
关键词:平卧菊三七;离体快繁;不定芽;经济效益
中图分类号:S665.1    文献标志码:A
收稿日期:2012-04-10
基金项目:2011年宁夏大学大学生创新研究项目(11NXN50)
作者简介:石泰雷(1986—),男,宁夏中卫人,本科生,主要从事农学方面的研究.
通信作者:刘萍(1961—),女,教授,从事植物遗传及种质资源研究.Email:liupingmy@yahoo.com.cn
   平卧菊三七 (Gynura procumbens (Lour.)
Merr.),又名蔓三七草,菊科菊三七属多年生草本
植物[1],含有生物碱、香豆素类、黄酮类、苯并呋喃、
多糖、有机酸等多种活性成分,具有良好的镇痛、止
血、抗疟、抗炎、降血糖、抗肿瘤等药理活性[2-3].近
些年对该植物在糖尿病方面的治疗研究较多,是一
种能改善和调节血糖水平的中草药,有人起名为平
糖菊[4-5].菊三七属植物主要采用扦插方法进行繁
殖[6-7],由于扦插易受季节和外界环境条件的影响,
难于越夏和越冬,因而无法满足需要.近些年对菊三
七属植物的组织培养研究也有一些报道[8-13],本研
究是在宁夏大学遗传育种实验室建立的平卧菊三七
快繁体系的基础上以其不定芽为外植体进行再生培
养,探讨用普通白糖替换分析纯蔗糖、不同白糖质量
浓度以及去除部分有机成份对试管苗分化和生根的
影响,对已有的快繁体系进行优化,旨在降低快繁成
本,为平卧菊三七的工厂化无性繁殖提供新途径,为
糖尿病患者提供充足而廉价的药物.
1 材料与方法
1.1 材料
  供试外植体引自浙江某药材市场,种植于宁夏
大学农学院遗传育种实验室,经宁夏大学李小伟博
士鉴定为平卧菊三七,以其幼嫩茎段作为试验材料.
1.2 方法
1.2.1 无菌苗的获得 采集幼嫩茎段,在自来水中
刷去表面浮灰,在洗衣粉液中刷洗后浸泡 5~
15min,流水冲洗30min左右,于超净工作台上用
体积分数为75%的乙醇消毒15~20s,无菌水冲洗
3次后,质量分数0.1%的升汞灭菌8~10min,再
用无菌水冲洗7~8次,置于灭菌的滤纸上吸干材料
表面的水分,选择不变色、无褐化的茎段横切成
1.0cm左右的带芽小段,接种到 MS基本培养基中,
20d左右获得无菌幼芽,供分化培养用.
1.2.2 分化培养 切下新萌发的腋芽接种到分化
培养基上.分化培养基根据研究方案设计如下:
  (1)MS+0.8mg·L-1 6-BA+0.05mg·L-1
NAA+10~30g·L-1普通白糖+7g·L-1琼脂,
pH值为5.8.
  ⑵ 在⑴的培养基中分别去除有机成份中的肌
醇、烟酸、VB1、VB6 和甘氨酸,pH值为5.8;每处理
接种20~40个外植体,3次重复,30d后统计分化
苗数,计算增殖系数,并记录生长状况.
1.2.3 生根培养 当不定芽长至1.5~2.5cm时,
选择健壮的不定芽转至生根培养基中进行生根培
养,生根培养基设计如下:1/2MS+0.05mg·L-1
NAA+0~25g·L-1普通白糖+7g·L-1琼脂,pH
值为5.8,每处理20个外植体,重复4次,14d后统
计生根率,并测定每苗的根数和根长.
1.2.4 驯化移栽 当苗高4~5cm、根长3~5cm
时即可进行移栽.根据研究方案设计了试管苗炼苗
后移栽和试管苗直接移栽.炼苗后移栽的具体操作
为敞开培养瓶封口膜,实验室中放置5~7d,用镊子
取出小苗,小心洗净附着在根上的培养基,移栽到装
有沙土(沙子∶黄土=5∶1)的花盆中,盆上覆盖塑料
薄膜,1周后逐渐揭去薄膜,定期肥水管理,30d后
统计成活率.
1.2.5 培养条件 培养温度(23±2)℃,光强
2 000Lx,光照10h,黑暗14h.
1.2.6 相关指标的计算方法
  增殖系数 =(分化后芽总数-接种芽数)/接种
芽数;
  生根率 =(生根苗数/接种苗数)×100%;
  移栽成活率 =(成活的植株数/移栽植株
数)×100%.
2 结果与分析
2.1 普通白糖替换分析纯蔗糖和不同白糖质量浓
度对平卧菊三七不定芽分化的影响
    培 养 基 MS+0.8 mg· L-1 6-BA +
0.05mg·L-1 NAA+30g·L-1蔗糖+7g·L-1
琼脂,是作者所在实验室筛选到的增殖系数较高的
平卧菊三七分化培养基,本研究在该培养基的基础
上,用普通白糖替换分析纯蔗糖,并设置30、25、20、
15、10g·L-1 5个白糖梯度,结果见表1.对表1结
果进行方差分析显示,分析纯蔗糖和5个不同质量
浓度普通白糖间分化苗的增殖系数差异不显著.分
化苗在25g·L-1的白糖中长势旺盛,植株体鲜绿,
每苗分化数可达到5.40;在10g·L-1的白糖中,苗
虽能分化,但长势较弱,且矮小,多数植株表现黄化.
表1 不同糖质量浓度对平卧菊三七不定芽分化影响
序号
糖质量浓度/
(g·L-1)
基本苗数/个
Ⅰ Ⅱ Ⅲ
分化总苗数/个
Ⅰ Ⅱ Ⅲ
每苗增殖系数
Ⅰ Ⅱ Ⅲ
平均
增殖系数
⑴ 30(蔗糖) 32  32  32  186  163  172  4.81 4.09 4.38  4.43
⑵ 30(白糖) 28  16  20  126  99  114  3.50 5.19 4.70  4.46
⑶ 25(白糖) 20  24  20  117  162  132  4.85 5.75 5.60  5.40
⑷ 20(白糖) 32  40  20  155  175  75  3.85 3.38 2.75  3.32
⑸ 15(白糖) 32  40  20  188  236  88  4.88 4.90 3.40  4.39
⑹ 10(白糖) 28  40  20  216  143  67  6.70 2.58 2.35  3.88
2.2 MS培养基中有机成份对平卧菊三七不定芽
分化的影响
  以表1中⑶号糖质量浓度为对照(CK),在该培
养基基础上,分别去除有机成份中的肌醇、烟酸、
VB6、VB1 和甘氨酸后进行分化培养,结果见表2.由
表2可知,当分别去除上述有机成份后每苗平均增殖
系数均有所下降,依次为2.79、4.93、3.12、2.65和
3.45.对表2结果中去除的各项成份分别与CK进行
t测验表明,去除肌醇和去除VB1 后其各自的增殖系
数与CK间差异均达到了极显著水平,但去除烟酸、
VB6 和甘氨酸后各自的增殖系数与CK间差异均不
显著,可见,肌醇和VB1 在平卧菊三七不定芽的分化
和生长过程中是不可缺少的;烟酸对平卧菊三七不定
芽的分化和生长影响不大,在分化培养基中可以去
除;而VB6 和甘氨酸,虽然对苗的分化影响不大,但
研究显示适量的添加,可以使苗的生长更加旺盛.
表2 去除部分有机成份后平卧菊三七不定芽的分化
去除的
有机成份
基本苗数/个
Ⅰ Ⅱ Ⅲ
分化总苗数/个
Ⅰ Ⅱ Ⅲ
每苗增殖系数
Ⅰ Ⅱ Ⅲ
平均
增殖系数
CK  20  24  20  117  162  132  4.85 5.75 5.60  5.40
肌醇 40  28  20  152  96  83  2.80 2.43 3.15  2.79**
烟酸 40  24  20  229  174  96  4.73 6.25 3.80  4.93
VB6 40  28  20  211  68  93  4.28 1.43 3.65  3.12
VB1 40  32  20  125  153  61  2.13 3.78 2.05  2.65**
甘氨酸 40  32  20  121  226  64  2.03 6.06 2.25  3.45
  注:**表示差异极显著(P≤0.01).
07 农 业 科 学 研 究               第33卷 
2.3 不同白糖质量浓度对平卧菊三七分化苗诱根
的影响
  在1/2MS+0.05mg·L-1 NAA+25g·L-1
蔗糖+7g·L-1琼脂的生根培养基基础上,用普通
白糖替代分析纯蔗糖,设置普通白糖质量浓度分别
为25、15和0g·L-1 3个梯度,研究对分化苗诱根
的影响(表3).表3结果显示:普通白糖替代分析纯
蔗糖后,随着糖质量浓度的降低,每苗根数下降;当
培养基中不添加糖时,生根率只有11.30%,有根的
苗中平均每苗仅有1条根,平均根长1.77cm.观察发
现幼苗在25g·L-1的白糖中要比在15g·L-1的白
糖中根多、粗而健壮;15g·L-1白糖中分化苗的根普
遍较长,但细而瘦弱.对表3平均根数和根长分别进
行方差分析,表明3种白糖质量浓度对分化苗生根数
达到极显著差异,对根长的影响也达到显著差异,可
见在分化苗的生根过程中,适量的糖是必需的.
表3 不同糖质量浓度对平卧菊三七分化苗诱根的影响
糖质量浓度/
(g·L-1)
根数/(条·苗-1)
Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ
平均根数/
(条·苗-1)
根长/cm
Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ
平均根长/
cm
25  7.75  13.35  4.25  9.75  8.81A  9.13  2.78  4.73  6.35  5.75a
15  3.25  4.25  4.25  5.25  4.25A  6.53  7.45  5.18  9.58  7.18a
0  0.00  2.00  0.00  2.00  1.00B  0.00  3.48  0.00  3.60  1.77b
  注:大写字母表示差异极显著(P≤0.01);小写字母表示差异显著(P≤0.05).
2.4 试管苗的移栽
  按照实验设计,对试管苗直接移栽和炼苗移栽,
移栽56d后,统计其成活率(表4).试管苗直接移栽
和经炼苗后移栽的平均成活率均在90%以上,由此
可见平卧菊三七的生长适应性极强,试管苗无需经
过专门的炼苗过程,即可移栽.
表4 平卧菊三七组培苗的移栽统计
移栽苗数/株 成活数/株 成活率/% 生长状况
直接移栽 37  34  92 生长健壮,长势良好
炼苗后移栽 54  52  96 生长茂盛,叶色嫩绿
2.5 经济效益分析
  以生工生物工程(上海)有限公司对各试剂的报
价,配制表 1 中 ⑴ 号培养基 10L 其成本价是
12.62元(本成本价的计算只包括分析纯蔗糖、普通
白糖和烟酸),而配制表1中⑶号培养基(去掉其中
的烟酸)10L其成本价是2.02元.可见,在分化和
生根培养基中用25g·L-1的普通白糖并去除烟酸
将比原培养基节约成本84%,在工厂化生产中能够
大幅度降低生产成本.
3 讨论
  1)在进行组织培养的研究中,习惯上都选用分
析纯蔗糖作为碳源,然而,分析纯蔗糖的价格要比普
通白糖的价格贵5倍以上.研究表明,用合适质量浓
度的普通白糖替代分析纯蔗糖对平卧菊三七不定芽
的分化没有影响,在工厂化生产中,完全可以采用该
方案.
  2)MS培养基中的有机成份对于绝大多数植物
生长来说都是必不可少的.就平卧菊三七而言,有机
成份的足够与否直接影响其分化率.本研究表明,去
除培养基中的肌醇和 VB1,平卧菊三七不定芽的分
化率显著降低,推测幼苗自身合成这2种维生素的
能力较差,需要由外界环境提供才能保证其不定芽
正常的分化;幼苗自身合成的烟酸足以使平卧菊三
七不定芽分化正常,因此在分化培养中完全可以去
除该有机成份;而VB6 和甘氨酸对平卧菊三七不定
芽的分化虽然影响不大,但适量的添加可使不定芽
的生长更加旺盛,且分化率有所提高.
  3)不同质量浓度白糖对分化苗生根影响显著,
在含25g·L-1白糖的生根培养基上,分化苗健壮,
根系发达,有利于移栽成活;而在不加糖的生根培养
基中,分化苗根短而少.考虑到移栽成活率、经济效
益等因素,生根培养基可选择25g·L-1的白糖作
为碳源.
参考文献:
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In Vitro rapid propagation system optimization
for Gynura procumbens
Shi Tailei,Zhao Dongdong,Yu Boning,Zhai Jing,Han Yuyu,Liu Ping
(School of Agronomy,Ningxia University,Yinchuan 750021,China)
Abstract:In vitro rapid propagation system for gynura procumbens(Lour.)Merr.was optimized based on
the initial differentiation medium and rooting medium.The commercial white sugar was adopted instead of
analyticaly pure sucrose and some organic components were removed from the differentiation medium.
The results showed that the commercial white sugar could replace the analyticaly pure sucrose in vitro
culture in gynura procumbens.The maximum propagation coefficient was observed in the differentiation
medium with 2.5% commercial white sugar,in which the plantlets showed stronger sprout and root
system.The inositol and vitamin B1were proved to be necessary for adventitious bud differentiation.The
plantlet can grow better in flowerpots without the process of hardening-seedling.The optimized in vitro
rapid propagation system can save about 84%of total cost compare with the initial medium system.
Key words:Gynura procumbens (Lour.) Merr.;in vitro rapid propagation;adventitious bud;
economic benefit
(责任编辑、校对 郑国琴)
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