全 文 ：第 33卷第 6期
20 1 0年1 1月
河 北 农 业 大 学 学 报
JOURNA L OF AGRICULT URAL UNIVERS IT Y OF HEBEI
　 　 Vol.33 No.6
Nov .2 0 1 0
文章编号:1000-1573(2010)06-0115-04
猪笼草高效再生体系的建立
郑文永 , 　张　洁 , 　杨　权 , 　赵少荣 , 　王　阳 , 　王冬梅
＊
(河北农业大学 生命科学学院 , 河北 保定 071001)
摘要:以猪笼草(Nepenthes mirabilis)腋芽为试材 ,研究不同浓度无机盐离子 、蔗糖以及 BA 和 NAA 对猪笼草
不定芽增殖和生根的影响。结果表明:最佳增殖培养基为 1/ 2M S 基础培养基附加 30 g/ L 蔗糖 、2.0 mg/ L BA
和 0.2 mg/ L NAA;生根培养基以 1/4MS 基础培养基附加 0.3 g/ L 活性炭 、15 g/ L蔗糖 、1.5 mg/ L IBA 和 0.5
mg/ L NAA 为最佳 , 猪笼草生根效果最好 ,生根率达到 92%。
关　键　词:猪笼草;离体快繁;增殖;生根
中图分类号:S 682.36 文献标志码:A
Establishment of effective regeneration system of Nepenthes mirabi lis
ZHENGWen-yong , ZHANG Jie , YANGQuan , ZHAO Shao-rong ,
WANG Yang , WANG Dong-mei
(Co llege o f Life Science , Agricultur al Unive rsity of H ebei , Baoding 071001 , China)
Abstract:The axillary buds of Nepenthes mirabil is were used as specimens.The ef fect of dif-
ferent concentration ino rganic salt , sucrose , BA , IBA and NAA for tissue culture and rapid
propagation w ere studied.The results show ed tha t the 1/2MS medium with sucrose 30 g/L ,
BA 2.0 mg/ L and NAA 0.2 mg/ L w as the best fo r mul tiplication culture.The 1/4MS medi-
um w ith sucro se 15 g/ L , IBA 1.5 mg / L and NAA 0.5 mg/L w as the best t reatment fo r indu-
cing roots f rom shoo ts , and the ro otag e ratio w as 92%.
Key words:Nepenthes m irabi li s;t issue culture;multiplication;ro ot
　　猪笼草(Nepenthes mirabi lis)是猪笼草科猪笼
草属草本或半木质藤本植物 ,又名担水桶 、猪仔笼
等 ,其美丽的瓶状叶特别诱人 ,是目前食虫植物中最
受人们青睐的种类之一。猪笼草原产东南亚和澳大
利亚的热带地区 ,虽然在广东省南部和海南省等地
区也有野生品种分布 ,但很少应用[ 1] 。猪笼草主要
有 4大功效:一是观赏作用 ,它既可观花 ,又可观叶 ,
通常是将它奇特的捕虫器视为异花奇果来观赏;二
是生态灭虫 ,猪笼草具有奇特的食虫习性;三是药用
健体作用 ,猪笼草性味甘凉 ,可清热止咳 、利尿 ,主治
急慢性肝炎 ,叶片可制作凉茶 ,能避暑消热;四是科
普用材 ,猪笼草的捕虫器是学生极感兴趣的试验材
料 。因此它在历届花博会上都独占鳌头 ,市场上盆
栽开发产品一直供不应求[ 1-4] 。
猪笼草的繁殖主要采用扦插和压条 ,但由于繁
殖速度慢 ,远不能满足人们的需要。通过组织培养
技术 ,可使其快速大量繁殖 。目前 ,关于猪笼草组培
快繁方面的报道还不多 ,但均存在繁殖系数较低 ,玻
＊收稿日期:2010-07-16
基金项目:河北农业大学大学生科技创新活动基金(2010SM03).
作者简介:郑文永(1984-),男 , 河北省任丘市人 , 在读硕士生 ,从事植物抗逆细胞分子生物学研究.
通讯作者:王冬梅(1963-),女 , 河北省景县人 , 博士 ,教授 , 博士生导师 ,从事植物细胞分子生物学研究.
E-mail:dongmeiwang63 @ho tmail.com
　　　　　 河 北 农 业 大 学 学 报 第 33卷
璃化现象严重等问题[ 5] 。本试验利用正交分析对影
响猪笼草试管苗增殖的因素进行了探讨 ,对影响其
生根的条件进行了研究 ,初步建立了猪笼草高效再
生体系 ,为实现猪笼草试管苗的工厂化大规模生产
奠定了基础。
1　材料与方法
1.1　材料
猪笼草母株从市场购买 ,外植体为腋芽。
1.2　方法
1.2.1　外植体消毒　取猪笼草植株的腋芽 ,用自来
水洗净叶片着生处泥沙 ,再用流水冲洗 2 h ,然后在
超净工作台上以 75%的酒精浸润 30 s ,无菌水冲洗
1次 ,再用 0.15%的升汞消毒 3 ～ 5 m in ,添加吐温
2 ～ 3滴 ,无菌水冲洗 4 ～ 5次。
1.2.2　增殖培养　用镊子取出消毒后的腋芽置于
灭过菌的滤纸上 ,将材料表面的水分吸干 ,接种到增
殖培养基上进行培养 。培养基配方参照谢怡青等
人[ 6] 的方法 ,培养室温度设置在 25 ℃,光照 16 h/d ,
光照强度为 3 000 lx 。
当外植体增殖到一定数量后 ,以 MS 培养基为
基础培养基 ,对无机盐浓度 、蔗糖浓度 、NAA 浓度
和 6-BA 浓度等 4种因素做 L 9(34)正交设计 ,进行
4因素 3水平的正交试验(见表 1),探讨这 4种因素
对猪笼草增殖的影响。每个处理做 3次重复 ,每次
接种芽数均大于 30 ,最后计算平均值。
表 1　不同处理的增殖培养基配方(pH 5.8)
Table 1　Enrichment culture media of different treament(pH 5.8)
处理编号
I tem
无机盐浓度
Concentration of
ino rg anic salt
蔗糖/
(g · L-1)
Sugar
BA 浓度/
(mg · L-1)
Concentra tion of BA
NAA 浓度/
(mg · L-1)
Concentra tion of NAA
芽增殖倍数
Multiplica tion
of the buds
1 1/ 2 MS 10 0.50 0.05 3.40 3.80 4.20
2 1/ 2 MS 20 1.00 0.10 5.00 5.10 4.50
3 1/ 2 MS 30 2.00 0.20 5.05 5.60 4.20
4 1/ 4 MS 10 1.00 0.20 4.39 3.98 4.01
5 1/ 4 MS 20 2.00 0.05 4.42 4.12 4.67
6 1/ 4 MS 30 0.50 0.10 5.01 4.86 4.90
7 1/ 8 MS 10 2.00 0.10 3.80 4.01 4.12
8 1/ 8 MS 20 0.50 0.20 4.43 4.31 3.96
9 1/ 8 MS 30 1.00 0.05 3.76 3.87 3.59
1.2.3　生根培养　选取 3 cm 以上芽苗转入生根培
养基诱导生根 ,生根培养基以 1/4MS 基本培养基附
加 0.3 g/L 活性炭并添加不同浓度蔗糖 、IBA 及
NAA(见表 2)。接种 30 d后进行观察 ,确定最适的
生根条件 。
表 2　不同处理的生根培养基配方(pH 5.8)
Table 2　Rooting culture media of
　　dif ferent treament(pH 5.8)
处理编号
I tem
蔗糖浓度/
(g · L-1)
Concent ration
of sugar
IBA 浓度/
(mg · L-1)
Concentra tion
of IBA
NAA 浓度/
(mg · L-1)
Concentra tion
o f NAA
1 10 1.0 1.5
2 15 1.5 0.5
3 20 0.5 1.0
1.2.4　炼苗移栽　待不定根长至 1.5 cm 左右 ,将
其移入温室 ,去除封口膜 , 保持温室温度在 20 ～
30 ℃之间 ,湿度在 70%～ 85%。放置 2 ～ 3 d 使其
适应温室环境 ,然后取出小苗将根部的培养基洗干
净 ,以免琼脂发霉引起烂根 ,种植到纯蛭石作为基质
的培养钵中 ,期间浇 Hoagland营养液 ,待叶片转绿
并且长出新叶后移栽到以培养土(蛭石∶园土=1∶
1)作为基质的花盆中进行培养。
2　结果与分析
2.1　增殖培养
将消过毒的腋芽接到增殖培养基上 ,每 45 d左
右继代一次 ,当芽增殖到一定数量后进行芽增殖的
正交试验 , 45 d 后统计芽的增殖倍数 ,生长状况见
图 1-A 。采用 DPS软件对数据进行极差分析 、方差
分析以及各个处理间差异显著性的 SSR检验。极
差分析表明(见表 3),芽的增殖主要受 NAA 的影
响 ,各因子对芽增殖的影响作用从大到小依次为
NAA>蔗糖>无机盐离子>6-BA;方差分析结果表
明(见表 4),各因子间差异均显著 ,且除 6-BA 外均
达到极显著。对各因子间进行 Duncan多重比较 ,
结果表明(表 5), 1/8M S与1/2MS 和1/4M S间差异
极显著 ,而 1/2MS 与 1/4MS 间无显著差异;蔗糖
10 g/L 与蔗糖 20 g/L 和蔗糖 30 g/ L 间差异极显
116
　第 6期　　　 郑文永等:猪笼草高效再生体系的建立
著 ,蔗糖20 g/L 和蔗糖30 g/ L 间无显著差异;6-BA
各浓度间无显著差异;NAA 0.1 mg/L 与 NAA
0.05 mg/ L间差异极显著 ,而与 NAA 0.2 mg/ L 间
无显著差异 , NAA 0.05 mg/ L 与 NAA 0.2 mg/ L
间差异显著。综合以上因素 ,并对各处理组合间进
行 Duncan多重比较 ,分析结果表明 ,较高浓度的无
机盐离子浓度(1/2M S)有利于猪笼草芽的增殖;较
低浓度的蔗糖(10 g/ L)以及较低浓度的 NAA(0.05
mg/L)均不利于芽的增殖;较高的无机盐离子浓度
(1/2MS)、蔗糖浓度(20 ～ 30 g/ L)、6-BA 浓度(1.0
～ 2.0 mg/L)以及 NAA 浓度(0.10 ～ 0.20 mg/L)
组合培养基有利于不定芽的增殖(增殖率最高达
4.95)。
表 3　芽增殖倍数的极差分析
Table 3　Range analysis of multiplication of the buds
K 值 无机盐离子
Inor ganic salt
蔗糖
Suga r
6-BA NAA
K1 4.538 89 3.967 78 4.318 89 3.981 11
K2 4.484 44 4.501 11 4.244 44 4.588 89
K3 3.983 33 4.537 78 4.443 33 4.436 67
极差 R 0.555 6 0.570 0 0.198 9 0.607 8
主次顺序 NAA>蔗糖>无机盐离子>6-BA
表 4　芽增殖倍数的方差分析
Table 4　Analysis of variance of multiplication of the buds
变因(V.F.)
Vara tional
facto rs
df SS MS
F 值
Value of F
区组 0.134 60 2 0.067 30
无机盐离子 1.688 20 2 0.844 08 7.232 89＊＊
蔗糖 1.832 10 2 0.916 03 7.849 47＊＊
6-BA 0.181 80 2 0.090 88 0.778 73 ＊
NAA 1.800 30 2 0.900 14 7.713 32＊＊
误差 1.867 20 16 0.116 70
总和 7.504 07
表 5　各个处理间差异显著性 SSR检验
Table 5　Significance of difference SSR
　　　analysis of various treatments
处理编号
Item
均值
Average
5%显著水平
5% significance
level
1%极显著水平
1% ex treme
significance lev el
3 4.950 00 a A
6 4.923 33 a A
2 4.866 67 a A
5 4.403 33 ab AB
8 4.233 33 bc AB
4 4.126 67 bc AB
7 3.976 67 bc B
1 3.800 00 bc B
9 3.740 00 c B
2.2　生根培养
将增殖培养的丛生芽(图 1-A),切除底部褐化
部分并分成单个芽接种到生根培养基中 ,培养 30 d
后统计生根情况(见表 6 ,图 1-B)。由表 6可见 ,以
生根培养基为 1/4MS 基础培养基附加 0.3 g/ L 活
性炭 、15 g/L 蔗糖 、1.5 mg/L IBA 及 0.5 mg/L
NAA 条件下 ,猪笼草生根率最高 ,达到 92%。
表 6　不同处理生根统计结果
Table 6　Rooting results of dif ferent treament
处理编号
Item
接种数/株
ninnoculation
number
生根株数/株
Roo ting numbe r
生根率/ %
Roo ting ra tio
1 83 69 83
2 79 73 92
3 92 72 78
　　注:生根率=生根株数/接种株数.
2.3　炼苗移栽
生根后的试管苗经过温室炼苗后种植到以蛭石
为基质的培养钵中 , 约 10 d 左右小苗叶片转绿 ,
25 d左右长出新叶并开始形成笼子(见图 1-C),30 d
左右移栽到含有培养土的花盆中(见图 1-D)。移栽
成活率均达 95%以上(图 2)。
A:在增殖培养基中的猪笼草幼苗;B:诱导生根的猪笼草;C:猪笼草
幼苗在温室中炼苗;D:移栽成活的猪笼草
图 1　猪笼草各时期生长状况
Fig.1　The growth in different stage of Nepenthes mirabilis
图 2　生根培养基中长出大量笼子的猪笼草
Fig.2　Nepenthes mirabilis with large cages in root medium
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　　　　　 河 北 农 业 大 学 学 报 第 33卷
3　讨论
在植物的组织培养中 ,调节培养基的无机盐离
子 、蔗糖 、外源植物激素浓度将直接影响其不定芽的
增殖和分化以及幼苗的生根[ 6-7] 。本试验首次采用
正交试验设计 ,综合分析了无机盐离子 、蔗糖 、外源
植物激素等对猪笼草增殖分化的影响。猪笼草的增
殖培养基以 1/2MS 、20 g/L 蔗糖 、1.0 mg/L BA 和
0.1 mg/L NAA 为最佳 ,增殖率达 4.95倍 ,高于丰
锋等人[ 3] 报道的 3.86 倍 ,谢怡青等[ 8] 的 2.8 ～ 4.1
倍 ,且本试验培养基中未添加天然有机物如椰汁等 ,
故培养基成分明确 ,重复性好 ,便于分析 。本试验对
生根培养基的分析表明 ,以 1/4M S基础培养基附加
0.3 g/ L 活性炭 、15 g/L 蔗糖 、0.5 mg/L NAA 、
1.5 mg/L IBA 为最佳生根培养基 ,猪笼草在该培
养基上的生根率最高 ,达到了 92%,与前人报道的
生根率 80%～ 95%基本一致[ 8-10] 。
生根试验中还发现 ,处理 3即 1/4MS 基础培养
基附加 0.3 g/ L 活性炭 、20 g/ L 蔗糖 、0.5 mg/ L
NAA 、1.0 mg/L IBA 的生根培养基中所有植株均
在培养瓶中形成了大量的笼子 ,基本上每个叶子上
都结出一个笼子 。尽管处理 3的生根率(78%)较其
他 2种处理略低 ,但与他人报道的通过组织培养育
出的猪笼草小苗 ,要等移到大田后叶尖才会长出小
叶笼[ 4] 的结果相比 ,可以大大缩短移栽后猪笼草结
笼子的时间。并且处理 3的移栽成活率也能够达到
95%左右 ,与他人报道的移栽成活率基本一致[ 10] ,
且移栽后只要条件适宜所结笼子均能够保留下来 。
这种高的结笼特性势必提高了猪笼草的观赏性 ,但
在生产中的应用价值还有待进一步研究 。
利用组培法来繁殖猪笼草也有其缺点 ,那就是
前期进展相对较慢 ,对技术要求较高 ,但一旦建立了
无性系 ,则可以快速繁殖 ,短期内就能生产出大批生
长齐一 ,表现一致的优质种苗 ,而且不受季节所限 ,
一年四季都可进行生产 ,这是常规繁殖所不能比拟
的[ 4] 。自然条件下猪笼草适合生长在我国南方湿度
较高的地区 ,在北方种植常常因湿度不够 ,不能长出
笼子 ,大大影响了其观赏及应用价值 。本试验的最
终目标是通过对其驯化和改良使其在北方能够正常
生长并保持优良性状 ,以满足人们的需求 ,有效保护
猪笼草这一宝贵的野生植物资源 。
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(编辑:张月清)
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