全 文 ：杨丽青，杨 洁，毛庆山，等．“小绿萼”梅离体快繁体系的建立［J］． 江苏农业科学，2015，43(4):62 － 64．
doi:10． 15889 / j． issn． 1002 － 1302． 2015． 04． 020
“小绿萼”梅离体快繁体系的建立
杨丽青1，杨 洁1，毛庆山2，包满珠1，张俊卫1
(1．华中农业大学园艺林学学院，园艺植物生物学教育部重点实验室，湖北武汉 430070;2．中国梅花研究中心，湖北武汉 430074)
摘要:以梅花品种小绿萼 1 年生枝条为试验材料，研究了采样时间、初代培养基、基本培养基和激素组合等对带芽
茎段离体繁殖的影响。结果表明:(1)最佳采样时间为 4—6月;(2)最佳腋芽诱导培养基为 1/2 MS +1． 0 mg/L 6 － BA +
0. 5 mg /L KT + 0． 1 mg /L NAA;(3)最佳增殖培养基 QL + 0． 5 mg /L 6 － BA + 0． 05 mg /L NAA，增殖系数为 4. 27;(4)无
菌苗在 200 mg /L IBA浸渍处理数秒后，移植到 1 /2 QL培养基中，生根率为 80%。
关键词:梅花;离体快繁;茎段;培养基
中图分类号:S685． 170． 4 + 3 文献标志码:A 文章编号:1002 － 1302(2015)04 － 0062 － 03
收稿日期:2014 － 05 － 09
基金项目:国家自然科学基金(编号:31070624);国家“863”计划(编
号:2011AA100207)。
作者简介:杨丽青(1986—)，女，山西朔州人，硕士，从事园林植物遗
传育种研究。E － mail:1270063665@ qq． com。
通信作者:张俊卫，博士，副教授，从事园林植物遗传育种研究。
E － mail:zjw@ mail． hzau． edu． cn。
梅是原产中国的传统名花，有悠久的栽培历史和丰富的
栽培品种，具有极高的观赏价值和经济价值。在生产上，梅花
以扦插、嫁接等无性繁殖为主，虽然能保持品种的优良性状，
但是繁殖系数小，周期长。利用组培快繁技术，不仅可在短期
内快速大量繁殖基因型一致的优质苗木，而且可获得无病毒
苗木，大大加快了育苗进程和提高了苗木质量。自 Harada
等［1］开展梅茎段离体繁殖以来，国内外在梅的离体快繁上取
得了较快的进展［2 － 5］，但目前仍存在建立快繁体系的梅花品
种少，部分品种在快繁过程中出现顶芽坏死、叶片黄化等难
题。小绿萼是武汉地区的梅花老品种，具有极高的观赏价值。
本研究旨在分析茎段采集时间、启动和增殖培养基对小绿萼
离体繁殖的影响，以期建立其快繁体系，为该品种的应用推广
提供一定的基础。
1 材料与方法
1． 1 材料
供试材料采于武汉市磨山中国梅花研究中心，除 8—9 月
份停止采样，分别在 3—11 月中旬采集梅花品种小绿萼
(图 1 － A)1 年生枝条，用冰盒带回实验室。
1． 2 方法
1． 2． 1 外植体灭菌及初代培养 采集回来的枝条剪成 1 ～
2 cm长的具节茎段，每茎段 1 ～ 2 个腋芽。用洗洁精浸泡
10 ～ 20 min，流水冲洗 30 min后在超净工作台上用 75%乙醇
浸润 30 s，转入 0． 1%HgCl2 中消毒 8 ～ 15 min，然后用无菌水
冲洗 6 ～ 7 次，无菌滤纸拭干后接种于初代培养基(1 /2MS +
1． 0 mg /L 6 － BA +0． 1 mg /L NAA);为分析不同初代培养基
对腋芽诱导的影响，以 4 月中旬采集的小绿萼枝条为材料，灭
菌后接种至 2种不同初代培养基:1 /2MS + 1． 0 mg /L 6 － BA +
0. 1 mg /L NAA和 1 /2MS +1． 0 mg /L 6 － BA +0． 1 mg /L NAA +
0． 5 mg /L KT。每处理 20 个外植体，重复 3 次，接种 30 d后统
计诱导率，污染率在接种后 10 ～ 15 d内统计。
1． 2． 2 腋芽增殖培养 将伸长到 1 ～ 2 cm的腋芽切下，分别
转入添加了 1． 0 mg /L 6 － BA 和 0． 1 mg /L NAA 的 3 种基本
培养基和添加不同浓度 6 － BA和 NAA组合的 QL培养基中，
观察腋芽的增殖，每处理 10 个外植体，重复 3 次，记录植株高
度，生长情况，接种 5 周后统计腋芽增殖情况。
1． 2． 3 丛生长度对继代的影响 待腋芽增殖形成的丛生芽
伸长到不同长度(0． 1、0． 5 ～ 1、1 ～ 2 cm)时，将其从基部切
下，放入继代培养基(1 /2MS + 1． 0 mg /L 6 － BA + 0． 1 mg /L
NAA +0． 5 mg /L KT)中观察其生长，每处理 5 个外植体，重复
3 次。
1． 2． 4 生根与移栽 选择生长健壮，株高超过 2 cm 的试管
苗在 5 种生根培养基中进行生根培养。移栽时先将生根苗连
培养瓶一起置于温室内进行为期 10 d的炼苗，在此期间逐渐
松开并揭去培养瓶的盖子，而后将植株根系上的培养基洗
净，移栽到含有泥炭 ∶ 蛭石 = 1 ∶ 1 (体积比)的塑料盆中。
移栽后的第 1 周塑料盆上覆盖塑料薄膜以保湿，1 周后慢慢
揭去。
1． 2． 5 培养条件 培养室温度为(23 ± 2)℃，空气相对湿度
为 60%左右，光照度为 1 500 ～2 000 lx，光照周期为 14 h /d。
2 结果与分析
2． 1 采样时间对腋芽诱导率的影响
茎段接种 1 周后腋芽开始萌发，2 周后腋芽开始伸长，叶
片逐渐展开，叶色浓绿(图 1 － B)。不同时间采集的枝条在初
代培养时，污染率和腋芽诱导率差异显著 (表 1)，4 月至 6 月
中旬是最佳采样时期，既可以保证较高的腋芽诱导率，而且污
染率相对较低，其他时期采集的枝条污染率高，腋芽诱导率
低，不适宜用作离体培养的外植体。
2． 2 初代培养基对腋芽诱导的影响
4 月采集的小绿萼枝条，接种于 2 种不同初代培养基中
(表 2)，培养于添加 KT的初代培养基中的外植体，不仅腋芽
诱导率高，而且芽伸长快，叶色浓绿，无顶芽死亡、黄化问题。
—26— 江苏农业科学 2015 年第 43 卷第 4 期
这与朱军等的结果［6］相一致，即 KT 对长蕊绿萼腋芽的伸长
生长有促进作用。
2． 3 基本培养基对腋芽增殖的影响
将伸长长度达到 1 ～ 2 cm的腋芽接种到添加了 1． 0 mg /L
BA和 0． 1 mg /L NAA的 3 种基本培养基(表 3)中，芽的增殖
和伸长表现出显著差异(表 4)，QL上培养的腋芽出芽数显著
高于改良 N6 和 1 /2MS，伸长长度显著高于改良 N6。比较 3
种培养基上腋芽的生长状态以及出芽数和丛生芽平均高度，
在增殖培养中采用 QL作为基本培养基。
2． 4 激素组合对增殖的影响
将伸长长度达到 1 ～ 2 cm，且长势一致的的腋芽转入添
加不同 6 － BA和 NAA浓度组合的 QL培养中基中(表 5)，在
6 － BA浓度为 0． 2 mg /L 时，丛生芽平均高度随着 NAA 浓度
的升高而下降，但没有达到显著差异，而增殖系数基本没有变
化，表明低浓度 6 － BA 不能诱导腋芽增殖;当 6 － BA 浓度为
1． 0 mg /L 时，丛生芽平均高度和增殖系数，随着 NAA 浓度的
升高先上升后下降，但丛生芽平均高度的变化没有达到显著水
平，而增殖系数达到显著差异;而当 6 － BA 浓度为 0． 5 mg /L
时，植株平均高度和增殖系数，随着NAA浓度的升高先下降
表 1 采样时间对小绿萼腋芽诱导的影响
取样时间 3 月 4 月 5 月 6 月 7 月 10 月 11 月
诱导率(%) 16． 70 ± 0． 15c 75． 00 ± 0． 16b 80． 00 ± 0． 06ab 95． 00 ± 0． 00a 0． 00 ± 0． 00c 3． 70 ± 0． 06c 14． 70 ± 0． 13c
污染率(%) 83． 00 ± 0． 15a 10． 00 ± 0． 08b 19． 70 ± 0． 06b 19． 60 ± 0． 06b 100． 00 ± 0． 00a 96． 30 ± 0． 06a 85． 00 ± 0． 13a
注:同行不同小写字母表示在 0． 05 水平上存在显著差异。
表 2 初代培养基对小绿萼腋芽诱导的影响
编号 培养基 萌芽率(%)
1 1 /2MS + 1． 0 mg /L 6 － BA + 0． 1 mg /L NAA 66． 70 ± 0． 08a
2 1 /2MS +1． 0 mg /L 6 － BA +0． 5 mg /L KT +
0． 1 mg /L NAA
78． 30 ± 0． 10a
注:同列不同小写字母表示在 0． 05%水平上存在显著差异。
表 3 基本培养基对小绿萼腋芽增殖的影响
基本
培养基
平均芽个数
(个)
丛生芽平均
高度(cm) 生长状态
改良 N6 1． 17 ± 0． 29b 0． 63 ± 0． 12b 叶嫩绿，簇生在基部，茎极
度短缩
1 /2MS 1． 50 ± 0． 50b 1． 20 ± 0． 08a 叶黄绿，愈伤团褐化
QL 3． 16 ± 0． 77a 1． 38 ± 0． 43a 叶嫩绿，平展，生长势很强
注:同列不同小写字母表示在 0． 05 水平上存在显著差异。
后上升，且变化值均达到显著差异。最终选用 QL + 0． 5 mg /L
6 － BA + 0． 05 mg /L NAA 作为小绿萼增殖培养基，在此培养
基上丛生芽的数量多，且生长正常(图 1 － C)。
2． 5 丛生芽长度对继代培养的影响
将腋芽增殖培养后不同伸长长度的丛生芽，从基部切离
后接种于继代培养基，生长表现出显著差异(表 3)，长度为
1 ～ 2 cm的腋芽伸长长度最大，生长健壮，叶片平展;而长度为
0． 1 ～ 1 cm的腋芽生长瘦弱，叶片黄化脱落，最后死亡。
2． 6 试管苗的生根培养和移栽
切取高度 2 ～ 3 cm 的试管苗，转入不同生根培养基(表
6)中生根，培养 30 ～ 40 d 后形成根系(图 1 － D、图 1 － E)。
植物生长调节剂的种类和浓度对试管苗生根有显著影响，只
表 4 BA和 NAA组合对腋芽增殖的影响
编号
6 － BA浓度
(mg /L)
NAA浓度
(mg /L)
丛生芽平均长度
(cm) 增殖系数
1 0． 2 0． 05 0． 96 ± 0． 27cd 1． 00 ± 0． 00d
2 0． 2 0． 1 0． 85 ± 0． 10de 1． 04 ± 0． 00d
3 0． 2 0． 2 0． 63 ± 0． 08d 1． 00 ± 0． 00d
4 0． 5 0． 05 2． 02 ± 0． 25a 4． 27 ± 0． 64a
5 0． 5 0． 1 0． 95 ± 0． 05d 1． 13 ± 0． 06d
6 0． 5 0． 2 1． 28 ± 0． 14cb 1． 50 ± 0． 35c
7 1 0． 05 1． 26 ± 011cb 1． 00 ± 0． 00d
8 1 0． 1 1． 52 ± 0． 27b 1． 90 ± 0． 50b
9 1 0． 2 1． 43 ± 0． 03b 1． 00 ± 0． 00d
注:同列不同小写字母表示在 0． 05 水平上存在显著差异。
表 5 丛生芽长度对继代培养的影响
编号
丛生芽长度
(cm)
继代培养后丛
生芽长度(cm) 生长状况
1 0． 1 0． 44 ± 0． 12a 叶极度卷曲，生长势差
2 0． 5 ～ 1 1． 76 ± 0． 53b 叶嫩绿，平展，有轻微玻璃化，
边缘黄化
3 1 ～ 2 2． 70 ± 0． 56c 叶嫩绿，平展，生长势极好
注:同列不同小写字母表示在 0． 05 水平上存在显著差异。
添加了生长素 IBA 的培养基生根率很低，仅为 3． 33%，且愈
伤组织多。同时添加 NAA和 IBA 的培养基以及添加 IBA 和
活性炭的培养基，生根率、平均生根数和平均根长显著增加，
但生根效果最佳的是试管苗先用 200 mg /L IBA 浸渍，再培养
于 1 /2QL 培养基的处理，生根率达到最高(80%)，与其他处理
相比差异显著，且平均根长和根数也显著增加。生根后的植株
先在温室炼苗 10 d左右，然后移栽入塑料盆中(图 1 － F)，移
—36—江苏农业科学 2015 年第 43 卷第 4 期
表 6 生根培养基对小绿萼试管苗生根的影响
编号 生根培养基 生根数(条) 根长(cm) 生根率(%)
1 1 /2QL + 0． 2 mg /L IBA + 0． 3 mg /L NAA 1． 60 ± 0． 17b 5． 88 ± 2． 42a 36． 67 ± 0． 15b
2 1 /2QL + 0． 5 mg /L IBA 0． 33 ± 0． 58b 0． 84 ± 1． 46b 3． 33 ± 0． 06c
3 1 /2QL + 0． 05 mg /L IBA 0． 33 ± 0． 58b 0． 67 ± 1． 16b 3． 33 ± 0． 06c
4 1 /2QL + 200 mg /L IBA 浸渍 3． 81 ± 1． 78a 4． 82 ± 1． 10a 80． 00 ± 0． 10a
5 1 /2QL + 0． 1 mg /L IBA + 1 g /L活性炭 1． 00 ± 0． 00b 3． 29 ± 1． 14ab 36． 67 ± 0． 06b
注:同列不同小写字母表示在 0． 05%水平上存在显著差异。
栽存活率可达 90%。
3 讨论
3． 1 外植体生理状态对启动培养的影响
3 月份梅花枝条上的叶芽开始膨大，萌发抽生新枝，但此
时的枝条过于幼嫩，容易受灭菌剂的影响而褐化死亡，同时污
染率也较高，因此本试验中 3 月取样的茎段萌芽率低;4—6
月为梅新梢生长旺盛期，本试验在此阶段取样的茎段萌芽率
最高可达 90%，且新叶嫩绿，生长强健。这一结果与傅萼辉
等、曲春苗等的研究相一致，即早春萌动的腋芽是比较理想的
离体培养外植体，因为此时内源 IAA浓度较高［7 － 9］，有利于腋
芽的萌发与生长。但与 Yonemitsu 等的试验结果相反，他们
认为当年 11 月到翌年 2 月在休眠枝上采集的冬芽，离体繁殖
的成功率高，造成这种差异的具体原因尚需进一步的
分析［10］。
3． 2 基本培养基对增殖培养的影响
在其他培养条件相同的情况下，果梅品种 Nanko 早春萌
发的新芽，在 WPM培养基上离体微繁时能增殖且生长健壮，
而在 MS培养基上的芽会逐渐褐化死亡［1］。而吕英民等离体
培养铁骨红 1 年生枝具节茎段时，通过比较外植体在 6 种基
本培养基(QL、MS、WPM、M1、M2、M3)上腋芽增殖系数、平均
伸长长度等指标的差异，认为 QL 是适合铁骨红生长的最佳
基本培养基［4，11］。本试验在小绿萼腋芽的增殖培养时，比较
了改良 N6、1 /2MS和 QL基本培养基对其增殖和生长的影响，
也发现 QL基本培养基显著优于改良 N6 和1 /2MS。
3． 3 KT和 BA对腋芽萌发和伸长的影响
组织培养中常用的细胞分裂素有 6 － BA、KT和 ZT，对梅
花的增殖有不同的效果。从铁骨红试管苗增殖培养的结果
看，6 － BA和 ZT优于 KT，而且增殖系数差异显著。但增殖培
养基中不添加 IAA、IBA 或 NAA 等生长素，增殖芽的伸长生
长慢，影响试管苗正常生长。细胞分裂素浓度过高，增殖芽数
量虽然明显增加，但多呈丛生状，茎难以伸长，且生长细弱，叶
小且叶色异常，甚至出现玻璃化苗［12］。为克服增殖苗生长瘦
弱，不得不采用壮苗培养基［7］。本试验在小绿萼腋芽增殖培
养中所选用的 3 个 6 － BA 浓度中，最适的浓度为 0． 5 mg /L，
在添加此浓度 6 － BA 的培养基中，不仅增殖系数最大，且丛
生芽平均伸长长度也较大，当 6 － BA 浓度提高到 1． 0 mg /L，
虽然产生了大量的丛生芽，但是继代培养时丛生芽往往发生
严重的褐化和黄化，渐渐死亡，同时玻璃化或畸形现象也逐渐
加强，因此，在增殖培养中 6 － BA的浓度选定为 0． 5 mg /L。
3． 4 浸渍法对生根培养的影响
在诱导梅试管苗生根时，既有单独使用 IBA或 NAA的报
道，也有同时使用 IBA 和 NAA 的报道［1，4，6，11］。Harada 等在
研究生长素对 Nanko试管苗生根影响时发现，高浓度的 IBA
(1 ～ 2 mg /L)或 NAA(0． 9 ～ 1． 9 mg /L)容易使试管苗基部形
成愈伤，本试验在生根培养基中添加 0． 5 mg /L也易导致小绿
萼试管苗形成大团愈伤。吕英民等在进行铁骨红试管苗生根
培养时，观察到生长素种类对生根影响显著，其中 NAA 生根
率较高，并且试管苗须根较多，但是根系比较细弱;添加 IBA
的试管苗根比较粗壮，但是根系较少;同时使用 2 种植物生长
调节剂时不仅发根多，而且生长粗壮。但在本试验中，IBA 和
NAA同时使用虽然生根数和生根率较单独使用有所增加，但
生根率偏低，而用 200 mg /L IBA 浸渍试管苗后培养于
1 /2QL，其生根率可达 80%，且平均生根数有显著增加，此结
果与新疆野生巴旦杏的生根试验相似［13］，其试管苗用
100 mg /L IBA浸渍处理 60 min后转入 1 /2MS培养基中培养，
暗培 2 周后生根率可达 100%。
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