全 文 ：［收稿日期］ 20120506(002)
［第一作者］ 张成军，副主任医师，从事呼吸内科的临床及教学工作，Tel:022-60335393，E-mail:zblzcj@ sina． com
［通讯作者］ * 邓雁如，教授，博士，Tel:022-59596221，E-mail:dyanru@ sina． com
沙漠绢蒿黄酮抑制肺癌 A-549 细胞增殖
张成军1，邓雁如2* ，王颖2，牟佳佳2
(1. 天津中医药大学第二附属医院，天津 300150;
2. 天津中医药大学，天津市中药化学与分析重点实验室，天津 300193)
［摘要］ 目的:研究从沙漠绢蒿中得到的黄酮类化合物体外对肺癌 A-549 细胞增殖的影响。方法:利用硅胶柱色谱等方
法分离纯化 6 种黄酮类化合物，分别为 5，7，4-三羟基-6-甲氧基黄酮、5，7-二羟基-6，3，4，5-四甲氧基黄酮、5，7，4-三羟基-6，
3，5-三甲氧基黄酮、5，7-二羟基-6，3，4-三甲氧基黄酮、槲皮万寿菊素-3，6-二甲醚-7-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-β-D-葡
萄糖苷-(3-O-7″)-槲皮素-3″-甲醚;采用 MTT 法测定 6 种黄酮类化合物对肺癌 A-549 细胞增殖的抑制作用;采用流式细胞仪检
测细胞周期及细胞凋亡。结果:受试的 6 种黄酮类化合物中的 5 种化合物对肺癌 A-549 细胞增殖具有明显抑制作用，其抑制
率与化合物浓度呈一定的相关性;流式细胞仪检测发现其中 2 种化合物(5，7，4-三羟基-6-甲氧基黄酮和 5，7，4-三羟基-6，3，
5-三甲氧基黄酮)使细胞周期分别阻滞于 G1 和 G2 期，另 1 种化合物(5，7-二羟基-6，3，4-三甲氧基黄酮)可通过诱导细胞凋
亡及细胞周期阻滞抑制 A-549 细胞增殖。结论:沙漠绢蒿黄酮对人肺癌细胞株 A-549 增殖具有明显抑制作用，使细胞发生周
期阻滞或凋亡。
［关键词］ 沙漠绢蒿;黄酮类;人肺癌 A-549 细胞;增殖;细胞周期;细胞凋亡
［中图分类号］ R285. 5 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2012)22-0243-05
Inhibiting Effects of Flavonoids from Seriphidium santolium
on Human Lung Carcinoma Cell Line A-549
ZHANG Cheng-jun1，DENG Yan-ru2* ，WANG Ying2，MOU Jia-jia2
(1. Second Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine (TCM) ，
Tianjin 300150，China;2. Tianjin Key Lab of Chemistry and Analysis of Chinese
Materia Medica，Tianjin University of TCM，Tianjin 300193，China)
［Abstract］ Objective:To study the inhibitory effect of flavonoids from Seriphidium santolium on the
proliferation of the lung carcinoma A549 cell line． Method:Six flavonoids were isolated by column chromatography
on silica gel． They were identified as hispidulin， arteanoflavone， 5， 7， 4-trihydroxy-6， 3， 5-
trimethoxyflavone，eupatilin，quercetagetin-3，6-dimethyl ether-7-O-β-D-glucoside， luteolin-7-O-β-D-glucoside-
(3-O-7″) -quercetin-3″-methyl ether． MTT was performed to examine the proliferation of A-549 cells，and flow
cytometry was used to determine the cell cycle distribution and cell apoptosis． Result:There was a dose-dependent
inhibition of cell proliferation of A-549 by five compounds． The antiproliferative effect of compound Ⅰ
(hispidulin)was attributed to its inducing cell cycle (G1)arrest，and compound Ⅲ (5，7，4-trihydroxy-6，3，
5-trimethoxyflavone)attributed to its inducing cell cycle (G2)arrest． Compound Ⅳ (eupatilin) induced the
apoptosis and inhibited the cell circle of A-549 cell． Conclusion:Flavonoids from S． santolium could exert an
anti-lung cancer effect via induction of cell cycle arrest or cell apoptosis．
［Key words］ Seriphidium santolium;flavonoids;lung cancer;proliferation;cell cycle;apoptosis
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第 18 卷第 22 期
2012 年 11 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 18，No． 22
Nov．，2012
DOI:10.13422/j.cnki.syfjx.2012.22.074
黄酮类成分为一类多酚类天然化合物，广泛存
在于自然界，如水果、蔬菜、绿茶及红酒中，是构成人
们饮食的一类重要组成成分，欧洲许多国家作为日
常饮食，每天都要食用几毫克的黄酮类成分。大量
的流行病学研究与实验表明黄酮类成分具有多种生
理及药理活性，主要表现在抗菌、抗病毒、抗突变、抗
肿瘤及防癌方面。近年来分子生物学研究表明，大
量的黄酮类成分对多种癌细胞系有较强的细胞毒作
用，其作用方式主要通过诱导肿瘤细胞凋亡，或阻滞
细胞周期在 G1-S 或 G2-M 期等方式抑制癌细胞增
殖。如泽兰林素(eupatilin)通过诱导、分化和细胞
凋亡的形式抑制胃癌 AGS 细胞的增殖［1］，木犀草素
(luteolin)通过诱导细胞凋亡及阻滞细胞在 G2 期抑
制非小细胞肺癌的增殖［2］，大豆素(daidzein)可使
细胞周期阻滞在 G1 期和 G2 /M 期抑制人乳腺癌细
胞 MCF-7 和 MDA-MB-453 增 殖［3］、染 料 木 素
(genistein)阻滞细胞周期在 G2-M 期而抑制人卵巢
癌细胞的增殖［4］、杨梅素(myricetin)、落叶松黄酮
(laricitrin)等阻滞细胞周期在 G2-M 期而抑制人结
肠癌细胞的增殖［5］。由于具有极大的抗肿瘤潜力，
黄酮类化合物已成为药物化学研究的热点与重
点［6-10］，基于此，为发现更多的具有抗肿瘤活性的黄
酮类化合物，我们对来自于新疆沙漠地区的植物沙
漠绢蒿中的 6 种黄酮类化合物体外抑制肺癌 A-549
细胞的增殖作用进行了初步研究(化合物结构见图
1) ，现报道如下。
图 1 6 种黄酮类化合物结构
1 材料
1. 1 药品和试剂 菊科植物沙漠绢蒿 Seriphidium
santolinum (Schrenk)Poljak 的全草采自新疆阜康
县，由中国科学院新疆生态与地理研究所张立运研
究员鉴定。6 种黄酮类化合物从该植物中分离得
到，分 别 为 5，7，4-三 羟 基-6-甲 氧 基 黄 酮
(hispidulin、化合物Ⅰ) ，5，7-二羟基-6，3，4，5-四
甲氧基黄酮(arteanoflavone，化合物Ⅱ) ，5，7，4-三羟
基-6，3，5-三甲氧基黄酮(5，7，4-trihydroxy-6，3，
5-trimethoxyflavone，化合物Ⅲ) ，5，7-二羟基-6，3，
4-三甲氧基黄酮(eupatilin，化合物Ⅳ) ，槲皮万寿菊
素-3，6-二甲醚-7-O-β-D-葡萄糖苷(quercetagetin-3，
6-dimethyl ether-7-O-β-D-glucoside，化合物Ⅴ) ，木犀
草素-7-O-β-D-葡萄糖苷-(3-O-7″)-槲皮素-3″-甲醚
［ luteolin-7-O-β-D-glucoside-( 3-O-7″)-quercetin-3″-
methyl ether，化合物Ⅵ］，6 种化合物均为自制，质量分
数均达到 98%。胎牛血清、胰蛋白酶、MTT、二甲基亚
砜(DMSO) (美国 Sigma 公司) ，DEME，F12培养基干粉
(美国 Invitrogen 公司) ，其余试剂均为分析纯。
1. 2 仪器 流式细胞仪 EPICS XL(Coulter，USA) ，
微量移液器(法国 Gilson 公司) ，酶标仪(美国 Bio-
Rad 公司) ，倒置显微镜(日本 Nikon 公司) ，超净工
作台(苏净集团安泰空气技术公司)。
1. 3 细胞株 正常人胚肾 293S 细胞和肺癌 A-549
细胞由北京阜外心血管病医院中德分子生物学实验
室提供。
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中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 18，No． 22
Nov．，2012
2 方法
2. 1 受试样品的制备 选用的受试样品均从菊科
沙漠绢蒿 Seriphidium santolinum (Schrenk) Poljak
植物的全草中分离得到，其分离纯化及结构鉴定已
另文发表［11］。样品分别以相应的培养基溶解待用，
浓度为 300 μmol·L － 1。
2. 2 细胞培养及药物处理 正常人胚肾 293S 细胞
和肺癌 A-549 细胞按常规方法复苏后，人胚肾 293S
细胞置于含 10%的胎牛血清的 DEME 培养液中、肺
癌 A-549 细胞置于含 10% 胎牛血清的 F12培养液
中，置 37 ℃ 5% CO2 培养箱中培养，每 2 ～ 3 d 用
0. 25%胰酶消化传代。取对数生长期的细胞用于
试验。
2. 3 细胞增殖活性测定 调整人胚肾 293S 细胞和
肺癌 A-549 细胞悬液密度为 1 × 106 个 /mL，接种于
96 孔板中，实验组分别加入用相应培养基稀释的不
同浓度的 6 种化合物，使终浓度分别为 15，30，60
μmol·L － 1;正常对照组加入相应的培养液，使给药
组和对照组的每孔终体积为 100 μL。每组设 5 个
复孔，加药后继续培养 72 h 后，每孔加入 100 μL
MTT(1 g·L － 1 PBS) ，继续培养 4 h，吸出上清，加入
100 μL DMSO，振荡 3 min。于酶标仪内，选取波长
570 nm 处测定其吸光度(A)。计算药物对细胞生长
的抑制率。
抑制率 =(A对照组 － A实验组)/A对照组 × 100%
2. 4 细胞周期检测 肺癌 A-549 细胞接种于细胞
培养瓶中，加入不同浓度的药物，使终浓度分别为
15，30 μmol·L － 1;正常对照组加入相应的培养液，
24 h后弃培养液，生理盐水洗一次，0. 125% 胰酶消
化，离心收集细胞，PBS 液离心洗涤 2 次，以 70%乙
醇固定过夜，PBS 离心洗去乙醇，加入 RNase A(终
质量浓度为 60 mg·L － 1) ，37 ℃温育 30 min，加入 PI
(终质量浓度为 50 mg·L － 1) ，4 ℃暗染 30 min，上流
式细胞仪分析。
2. 5 细胞凋亡观察 肺癌 A-549 细胞接种于细胞
培养瓶中，加入化合物(终浓度为 15，30 μmol·
L － 1) ，对照瓶加入培养液，24 h 后，弃培养液，生理
盐水洗 1 次，0. 125%胰酶消化细胞，PBS 洗 2 次，采
用无血清培养基重悬细胞，加入 Hoechast 33258 染
色 10 min，将细胞悬液涂于载玻片上，加盖玻片，荧
光显微镜下观察并拍照。
2. 6 统计学处理 应用 SPSS 17. 0 软件进行数据
处理，数据统计采用方差分析，结果以 珋x ± s 表示，组
间比较采用 t 检验。P ＜ 0. 05 为有统计学意义。
3 结果
3. 1 6 种黄酮类化合物对 A-549 细胞增殖的影响
化合物Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅵ各浓度组均能不同程度的
抑制 A-549 细胞的增殖，且呈一定的浓度依赖关系，
但化合物Ⅴ没有明显抑制作用(数据未显示) ，6 种
黄酮类化合物(15，30，60 μmol·L － 1)处理正常人胚
肾 293S 细胞 24 h 后，对细胞无细胞毒性(数据未显
示)。统计分析结果显示，各处理组与正常对照组
相比均呈现较显著差异(表 1)。
表 1 5 种黄酮类化合物对 A-549 细胞增殖的抑制作用(珋x ± s，n = 5)
组别
抑制率 /%
15 μmol·L － 1 30 μmol·L － 1 60 μmol·L － 1
化合物Ⅰ 40. 5 ± 4. 07 54. 4 ± 4. 491) 81. 5 ± 2. 841)
化合物Ⅱ 21. 7 ± 3. 20 33. 5 ± 3. 401) 52. 0 ± 3. 061)
化合物Ⅲ 6. 88 ± 2. 74 47. 9 ± 2. 741) 54. 1 ± 1. 821)
化合物Ⅳ 20. 4 ± 2. 78 39. 0 ± 2. 821) 59. 1 ± 3. 521)
化合物Ⅵ 5. 25 ± 2. 02 18. 1 ± 3. 471) 37. 7 ± 3. 391)
注:不同浓度组间比较1)P ＜ 0. 01。
3. 2 3 种化合物对细胞周期的影响 通过 MTT 实
验后，选择了对 A-549 细胞增殖抑制效果较好的化
合物Ⅰ，Ⅲ和Ⅳ进行进一步研究。取这 3 种黄酮化
合物分别作用于 A-549 细胞 24 h 后，进行细胞周期
的检测。化合物Ⅰ作用于 A-549 细胞 24 h 后，处于
G1 期的细胞由最初的 29. 9% 分别增加至 38. 8%
(15 μmol·L － 1)和 51. 6%(30 μmol·L － 1) ，而 S 期的
细胞明显减少，由最初的 61. 4% 减少至 44. 5%
(15 μmol·L － 1)和 18. 8%(30 μmol·L － 1) ，差异有统
计学意义(P ＜ 0. 01) ，这表明化合物Ⅰ能阻滞 A-
549 细胞在细胞周期中从 G1 向 S 期的转变过程，使
细胞周期停滞于 G1 期，减少 DNA 合成和有丝分裂，
抑制细胞增殖，见表 2。化合物Ⅲ作用于 A-549 细
胞 24 h 后，处于 G2 期的细胞由初期的 8. 70%分别
增加至 28. 8%(15 μmol·L － 1)和 41. 5% (30 μmol·
L － 1 ) ，而 S 期 细 胞 分 别 减 少 至 52. 5%
(15 μmol·L － 1)和 27. 4%(30 μmol·L － 1) ，差异有统
计学意义(P ＜ 0. 01) ，这表明化合物Ⅲ作用于 A-549
细胞 24 h 后，使细胞停滞在 G2 期，减少 DNA 合成
和有丝分裂，抑制细胞增殖，见表 2。
化合物Ⅳ作用于 A-549 细胞 24 h 后，A-549 细
胞在 G1 峰前出现荧光强度下降的 sub-G1 峰，说明
化合物Ⅳ在对细胞周期产生阻滞的同时还可通过诱
导细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖，当化合物浓度为
30 μmol·L － 1时，凋亡率为 15. 6%(图 2)。
·542·
张成军，等:沙漠绢蒿黄酮抑制肺癌 A-549 细胞增殖
A． 对照;B． 15 μmol·L － 1化合物Ⅳ处理 A-549 细胞 24 h;
C． 30 μmol·L － 1化合物Ⅳ处理 A-549 细胞 24 h
图 2 化合物Ⅳ对细胞周期分布的影响
表 2 化合物Ⅰ，Ⅲ作用于 A-549 细胞 24 h 后
细胞周期的分布(珋x ± s，n = 3) %
组别
浓度
/μmol·L － 1
G1 期 S 期 G2 期
对照 － 29. 9 ± 1. 03 61. 4 ± 3. 35 8. 7 ± 0. 98
化合物Ⅰ 15 38. 8 ± 1. 761) 44. 5 ± 3. 141) 16. 7 ± 1. 111)
30 51. 6 ± 2. 781) 18. 8 ± 1. 211) 29. 6 ± 1. 281)
化合物Ⅲ 15 19. 8 ± 1. 241) 52. 5 ± 3. 021) 28. 8 ± 1. 181)
30 31. 2 ± 1. 88 27. 4 ± 2. 131) 41. 4 ± 2. 541)
注:与对照组比较1)P ＜ 0. 01。
3. 3 诱导细胞凋亡 化合物Ⅳ作用于 A-549 细胞
24 h 后，于荧光显微镜下观察，可见其细胞的胞核
或细胞质内出现浓缩致密的颗粒块状荧光(图 3) ，
与流式细胞仪检测结果一致，即化合物Ⅳ可通过诱
导细胞凋亡，抑制肿瘤细胞 A-549 增殖。
4 讨论
本实验初步探讨了沙漠绢蒿黄酮对肺癌 A-549
A． 对照;B． 30 μmol·L － 1化合物Ⅳ处理 A-549 细胞 24 h
图 3 化合物Ⅳ作用于 A-549 细胞 24 h 后荧光显微镜观察
细胞增殖的影响。MTT 法检测结果表明，所测试的
6 种黄酮类化合物中的 5 种可抑制 A-549 细胞的增
殖，并呈一定的浓度依赖关系，此结果与大多数植物
来源的黄酮作用基本一致［12-16］。
细胞周期(cell cycle)是细胞生命活动的基本过
程，通常被分为 4 个时期，即 G1 期(DNA 合成前
期) ，S 期(DNA 合成期) ，G2 期(DNA 合成后期) ，M
期(有丝分裂期)。增殖细胞的染色质在 S 期复制，
经过 G2 期后，细胞开始有丝分裂的复杂过程，有丝
分裂后的细胞进入 G1 期，再进入 S 期，又重新启动
DNA 合成。细胞周期是一个高度有序的运转过程，
与之相关的调控分子主要有 3 类，细胞周期蛋白
(cyclin) ，细 胞 周 期 蛋 白 依 赖 性 激 酶 (cyclin-
dependent kinase，CDK)和细胞周期蛋白依赖性激
酶抑制剂(cyclin dependent kinase inhibitors，CKI)。
近年来研究发现细胞周期调控异常与肿瘤的发生发
展密切相关，许多化疗药物正是针对细胞周期调控
中的关键分子来控制细胞的生长、分裂，阻止癌细胞
的增殖，以达到治疗肿瘤的目的［17］。
本实验结果表明化合物Ⅰ可以使 G1 期细胞比
例增加，使细胞停滞于 G1 期，化合物Ⅲ可以使 G2 期
细胞比例增加，使细胞停滞于 G2 期，同时两个化合
物均能使 S 期细胞明显减少，说明癌细胞的增殖活
性受到抑制，并且随着化合物浓度的增加，效应增
强;而化合物Ⅳ通过细胞周期阻滞及诱导细胞凋亡
抑制癌细胞的增殖活性。3 种黄酮类化合物结构不
同，其周期阻滞的分子机制可能有所不同，因此有必
要对这 3 种化合物与细胞周期调控因子 cyclins，
CDKs，CKIs 的关系及其如何调控细胞周期的进程
做进一步深入的研究，以阐明药物在肿瘤细胞凋亡、
增殖抑制中的作用，探求它们用于肺癌治疗的可
能性。
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［责任编辑 聂淑琴］
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