全 文 ：第 30 卷 第 3 期 热 带 作 物 学 报 Vol．30 No．3
2009 年 3 月 CHINESE JOURNAL OF TROPICAL CROPS Mar ．2009
野茼蒿链格孢 YTH-21菌株的
生物学特性及致病性研究
杨 叶， 王兰英
海南大学环境与植物保护学院， 海南儋州， 571737
摘要 对野茼蒿（Alternaria sp.）YTH-21 菌株的生物学特性及致病性进行研究， 结果表明： 该菌的菌丝体生长速
度快， 致病性强； 菌丝体生长最适温度为 25 ℃， 产孢及孢子萌发最适宜温度均为 30 ℃， 致死温度为 50 ℃、 10
min； 菌丝体生长和产孢适宜 pH 值范围为 5.0~8.0， 最适宜于孢子萌发的 pH 值为 7.0； 对菌丝体生长及产孢最好
的碳源为葡萄糖， 但不利于孢子萌发； 供试氮源以氯化铵对菌丝体生长及产孢表现出明显的抑制作用。
关键词 野茼蒿； 致病性； 生物学特性
中图分类号 S436.3
野茼蒿（Gynura crepidioides Benth.）为菊科植物， 又名革命菜、 安南草， 是一种常见的杂草， 一年四季
均可生长， 在海南随处可见。 目前防除杂草方法很多， 化学除草具有方便、 快速、 经济等优点， 但大量化
学除草剂使用后带来的药害、 残留、 对环境污染等问题日益突出。 为了减少化学除草剂的使用， 利用杂草
的天敌－杂草病原真菌， 开发微生物除草剂的研究在沉寂一段时间后， 近年又开始受到重视。 张希福、 向
梅梅、 潘丽梅分别对豫北、 广东、 东北地区杂草上的植物病原菌进行调查、 采集、 鉴定， 并从植病流行的
生态学观点探讨了杂草植物病原菌开展杂草生防的可行性[1~4]。 朱云枝、 邱海萍等曾分别研究报道马唐草弯
孢菌的生防潜力 [5, 6]。 郑燕梅等报道了水花生镰刀菌、 假隔链格孢菌等具有潜在的应用价值 [7~9]。 目前已有
不少利用病原微生物防除杂草的实例， 有的已大面积应用并取得成功， 有的则已作为生物农药商品化生
产。 如 “鲁保一号” （Colletotrichum gloeosporides. f . cuscutae）为 1963年山东农业科学院植物保护研究所从
感病大豆菟丝子上分离开发的生物除草剂[10]。 近年来南京农业大学开发了一系列生物除草剂产品， 如 “畏
佳” 仍是胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）。 国外登记注册的生物除草剂如 Devine 是棕榈疫霉
[（Phytophthora palmivora (Butler)]， Biomal是胶孢炭疽菌锦葵亚种（C. gloeosporioeides. f . sp. malvae)[11,12]。
目前有关野茼蒿致病菌的报道仅见云南发现的联体病毒 [13]。 海南地处高温潮湿的热带地区， 气候条件
非常适宜于病原菌的发生， 是微生物天然宝贵的资源库。 从 2003 年开始， 笔者对海南常见杂草病原真菌
资源进行调查， 在野茼蒿上发现了一株具有较强致病力的 YTH-21菌株， 并对其进行了病原鉴定、 致病性
和生物学特性等研究， 旨在为今后进一步深入研究及开发出有实用价值的微生物源除草剂提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌株 野外调查采集感病野茼蒿， 记录典型的发病症状， 并按柯赫法则鉴定致病菌， 即采用
常规的组织分离法分离培养、 纯化病菌后接种到原杂草， 并再次分离获得该菌， 确定是致病菌后作属种鉴定。
1.1.2 培养基 PDA培养基： 100 g马铃薯， 20 g葡萄糖， 20 g琼脂， 1 000 mL水； Czapek培养基： 2.00 g
基金项目： 海南省自然科学基金项目(No. 30305)， 华南热带农业大学自然科学基金项目(No. 2003)
作者简介： 杨 叶， 1970年生， 女， 硕士， 副教授， 主要从事农药、 生物农药及相关领域的研究。
收稿日期： 2008-12-09 修回日期： 2009-02-01
热 带 作 物 学 报 30 卷
NaNO3， 0.5 g MgSO4 .7H2O， 0.5 g KCl， 1.0 g KH2PO4， 0.01 g FeSO4， 30.0 g蔗糖， 17.0 g琼脂， 1 000mL水。
1.2 方法
1.2.1 菌株的致病性测定 将野外健康的野茼蒿幼苗连土挖回实验室， 移栽于花盆中种植 20~30 d后备用。
（1）菌丝块的致病性测定： 用金刚砂将寄主叶子轻轻磨伤， 在培养 7 d 的菌落边缘打菌块（Φ=6 mm）， 接种
到磨伤处， 以接种无菌的培养基块为对照， 共接种 5 盆野茼蒿， 每盆野茼蒿上接种 20 点。 采用套塑料袋
的方式进行保湿。 2 d后开始检查发病情况。 （2）孢子悬浮液的致病性测定： 分别将 0.5×105个/mL链格孢菌
株的孢子悬浮液喷雾接种到健康的野茼蒿上（共接 16盆）， 喷清水作为对照。 2 d后开始检查发病情况。
1.2 环境及营养因子对菌株的影响
1.2.1 光照条件对菌丝生长、 孢子形成与萌发的影响 在培养 7 d的菌落边缘打菌块（Φ=6 mm）移入 PDA
培养基的中央， 每皿一块， 分别置于连续光照、 光暗交替和完全黑暗 3 种不同光照下， 于 28 ℃恒温培养
箱中连续培养 3 d 后， 用十字交叉法测量菌落直径。 培养 6 d 后用血球计数板法测量其产孢量。 每个处理
3个培养皿， 试验重复 3次。
采用玻片琼脂表面萌发法， 在培养 7 d 的每支菌种中加入 2 mL 0.1％吐温溶液（无菌水配制）洗下孢
子， 孢子悬浮液浓度以稀释到低倍显微镜（10×10）下 150～200 个/视野为宜， 再将其涂在含 1％琼脂的灭菌
载玻片上， 分别设连续光照、 全黑暗和光暗交替 3 种处理， 在 28 ℃培养箱中保湿培养 4 h 后， 检查分生
孢子的萌发率。 每个玻片上检查孢子 100个， 每处理 3个玻片， 试验重复 3次。
1.2.2 温度对菌丝生长、 孢子形成与萌发的影响 将接种菌块的 PDA 平板及涂抹孢子悬浮液的琼脂载
玻片， 分别置于 20、 25、 30、 35、 40℃的恒温培养箱中培养 3 d后， 用十字交叉法测量菌落直径。 培养 6 d
后， 用血球计数板法测量其产孢量。 每处理 3个培养皿， 试验重复 3次。 其它方法同上。
菌丝致死温度的测定： 移取 1 个菌块到无菌试管中， 加入 2 mL 灭菌水， 分别置于 40、 45、 50、
55、 60、 65 ℃的恒温水浴锅中加热 10 min， 取出后立即在冰水中冷却至室温。 将处理后的菌块接种到
PDA平板上， 于 28℃恒温培养箱中连续培养 3 d后， 用十字交叉法测量菌落直径。 培养 6 d后用血球计数
板法测量其产孢量。 每处理 6个菌块， 试验重复 3次。
1.2.3 pH 值对菌丝生长、 孢子形成与萌发的影响 用 1 mol/L 的 NaOH 和 1 mol/L 的 HCl， 将 PDA 培养
基和无菌水的 pH 值分别调节为 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10 共 7 种， 分别制成含不同 pH 值的 PDA 平板和孢
子悬浮液备用。 其它方法同上。
1.2.4 碳源对菌丝生长、 孢子形成与萌发的影响 以 Czapek 培养基为基础培养基， 用含有相同质量碳
元素的甘油、 葡萄糖、 果糖和木糖替代基本培养基中的蔗糖， 制成不同碳源固体培养基备用。 用灭菌水分
别将蔗糖、 葡萄糖、 果糖、 木糖和甘油配制成 5％碳源的营养液， 洗下孢子制成孢子悬浮液备用。 以不加
碳源作为对照， 其它方法同上。
1.2.5 氮源对菌丝体生长和孢子萌发的影响 以 Czapek 培养基为基础培养基， 用含有相同质量氮元素
的蛋白胨、 甘氨酸、 赖氨酸和氯化铵取代其中的硝酸钠， 制
成不同氮源的固体培养基备用。 用灭菌水分别将蛋白胨、 甘
氨酸、 赖氨酸和硝酸钠配制成 5％氮源的营养液， 洗下孢子制
成孢子悬浮液备用。 以不加氮源作为对照， 其它方法同上。
2 结果与分析
2.1 致病菌的鉴定
发病症状： 初期病斑为黑褐色圆形或不规则形， 病斑较
小， 后期汇合成不规则的大病斑， 有的可达整个叶片的 1/4，
严重时中央变灰白坏死（见图1）。
图 1 野茼蒿叶斑病
366
3期 杨 叶等： 野茼蒿链格孢 YTH-21 菌株的生物学特性及致病性研究
菌落在 PDA 培养基上近圆形、 灰黑色、 生长速度快、 气生菌丝茂盛。 分生孢子梗由菌丝顶端生成，
或从菌丝侧生， 通常比菌丝粗， 色深， 有隔膜； 分生孢子褐色， 卵形、 倒梨形或近椭圆形， 1~5 个横隔
膜， 0~3个纵隔膜， 喙细长， 大小为 24~51 μm×9~18 μm（见图2）。
根据以上性状， 初步认为该致病菌为半知菌亚门（Deuteroumy cotina）丝孢纲（Hyphomycetes）链格孢属
(Alternaria sp.)[14]。
2.2 致病性测定
YTH-21 菌株菌丝块接种野茼蒿叶片 4 d 后， 叶片出现发病症状， 为褐色近圆形病斑， 大约 5~6 mm，
其扩展速度快， 6 d后病斑就可达 20 mm（见图3）。 孢子悬浮液接种 4 d 后开始发病， 在叶片上出现一些零
星的黑褐色圆形的小病斑， 6 d后病斑大小为 3~4 mm， 发病的严重程度不如菌丝接种。
2.3 环境条件及营养的影响
2.3.1 光照条件对 YTH-21 菌丝体生
长、 孢子形成与萌发的影响 不同光照
条件对菌丝体生长和孢子萌发的影响不
大， 各处理间没有显著差异。 但分生孢
子的产生却以连续黑暗的产孢量最大，
与其它处理存在极显著差异（见表1）。
2.3.2 pH 值对 YTH-21 菌丝体生长 、
孢子形成与萌发的影响 YTH-21 菌丝
体最适 pH 范围为 5.0~8.0， 此范围内各
处理间没有显著差异； 菌株的平均产孢
量随 pH值的变化差异不显著， 仅 pH值
4.0时对产孢有一定的抑制作用 (见表2)；
YTH-21 孢子萌发的最适 pH 值为 7.0，
从萌发后的形态上观察， pH7.0 时的芽
管最长， pH4.0时的芽管短而显得纤细。
2.3.3 温度对 YTH-21菌丝体生长、 孢子形成与萌发的影响 YTH-21 菌丝最适生长温度为 25℃， 和其
它处理之间达极显著差异， 在 40 ℃时菌丝生长完全受抑制。 产生孢子的最佳温度为 30 ℃， 低于 20 ℃或
高于 40℃均不能产生分生孢子。 分生孢子在 20~35℃之间均有较高萌发率， 其中 30℃时芽管最长， 孢子
图 2 野茼蒿叶斑病菌 图 3 YTH-21 菌株接种叶片症状
!#!$%&
!’#((%&
!#!’%&
)#**+*),-
.#)+*) %&
)#/!+*) ,-
$$#%&
0*#*%&
0)#!%&
1234567894:;<=>P?)#)’@A7894:;
! !#$
%&
%&
%&
! %&#
!’()
!! ($)
* #
!’* %&#
!* %&
!* %&
!* %&
!’* %&#
!’* %&#
’ +)
($
($
%&
#
#
&#
367
热 带 作 物 学 报 30 卷
萌发率最高， 当温度高于 35 ℃则不利于孢子的
萌发(见表3)。
菌丝体致死温度的测定结果表明， 经过 45
℃水浴处理 10 min 后 ， 菌丝仍有活力 ， 能在
PDA培养基上形成菌落， 培养 3 d的菌落直径为
9.15 mm， 而经 50℃水浴处理 10 min后， 则不能
在 PDA 培养基上形成菌落， YTH-21 菌株的致
死温度为 55℃、 10 min。
2.3.4 碳源对 YTH-21 菌丝体生长、 孢子形成
与萌发的影响 由表 4 可见， 所有供试碳源均
有利于 YTH-21 菌株菌丝体生长， 与对照比较
存在极显著差异， 其中以葡萄糖的菌落直径最
大； 葡萄糖为最适宜产孢碳源， 与其它处理之
间存在极显著差异； 但以葡萄糖和甘油为供试
碳源时， 孢子萌发率却较低， 与其它处理间存
在极显著差异。 在形态上， 在 D－果糖上孢子萌
发的芽管最长， 其次是 D－木糖和葡萄糖， 甘油
处理萌发的孢子芽管最短。
2.3.5 氮源对 YTH-21 菌丝体生长、 孢子形成
与萌发的影响 从表 5 可见， YTH-21 菌株在
除氯化铵外的其它供试氮源上均能良好生长，
且各供试氮源对菌丝体生长差异不显著， 但供
试氮源对产孢量的影响则非常明显， 甘氨酸为
最适宜产孢氮源， 氯化铵则对产孢表现出明显抑制作用； 各氮源之间孢子萌发率没有显著差异， 但从萌发
后的形态上观察， 在氯化铵条件下萌发的孢子芽管较其它处理的短。
3 讨论
总的来说， YTH-21 菌株易人工培养， 对温度、 pH 值、 光照及营养元素的要求不高， 作为制剂开发
的一些基本条件比较容易满足。 其中， 供试氮源对菌丝体生长及产孢没有明显的促进作用， 氯化铵甚至表
现出明显的抑制作用。 经过多次重复测定发现， YTH-21 菌株以葡萄糖为碳源时孢子萌发率低于对照， 表
现特别； 这与笔者同一时间对马唐草叶斑病菌和牛筋草叶斑病菌的测定结果不同， 葡萄糖为碳源时这两种
病菌的孢子萌发率均高于对照。
在对孢子萌发测定时， 除了以萌发率为标准进行显著性分析外， 还对孢子萌发后的芽管形态进行了观
察， 对一些没有显著差异的处理做进一步分析， 使结果更加准确。 由于该菌株的产孢量不是太大， 在不同
处理及重复试验中往往出现较大的差异， 因此， 特采用多次重复以减小误差。 本试验的重复次数至少 3
次， 产孢量测定的重复次数有的为 6次， 但不同重复之间的产孢量还是存在较大波动。 可能的原因有， 在
不同的试验阶段病菌存在一定的变化， 尤其是产孢量， 有时多有时少， 具体原因尚未知。 针对上述研究结
果， 在选择最佳的营养元素、 培养条件时要综合考虑， 如： 连续黑暗可提高产孢量， 并可能减少重复之间
的差异； 培养基的碳源选蔗糖或果糖等。
致病性的测定结果表明， 孢子悬浮液接种比菌丝块接种的致病力低， 主要是测定方法不同所造成的。
因为菌丝块接种时叶片有刺伤， 发病程度会更严重， 另外也可能与孢子悬浮液接种时孢子数量较小有关，
，，，，
!
# $%
&’(
)*
!$%
+ $%
,+ !
+ $%
$%
,, #$%
,- ,$%
-& -!
- $%
-
!
# $
%&’’()
*%&+,-.
/0&1,-.
/0&’’-.
/*&’’-.
/0&’2-.
’&’’34
0&0150’()
0&*650’ ()
*&*+50’ -.
’&/*50’ 34
0&2’50’ ().
66&0-.
6%&,-.
%+&2-.
%*&2-.
%*&%-.
6%&’-.
!
#$%&&’(
)*%)$+(,
)-%-&+,
).%/&’+(,
).%)$’+(,
))%&$01
$%*&2/$’(
$%//2/$ 0,
$%#)2/$ +0(,
$%3#2/$ ’+0(,
$%3#2/$ ’+0(,
$%/$ ’+(,
**%$+,
4$%.’(
*/%$+,
4-%*’(
4.%)’(
.4%*’(
368
3期 杨 叶等： 野茼蒿链格孢 YTH-21 菌株的生物学特性及致病性研究
但 YTH-21菌株孢子悬浮液接种的致病性是比较明确的。 由于杂草方面已鉴定的病原菌很少， 可供参考的
资料不多， 因此本研究中的病原菌株只鉴定到属， 种的鉴定还有待后续的研究。 今后除对病菌做进一步鉴
定外， 还需展开除草活性的测定， 以及制剂加工和大田防效等研究。
致谢 陈园、 邓冬贵、 邢增益、 黄伟安、 刘志华、 陈亚林、 朱倩倩、 张玉檀和保增元等同学参加了部分研究工作， 还
得到文衍堂教授的细心指导， 在此一并致谢!
参 考 文 献
[1] 张希福， 高山松. 杂草植物病原菌资源调查及其在杂草生防上的应用前景[J]. 河南职技师院学报， 1996， 24(1): 36～41.
[2] 向梅梅. 广东农田杂草上的病原真菌[J]. 华南农业大学学报， 2002， 23(1): 41～44.
[3] 向梅梅， 曾永三， 等. 空心莲子草叶斑病菌代谢产物的除草活性[J]. 中国生物防治， 2002， 18(2): 87～89.
[4] 潘丽梅， 白容霖， 刘伟成等. 东北地区农田主要杂草的病原真菌及其地理分布[J]. 吉林农业大学学报， 2005， 27(4): 373～377.
[5] 朱云枝， 强 胜. 马唐病原真菌的分离筛选及其致病力测定[J]. 中国生物防治， 2004， 20(3): 206～210.
[6] 邱海萍， 柴荣耀， 张 震， 等. 马唐致病菌株 Mds0404 的生物学特性[J]. 浙江农业学， 2008， 20(3): 63～167.
[7] 郑燕梅， 王源超， 乔广行， 等. 水花生病原真菌的筛选与生防潜力的研究[J]. 南京农业大学学报， 2006， 29(2): 57～60.
[8] 庄义庆， 何东兵， 王源超. 水花生病原菌一蕉斑镰刀菌菌株的筛选及其致病性测定[J]. 中国生物防治， 2008， 24(3): 262～ 266.
[9] Pomella A W V， Barreto R W， Charudattan R. Nimbya alternantherae a potential biocontrol agent for alligatorweed， Alternanthera philaceroides[J].
Biocontrol， 2007， 52: 271～288.
[10] 李扬汉， 张宗俭， 王建书， 等. 有关真菌除草剂研究的进展[J]. 生物防治通报， 1994， 10(1): 35～39.
[11] 陈勇强， 但汉斌， 郭富常. 国外微生物除草剂的研究及应用现状[J]. 天津农业科学， 1998， 4(2): 5～9.
[12] Eusebio A A， Watson A K. Mixtures of fungal pathogens to control complex of weeds in rice[C]. Legere A. Proceedings of the Third
Internationl Weed Science Congress. IWSS， Oregon， USA， 2000. 153.
[13] 陈精兰， 李 凡， 李 越， 等. 侵染野筒篙引起黄脉症状的联体病毒的分子鉴定[J]. 云南农业大学学报， 2008， 23(1): 29～32.
[14] 陆家云. 植物病原真菌学[M]. 北京： 中国农业出版社， 2001.
Biological Characteristics of Alternaria sp. Strain
YTH-21 from Gynura crepidioides
Yang Ye, Wang Lanying
College of Environment and Plant Protection, Hainan University, Danzhou, Hainan 571737, China
Abstract A strain YTH -21 of Alternaria sp. was isolated from Gynura crepidioides Benth. and its
biological characteristics tested. The results showed that the strain YTH-21 displayed fast mycelium growth
and high pathogenicity. The optimum temperature was 25 ℃ for mycelia growth and 30 ℃ for sporulation
and conidia germination. The lethal temperature was 50 ℃ for 10 min. The optimum pH was 5 ～8 for
mycelia growth and sporulation and 7 for conidia germination. Among carbon and nitrogen sources, glucose
was the best for sporulation and mycelia growth but not good for conidia germination, and NH4Cl was not
favorable for mycelia growth and sporulation, showing clear inhibition.
Abstract Gynura crepidioides; Alternaria sp., pathogenicity; biological characteristics.
（责任编辑：高 静）
369