全 文 ：天然产物研究与开发 Nat Prod Res Dev 2006 ,18:631-633 , 662
文章编号:1001-6880(2006)04-0631-04
　
　
　收稿日期:2005-09-05　　　接受日期:2005-10-11
　基金项目:浙江省教育厅资助项目(20010377);温州市科技局资助
项目(S2002A026)
＊通讯作者 Tel:86-577-86689981;E-mail:wzmcyxx@yahoo.com.cn
超声提取-分光光度法测定浙江雪胆中总皂苷含量
叶晓霞1 , 2 , 3＊ ,丁立生1 ,黄可新3
(1.中国科学院成都生物研究所 国家天然药物工程技术研究中心 ,成都 610041;
2.中国科学院研究生院 ,北京 100049;3.温州医学院药学院化学教研室 , 温州 325035)
摘　要:超声波提取浙江雪胆总皂苷 , 运用分光光度法对浙江雪胆中总皂苷的含量进行测定。正交设计优选比
色条件 ,以齐墩果酸-28-O-α-L-鼠李吡喃糖基(1※4)-β-D-葡萄吡喃糖基(1※6)-β-D-葡萄吡喃糖甙(cussonodide B)
为标准品 ,利用香草醛-醋酸显色体系 , 在 550 nm 处检测。浓度在 3.43 ～ 17.17 μg/mL 范围内呈良好的线性关
系 ,其回归方程为 A=0.03350＊C(μg/mL)-0.06595 ,相关系数 R=0.9995 , 浙江雪胆中总皂苷的含量为 0.34%,
加样回收率 99.29%, RSD=0.99%。本方法简便 、快速 、准确 、可靠。
关键词:浙江雪胆总皂苷;超声提取
中图分类号:R284.2 文献标识码:A
Studies on Determination of the Total Saponins
in Hemsleya Zhejiangensis
YE Xiao-xia1 ,2 ,3＊ ,DING Li-sheng1 ,HUANG Ke-xin3
(1.National Engineering and Research Center for Natural Medicines , Chengdu Institute of Biology , Chinese Academy of Sciences ,
Chengdu 610041 , China;2.Graduate School of Chinese Academy of Sciences , Beijing 100049 , China;3.Department of
Chemistry , Wenzhou Medical College ,Wenzhou 325035 , China)
Abstract:This paper described the use of ultraviolet spectrometry(UV)in determination of the total saponins in Hemsleya Zhe-
jiangensis extracted by ultrasonic wave.Choose the best colorable condition through orthogonal experimental designs.Cussono-
dide B was used as standard compound and vanillin-acetic acid was used as reagent of colorable reaction.The detection wave-
length was chosen at 550 nm.Linear range of concentration is between 3.43～ 17.17μg/mL and its regression equation shows
to be A=0.03350＊C(μg/mL)-0.06595 , R=0.9995.Average recovery of standard compound is 99.29%, RSD=0.99%.
The method is simple , rapid , sensitive and accurate.
Key words:the total saponins in Hemsleya zhejiangensis;ultrasonic wave extraction
　　浙江雪胆(Hemsleya zhejiangensis)为雪胆属
(Hemsleya Cogn)植物新发现的一个种 ,是浙江特有
植物 ,仅分布在温州泰顺乌岩岭自然保护区[ 1] ,其化
学成分的研究尚未见报道。雪胆属为葫芦科(Cu-
curbitaceae)植物 ,雪胆属植物的块根具有清热解毒 、
消肿的功效 ,民间广泛用于治疗肠炎 、菌痢 、冠心病 、
气管炎 、慢性子宫颈炎等多种疾病。70年代对雪胆
属植物研究表明 ,该属植物富含葫芦素类成分 ,具有
保肝 、抗癌作用 。最近十几年雪胆属分离纯化得到
的活性物质均为三萜类化合物 ,主要是齐墩果烷型
和葫芦烷型化合物及其糖苷[ 2] 。三萜皂苷具有广泛
的生物活性 ,主要表现在具有溶血 、抗癌 、抗炎 、抗
菌 、杀软体动物 、抗生育等活性[ 3] 。为了开发利用浙
江雪胆这一特有属植物 ,我们通过实验建立了以齐
墩果酸-28-O-α-L-鼠李吡喃糖基(1※4)-β-D-葡萄吡
喃糖基(1※6)-β-D-葡萄吡喃糖甙(cussonodide B)为
标准品 ,参阅文献[ 4-14] ,利用三萜总皂苷可与香草醛
—醋酸显色 ,采用可见分光光度法测定浙江雪胆中
总皂苷含量 ,拟为浙江雪胆的利用提供科学依据 。
1　实验
1.1　仪器与试药
1.1.1　仪器
UV-7502PC紫外可见分光光度计(上海欣茂仪
器有限公司出品),KQ-250DE型医用数控超声波清
洗器(昆山市超声仪器有限公司出品),FD-1C 冷冻
干燥机(北京德天佑科技有限公司),电热恒温水浴
锅(上海医疗器械五厂), BuchiR205增强型旋转蒸
发仪(瑞士 Buchi公司)。
1.1.2　试剂
Cussonodide B(中国科学院成都生物所天然产物
研究中心丁立生课题组无偿提供)。95%乙醇 、乙酸
乙酯(上海试剂一厂),冰醋酸(上海横信化学试剂有
限公司),高氯酸(购自上海金鹿化工有限公司),乙
醚(常熟市园化工厂),甲醇(衢州巨化试剂有限公
司),丙酮(上海试剂总厂),香草醛(中国医药(集团)
上海化学试剂公司),以上试剂均为分析纯。
1.1.3　样品
浙江雪胆于 2004 年 6月采自浙江省温州泰顺
乌岩岭 ,由温州师范学院生物与环境科学系陈贤兴
高级实验师鉴定为浙江雪胆 。自然晾干 ,粉碎 ,备
用。
1.2　测定方法的研究
1.2.1　样品总皂苷的提取分离
浙江雪胆全样干粉 20 g ,加入 100 mL 甲醇 ,超
声提取两次[ 13] ,6 h/次 ,滤渣再用甲醇回流至无色 ,
合并提取液 ,减压回收甲醇 ,浸膏置于冰箱冷冻 24
h ,取出后于低温冷冻干燥仪干燥 24 h ,即得浙江雪
胆浸膏的干燥样品 1.2 g ,精密称取 0.4 g 样品置于
索氏提取器中 ,用 100 mL乙醚回流脱脂 2 h ,挥干 ,
再加 100 mL甲醇回流至无色为止 。减压浓缩至少
量 ,上 HPD-300大孔吸附树脂用蒸馏水冲柱除去水
溶性成分后[ 3] ,再以 70%乙醇洗脱 ,收集洗脱液至
薄层显色无紫色斑点出现为止 。洗脱液用旋转蒸发
仪蒸干 ,甲醇超声溶解并定容于 50.00 mL容量瓶 ,
备用 ,即得供试品溶液。
1.2.2　最佳比色条件的选择
表 1　考察的因素及水平
Table 1　Factors and levels
因素
Factors
香草醛-冰醋酸浓度
Concentration of
vanillin-aceticacid
(%)
高氯酸用量
Perchloric
acid
(mL)
加热温度
Heating
temperature
(℃)
加热时间
Heating
time
(min)
水平 Levels A B C D
1 4 0.6 70 20
2 5 0.8 80 25
3 6 1.0 90 30
　　分别精密量取供试品 0.2 mL 9份于恒温水浴
中蒸干 ,按 L9(34)正交实验设计表[ 15]对比色条件的
四个因素和三个水平进行实验 ,各因素和水平见表
1 ,分析结果见表 2。表 2的分析结果表明 ,影响比
色条件的主次因素是 C-D-A-B(因 R3 >R4 >R1 >
R2),即加热温度 ,加热时间 ,香草醛-冰醋酸浓度 ,高
氯酸用量。最佳比色条件组合是 A3B3C3D2 ,即加入
6%香草醛-冰醋酸和 1.0 mL 高氯酸在 90 ℃的水浴
中加热 25 min。
表 2　试验方案及分析结果
Table 2　The plan and results of the test
序号No. A B C D 吸光度
Absorbance
1 1 1 1 1 0.127
2 1 2 2 2 0.277
3 1 3 3 3 0.469
4 2 1 2 3 0.297
5 2 2 3 1 0.407
6 2 3 1 2 0.229
7 3 1 3 2 0.549
8 3 2 1 3 0.233
9 3 3 2 1 0.305
K1 0.873 0.973 0.589 0.839 -
K2 0.933 0.917 0.879 1.055 -
K3 1.087 1.003 1.425 0.999 -
k1 0.291 0.324 0.196 0.280 -
k2 0.311 0.306 0.293 0.352 -
k3 0.362 0.334 0.475 0.333 -
R 0.071 0.028 0.279 0.072 -
1.2.3　标准品溶液的制备
精密称取 cussonodide B标准品10.3mg 于10.00
mL量瓶中 ,甲醇溶解并定容 , 摇匀 。再精密量取
1.00 mL于 10.00 mL量瓶中甲醇稀释至刻度 ,摇匀 ,
即得 cussonodide B 标准溶液 ,其浓度为 1.03 mg/
10.00 mL。
1.2.4　最大吸收波长的选择
量取一定量的标准品和供试品溶液分别于两支
10 mL刻度试管中 ,置于水浴中蒸干;各加新鲜配置
的 6%香草醛-冰醋酸 0.2 mL ,高氯酸1.0 mL ,密塞 ,
于 90 ℃水浴恒温加热 25 min ,取出后立即用流水冷
却 ,加乙酸乙酯至 6 mL ,摇匀;按波长扫描的操作方
法分别对标准品及供试品进行波长扫描 ,波长范围
是 400 ～ 800 nm ,标准品溶液和供试品溶液在 550 nm
处均有最大吸收峰 ,故选择 550 nm为测定波长。
1.2.5　稳定性试验
精密量取 Cussonodide B标准溶液 ,其余操作按
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1.2.4项操作 ,配制溶液 ,以试剂空白作参比 ,在 550
nm处测定吸收值(A),按时间扫描的操作方法对时
间进行扫描(仪器具备的功能),结果表明在 6 ～ 30
min内测定 ,数据稳定(见图 1)。
图 1　稳定性实验曲线
Fig.1　The absorbance curve under different time
1.2.6　标准曲线的制备
分别量取 cussonodide B 标准品 0.2 、0.4 、0.6 、
0.8 、1.0 mL 分别置于 10 mL 刻度试管中 ,按 1.2.4
项操作 ,配置各溶液。以试剂空白作参比 ,在 550
nm处分别测定吸收值(A),以吸收值A为纵坐标 ,浓
度为横坐标绘制标准曲线 ,得回归方程:A=0.03350
＊C(μg/mL)-0.06595 ,相关系数 R=0.9995(n =5),
浓度的线性范围为 3.43～ 17.17μg/mL。
1.2.7　样品测定
精密量取供试品0.2 mL 5份 ,按 1.2.4项操作 ,
配制各溶液。以试样空白作参比 ,在 550 nm处测定
各吸收值 ,并计算含量 ,结果见表 3。
表 3　浙江雪胆总皂苷含量的测定
Table 3　The results of sample determination
序号
No.
吸光度
Absorbance
总皂苷含量
Content of saponin(%)
平均含量
Average(%)
相对标准偏差
RSD(%)
1 0.442 5.69 - -
2 0.439 5.65 - -
3 0.440 5.66 5.66 0.39%
4 0.438 5.63 - -
5 0.440 5.66 - -
1.2.8　回收率试验
表 4　加样回收率(%)
Table 4　The percent recovery of the samples
样品
Sample
(mg)
加入量
Added
(mg)
测得值
Found
(mg)
回收率
Recovery
(%)
平均回收率
Average
(%)
相对标准
偏差 RSD
(%)
0.04551 0.0103 0.5571 99.03 - -
0.04551 0.0206 0.06595 99.22 - -
0.04551 0.0309 0.07671 100.97 99.29 0.99
0.04551 0.412 0.08617 98.69 - -
0.04551 0.0515 0.09625 98.52 - -
　　分别精密量取供试品 0.1 mL 6 份 , 分别加入
cussonodide B标准品溶液 0.0 、0.1 、0.2 、0.3 、0.4 、0.5
mL ,按 1.2.4项操作 ,测定各吸收值 A ,得样品的回
收率为 99.29%。结果见表 4。
2　结果与讨论
上述结果为浙江雪胆甲醇提取物总皂苷的含
量 ,经换算 ,浙江雪胆全样总皂苷的含量为 0.34%。
在对浙江雪胆的化学成分研究过程中 ,根据浙江雪
胆的化学行为结合同属植物的化学成分[ 2] ,发现其
富含皂苷 。与我们平行实验的中华雪胆相比 ,浙江
雪胆的甲醇提取物的干燥样品极易吸潮 ,而且正交
设计实验表明 ,浙江雪胆与香草醛-醋酸体系显色反
应需要更高的加热温度 ,更长的加热时间和更大的
酸度(中华雪胆与香草醛-醋酸体系显色反应的最佳
比色条件为 4%香草醛-冰醋酸 、0.80 mL 高氯酸 、70
℃的水浴中加热 20 min),这些现象说明浙江雪胆中
的皂苷含有较长的糖链 。
文献报道的已知同属植物主要成分是齐墩果烷
型和葫芦烷型化合物及其糖苷[ 2] ,在测定浙江雪胆
总皂苷含量 ,我们首先用大孔吸附树脂法得到总皂
苷[ 10] ,选用含较长糖链的齐墩果烷型的单体皂苷
(cussonodide B)作标准品 ,来测定浙江雪胆中总皂苷
含量(其他三萜皂苷类化合物与香草醛-醋酸也能发
生同样的显色反应[ 4-14])。由于浙江雪胆仅分布在
温州泰顺乌岩岭自然保护区 ,我们本着保护植物资
源出发 ,采样量有限 ,但这对浙江雪胆中单体皂苷的
分离纯化带来了困难。本文为浙江雪胆的进一步开
发利用提供了参考依据 。
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