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锈苞蒿挥发油的化学成分分析及其抗菌活性研究



全 文 :第 55卷 第 5 期
 2009 年 10 月
武汉大学学报(理学版)
J.Wuhan Univ.(Nat.Sci.Ed.)
Vol.55 No.5  
Oct.2009 , 591 ~ 596
  收稿日期:2009-03-11    通讯联系人 E-mail:zouguolin@w hu.edu .cn
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30370366 , 30670464)
作者简介:曾庆源(1975-),男 ,硕士生 ,现从事临床药学和药用植物活性成分方面的研究. E-mai l:zqy dl@t om.com
文章编号:1671-8836(2009)05-0591-06
锈苞蒿挥发油的化学成分分析及其抗菌活性研究
曾庆源1 ,2 , 朱顺英1 , 杨 扬1 , 尹 艳1 , 邹国林1
(1.武汉大学生命科学学院/病毒学国家重点实验室/武汉大学纳米科学与技术中心 ,湖北 武汉 430072;
2.武汉市第三医院 , 湖北 武汉 430060;)
  摘 要:采用滤纸片琼脂平板扩散法和微量肉汤稀释法检测了锈苞蒿挥发油对 2 种真菌和 10 种细菌(包括 5
种临床致病菌)的体外抑菌杀菌活性 , 结果显示 ,挥发油对大部分微生物均具有很好的抗菌作用 , 尤其对酵母菌 、革
兰氏阳性菌的抗菌活性更强 ,其最低抑菌浓度(minimal inhibito ry concentration , MIC)为 0.02 ~ 0.31 g/ L , 最低杀
菌浓度(minimum bacte ricidal concentration ,MBC)为 0.04 ~ 1.25 g/ L.其次利用气相色谱-质谱法(GC-MS)技术分
析了锈苞蒿挥发油的化学组成 ,确定了 28 种成分的化学结构与相对含量 , 约占挥发油总组分的 81.41%, 主要由单
萜和倍半萜组成 ,其中 Vulgarnoe B(26.58%)、1 , 8-桉叶素(19.89%)和樟脑(7.91%)是主要成分.
关 键 词:锈苞蒿;挥发油;抗菌;气相色谱-质谱法
中图分类号:R 284   文献标识码:A
0 引 言
  锈苞蒿(Artemisia imponens)为菊科春黄菊族
蒿属多年生草本植物 ,主要分布于湖北西部 、四川西
部 、云南西北部及西藏东部 ,一般生长在海拔 3 400
~ 4 700 m 附近的山坡 、林缘 、草地[ 1] .全株高 70 ~
100 cm ,和该属其他植物一样具有浓厚的特异芳香
气味 ,民间有作“艾蒿”代用品.
蒿属植物生长适应性强 ,分布极广 ,全世界约有
380余种 ,广布于北半球温带地区 , 主产亚洲和欧
洲.我国有 200多种 ,隶于 2 亚属 、7组中 ,南北各地
均有分布 ,其中约 50种在我国传统和民间医药中广
泛使用 ,对感冒咳嗽 、风湿痹痛 、跌打损伤 、活血止
血 、皮炎湿疹 、肠炎痢疾 、泌尿系统感染等有一定疗
效[ 2] .至目前全世界约有 280 种蒿属植物被研究
过[ 3] ,我国也对大量的蒿属植物进行了化学成分的
研究 ,主要集中在挥发油 、萜类 、脂肪族 、芳香族 、生
物碱等[ 4 ~ 8] .挥发油是蒿属植物的主要活性部位 ,成
分多 ,组成复杂 ,与植物种类 、产地 、生长环境等具有
密切关系 ,因其在食品工业 、化工工业 、医药工业具
有广泛的应用前景 ,故而成为人们研究的热点.
关于锈苞蒿化学成分的研究 ,迄今为止尚未见
报道.本文选择从锈苞蒿挥发油的化学组成及其体
外抑菌杀菌活性入手进行研究 ,为进一步挖掘该植
物的药用及食品香料工业应用价值提供科学资料.
1 材料与方法
1.1 材料来源和挥发油提取
锈苞蒿采自湖北省神龙架地区 ,由武汉大学生
命科学学院潘明清高工鉴定为锈苞蒿.将新鲜的锈
苞蒿茎 、叶阴干后粉碎 ,采用水蒸气蒸馏法提取其挥
发油 ,用无水 Na2SO 4干燥后于-10 ℃保存备用.正
烷烃内标为国产色谱纯 ,其余试剂均为国产分析纯.
1.2 供试菌种
标准菌株:大肠埃希氏菌 CCTCC AB91107 、鼠
伤寒沙门氏菌 CCTCC AB94010 、枯草芽孢杆菌
CCTCC AB92068 、金 黄 色 葡 萄 球 菌 CCTCC
AB91053 、金黄色葡萄球菌 CCTCC AB91118 、异常
汉逊酵母 CCTCC AY92046 、假丝酵母 CCTCC
AY91001.临床致病菌株:腐生葡萄球菌 、粪肠球菌 、
弗劳地枸橼酸杆菌 、大肠埃希氏菌 、奇异变形杆菌.
1.3 抑菌圈(DD值)的测定
采用滤纸片琼脂平板扩散法进行挥发油抑菌圈
DOI :10.14188/j.1671-8836.2009.05.020
武汉大学学报(理学版) 第 55卷
DD值的测定[ 9 , 10] .每个菌种重复 6 次测定 ,结果取
平均值.以左旋氧氟沙星为阳性对照.
1.4 最低抑菌浓度和最低杀菌浓度的测定
采用微量肉汤稀释法进行最低抑菌浓度(mini-
mal inhibi to ry concentration , MIC)和最低杀菌浓
度(minimum bactericidal concentration , MBC)的测
定[ 9 , 10] .每种菌的各个稀释度在同一块 96 孔板上设
3个平行组 ,实验重复两次.以左旋氧氟沙星为阳性
对照.
1.5 GC-MS仪器及分析条件
ThermoFinngon T race GC +T race M splu s型气
相色谱-质谱联用仪(美国 ThermoFinngon).色谱条
件:采用 2种极性不同的色谱柱(DB-5和 Innow ax ,
30 m×0 .25 mm ×0.25μm)进行分析.载气为氦气 ,
流速为1 mL/min;柱温从 50 ℃以 3 ℃/min升温至
250 ℃,然后保持 2 min;汽化室温度为220 ℃,进样
量为 1 μL ,流比 40∶1.质谱条件:离子源为 EI源 ,离
子源温度为 200 ℃;溶剂延迟 2 m in ,质量数范围为
30 ~ 400 amu.采用美国 NIS T 98数据库和挥发性
成分的GC-MS 定性谱库(Identification of essential
oil components by gas chromato graphy/quadrupole
mass spect roscopy IEOCGC-QMS)对其进行定性定
量分析.挥发油成分相对含量的确定为面积归一
化法.同时利用在 DB-5 柱总离子流色谱图上正
构烷烃内标和挥发油中各化合物的保留时间 RT
值计算出所得化合物在该柱上的保留指数 R.I.
值并与文献[ 11] 比较 ,以便更准确地确定所得化
合物.
2 结果与讨论
2.1 锈苞蒿挥发油的体外抗菌杀菌作用
抑菌杀菌实验结果表明 ,锈苞蒿挥发油对所检
测 12种微生物的生长抑制作用不同 ,在一定的范围
内具有杀菌能力 ,且 MIC 、MBC 值与抑菌圈 DD值
结果一致(见表 1).总体表现看挥发油对革兰氏阳
性菌和酵母菌比对革兰氏阴性菌的抑菌杀菌作用要
强 ,从 M IC 和 MBC结果可以看出挥发油对金黄色
葡萄球菌 CCTCC AB91053 和 AB91118 的杀菌活
性最强 ,MBC 分别为 0.04 g/L 和0 .08 g/L ,对粪肠
球菌 、腐生葡萄球菌次之 , MBC 均为 0.16 g/ L ,对
异常汉逊酵母的 MBC 为 0.3l g/L ,对假丝酵母的
M IC 为 0.08 g/L ,在实验最高浓度下挥发油对大肠
埃希氏菌 CCTCC AB91107无杀菌活性.
表 1 锈苞蒿挥发油及对照品左旋氧氟沙星的抗菌杀菌作用
微生物
锈苞蒿挥发油 左旋氧氟沙星
DDa/ mm MIC/ g·L -1 MBC/ g·L -1 DD
b
/ mm M IC/ mg·L-1 M BC/ mg·L -1
标准菌株
大肠杆菌(E.coli CCTCC AB91107) 14 2.50 — 28 3.91 3.91
枯草牙孢杆菌(B .subtilis) 15 0.63 10.00 39 0.49 0.49
鼠伤寒沙门氏菌(S.ty phi) 9 10.00 10.00 30 1.95 1.95
金黄色葡萄球菌(S.aureus CCTCC AB91053) 30 0.02 0.04 41 0.24 0.24
金黄色葡萄球菌(S.aureus CCTCC AB91118) 28 0.08 0.08 40 0.24 0.24
异常汉逊酵母(H .anomala) 19 0.31 0.31 — — —
假丝酵母(Candida sp .) 28 0.08 1.25 — — —
临床致病菌株
弗劳地枸橼酸杆菌(C.f reundil l) 9 5.00 5.00 17 34.25 34.25
大肠埃希氏菌(E.coli) 14 2.50 2.50 33 1.95 1.95
腐生葡萄球菌(S.saprophy ticus) 25 0.16 0.16 25 7.81 62.50
粪肠球菌(E.f aecalis) 23 0.16 0.16 30 3.91 3.91
奇异变形杆菌(P.mirabilis) 7 10.00 10.00 20 31.25 62.50
    DD:抑菌圈的直径.a:检测样品量为 3.00 m g;b:检测样品量为 5.00 μg
2.2 锈苞蒿挥发油的化学成分分析
锈苞蒿挥发油的得油率为 0.28%.通过各组分
的质谱碎片解离规律以及与美国 NIS T 98 数据库
以及文献中的标准图谱对照分析[ 11] ,确定了其中的
28种主要组分的化学结构与含量 ,约占挥发油总组
分的 81 .41%(结果见图 1 ,2和表 2).
  锈苞蒿挥发油主要由单萜 、氧化单萜 、倍半萜和
氧化倍半萜等组成 ,其中氧化单萜的含量尤其显著 ,
主要有 1 , 8-桉叶素(19.89%)、樟脑(7.91 %)、乙酸
龙脑酯(2.87%)、龙脑(2.06%)、顺式侧柏醇
(1.47%).桧烯(1 .92%)、对-聚伞花素(1 .91 %)、莰
烯(1.10%)则构成了单萜的主要组分.锈苞蒿中氧
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第 5 期 曾庆源 等:锈苞蒿挥发油的化学成分分析及其抗菌活性研究
图 1 锈苞蒿挥发油在 DB-5 柱上的色谱图(加标)
图 2 锈苞蒿挥发油在 INNOWAX 柱上的色谱图(未加标)
化倍半萜含量也很高(35.96%),主要有 V ulgarone
B(26.58%)、α-杜松醇(7.30%)、Heilfolen-12-al A
(syn-anti-anti)(2.08%).倍半萜含量较低 ,主要是
顺式丁香烯(0.37%).
本文所鉴定出的组分与文献报道的同组植物的
挥发油成分[ 6 ~ 8] 有较大的差异 , 如 Vulgarone B 、
Heilfolen-12-al A(syn-anti-anti)都未在文献中检
出.而在文献中报道含量较多的桉树脑 、石竹烯也未
在本文中发现 ,并且α-蒎烯 、丁香烯的含量也明显少
于文献报道.这可能与生态环境 、土壤条件及采集的
季节对其挥发油的成分的影响有很大关系.
综合上述实验结果来看 ,锈苞蒿挥发油较强的
抗菌活性应该和它高含量的组分密切相关.由于抗
真菌活性成分 1 ,8-桉叶素和 Vulgarone B 的含量很
高 ,因而对真菌有较强的抗菌作用.以前的研究也表
明 Vulgarone B是一种很强的抗真菌化合物 ,它能
够抑制 4种真菌:Colletotrichum acatatum 、C.f ra-
gariae、C.gloeosporioides和 Botry t is cinerea 的生
长[ 12] .1 ,8-桉叶素和樟脑及其衍生物则是众所周知
具有明显抗菌活性的化合物[ 13 , 14] .挥发油中其他组
593
武汉大学学报(理学版) 第 55卷
表 2 锈苞蒿茎叶挥发油化学成分组成 、含量和保留指数
化合物名称 含量/ % 实验保留指数* 参考保留指数*
单萜(M onoterpene hydrocarbons) 6.96
α-蒎烯(α-Pinene) 0.55 931 939
莰烯(Camphene) 1.10 947 954
桧烯(Sabinene) 1.92 970 975
β-蒎烯(β-Pinene) 0.35 975 979
桉叶素(脱氢)(Cineo le(dehydor-1 , 8-)) 0.77 989 991
α-萜品烯(α-Terpinene) 0.36 1 015 1 017
对-聚伞花素(P-Cymene) 1.91 1 023 1 025
氧化单萜(Oxygena ted monoterpenes) 37.73
1 , 8-桉叶素(Cineole(1 , 8-)) 19.89 1 032 1 031
蒿酮(Artemisia ketone) 0.74 1 056 1 062
蒿醇(Artemisia alcohol) 0.24 1 078 1 084
顺式侧柏醇(Thujone(Z-)) 1.47 1 105 1 102
反式侧柏醇(Thujone(E-)) 0.32 1 116 1 114
反式桧醇(Sabinol(E-)) 0.51 1 139 1 142
樟脑(Camphor) 7.91 1 146 1 146
龙脑(Bo rneo l) 2.06 1 171 1 169
萜品烯-4-醇(Terpinen-4-o l) 0.79 1 179 1 177
α-萜品醇(α-Terpineol) 0.75 1 194 1 189
反式薄荷醇(Piperitol(E-)) 0.18 1 208 1 208
乙酸龙脑酯(Bo rny l aceta te) 2.87 1 288 1 289
倍半萜(Sesquite rpene hydro ca rbons) 0.55
α-咕巴烯(α-Copaene) t 1 374 1 377
β-榄香烯(β-Elemene) t 1 387 1 391
顺式丁香烯(Ca ryophy llene(Z-)) 0.37 1 415 1 409
α-丁香烯(α-Caryophyllene) 0.18 1 451 1 455
大牦牛儿烯 D(Germacrene D) t 1 477 1 485
氧化倍半萜(Oxygena ted sesquiterpenes) 35.96
H eilfo len-12-al A(syn-anti-anti) 2.08 1 591 1 593
Vulg arone B 26.58 1 644 1 651
α-杜松醇(α-Cadinol) 7.30 1 655 1 654
其他 0.21
丁子香酚(Eugeno l) 0.21 1 352 1 359
      t:t race (<0.18%);*:所分离的化合物在DB-5柱上的保留指数
分也具有很强抗菌活性 ,如α-蒎烯对白色念珠菌的
生物合成有显著的抑制作用[ 15] , α-杜松醇对革兰氏
阴性菌和阳性菌都有较强的抑制作用[ 16] ,桧烯具有
明显的抗氧化和抗菌活性[ 17] ,萜品烯-4-醇 、α-萜品
醇等均具有很强的抗菌能力[ 18 , 19] ,而且这些微量的
成分还可以通过与其他组分的协同作用发挥抑菌的
活性[ 20] .
  至于锈苞蒿挥发油对革兰氏阳性菌比对革兰氏
阴性菌的抑菌杀菌作用要强 ,且在实验最高浓度下
对大肠杆菌无杀菌活性 ,可能与两类细菌的细胞结
构对挥发油中各单体成分的耐受性不同有关.Car-
son等[ 21] 用茶树油及其主要组分 1 , 8-桉叶素(Sig-
ma ,纯度 99%以上)、α-萜品醇(A ldrich ,纯度 98%)
的 M IC 处理金黄色葡萄球菌和大肠杆菌.结果金黄
色葡萄球菌的细胞内容物因细胞膜出现不可逆的破
坏而耗尽 ,大肠杆菌则对挥发油引起的自溶和细胞
死亡具有较强的耐受力 ,特别当大肠杆菌细胞进入
静止期 ,内膜脂肪酸组成发生改变 ,外膜脂多糖含量
增加 ,这些变化有利于大肠杆菌在恶劣条件下生
存[ 22] .类似的膜组成变化也可以解释大肠杆菌对锈
苞蒿挥发油的耐受性.当然也可能存在其他的作用
机制 ,希望今后在锈苞蒿挥发油单体 ,以及各单体的
相互作用对药物活性影响方面的研究能有所突破 ,
这样就能更清楚的解释其抗菌作用的机理.
通过对锈苞蒿挥发油及其生物活性的研究 ,发
现由于含有众多抗菌成分 ,锈苞蒿挥发油具有很好
594
第 5 期 曾庆源 等:锈苞蒿挥发油的化学成分分析及其抗菌活性研究
的抑菌杀菌作用 ,尤其是对于临床致病菌.在目前致
病菌对抗生素的耐药性日趋严重时 ,寻找新的天然
抗菌药物显得至关重要 ,锈苞蒿挥发油对临床致病
菌较强的抑菌杀菌活性表明它可以作为一种天然抗
菌药物的来源.
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  Abstract:By disc-agar dif fusion method and bro th microdilution susceptibili ty testing , the antimicro-
bial activity in vi tro of the oil w as evalua ted against 2 fungi and 10 bacteria including 5 clinical isolated
st rains.The results show ed that the oil presented a broad ant imicrobial spect rum , and had bet ter antimi-
crobial activity ag ainst microzyme and Gram-po sitive bacteria , the minimal inhibito ry concentra tion (M IC)
values w ere 0.02 ~ 0.31 g/ L and the minimum bactericidal concentrat ion (MBC)values w as 0 .04 ~ 1.25 g/
L.The essential oi l of subterranean part of Artem isia imponens was then analyzed by GC-MS .The resul ts
show that twenty-eight identified components in the oil mainly monote rpene and sesquiterpene accounts fo r
81.41% of tatal , and Vulg arnoe B(26 .58%), Cineo le(1 ,8-)(19 .89%)and Campho r(7.91%)are the key
components .
Key words:Artemisia imponens ;essential oil;antim icrobial activity;GC-MS
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