全 文 ：第 24 卷　第 3期
2002 年 5 月
北　京　林　业　大　学　学　报
JOURNAL OF BEIJING FORESTRY UNIVERSITY
Vol.24 , No.3
May , 2002
2001-10-15收稿
http: www.chinainfo.gov.cn periodical bjlydxxb
＊武汉市晨光计划项目(985003074)、华中农业大学国家作物改良重点实验室资助项目和中国科学院方向项目(KSCX2-SW-104).
第一作者:程中平 , 男 , 1963年生 ,副研究员.主要研究方向:果树栽培 、育种和遗传多样性.电话:027-87510546　传真:027-87510670　
Email:chenzp@rose.whiob.ac.cn　地址:430074湖北省武汉市洪山区东湖磨山中国科学院武汉植物研究所.
寿星桃种质资源的 RAPD分析＊
程中平 陈志伟 胡春根　邓秀新
(中国科学院武汉植物研究所) (武汉市林业果树研究所) (华中农业大学国家作物改良重点实验室)
摘要　该研究利用 RAPD技术 , 从分子生物学角度对寿星桃种质进行分析.采用从 200 个 10 碱基随机引物筛选的 22
个引物对 10个寿星桃类型的基因组 DNA进行扩增 , 通过对 180 个扩增位点的谱带的聚类 , 分析供试寿星桃的系统发
育;运用特殊谱带 , 建立了寿星桃的分子检索表;并对扩增的特殊位点进行统计 ,提出了重点保存的寿星桃种质.
关键词　寿星桃 , RAPD , 系统发育 , 分子检索表 , 重点种质保存
中图分类号　S662.1
Cheng Zhongping;Chen Zhiwei;Hu Chungen;Deng Xiuxin.Analysis of Shouxingtao germplasm revealed by
RAPD.Journal of Beijing Forestry University (2002)24(3)74 ～ 77[Ch , 11 ref.] Wuhan Institute of Botany ,
Chinese Academy of Science , Wuhan 430074 ,P.R.China.
To analyze Shouxingtaos from the angle of molecular biology , genomic DNAs of 10 types of Shouxingtao
(Amgdalus persica var.densa)were amplified by RAPD with 22 primers selected from 200 arbitrary decamer
primers.Phylogenetic relationship was analyzed through cluster of bands in 180 amplified loci.Molecular check-
ing index and conservation of key germplasms were put forward according to special bands.
Key words　Shouxingtao (Amgdalus persica var.densa), RAPD , phylogenetic relationship , molecular check-
ing index , conservation of key germplasm
　　寿星桃(Amgdalus persica var.densa)被公认为毛
桃(Amgdalus persica)内一个变种 , 植株矮小 ,根系
浅 ,作为观赏桃和栽培桃的矮化砧木;还可以用作育
种种质 ,创造新的品种及类型 ,加以开发利用[ 1 ～ 3] .
我国开展了对寿星桃种质资源的调查工作 ,在国家
桃种质资源圃已收集了一些类型 ,并且对其作了形
态及农业生物学方面的研究.近年来分子生物学的
发展 ,特别是 RAPD技术的发明[ 4 ～ 5] ,以其 DNA用量
小 、耗时少 、提供信息量多等优点 ,为更深入研究其
内在规律提供了实用的方法 , 如张春英等[ 6] 利用
RAPD技术对桃花种质资源亲缘演化关系进行了研
究.本研究采用 RAPD技术对收集 10个寿星桃类型
进行其 DNA 扩增 ,通过对扩增的 DNA谱带进行分
析 ,为寿星桃的品种识别 、系统发育及资源保存提供
分子生物学依据.
1　材料与方法
1.1　材　料
对桃属植物 203个材料的 DNA 进行了扩增.本
文着重对其中的寿星桃试材分析 ,供试材料见表 1
(沿用原全部供试桃属植物材料编号).
表 1　供试材料名录
TABLE 1　Names of the experimented materials
编号 　名称 　　采集地
I01 红重瓣 郑州果树研究所
I02 寿粉 郑州果树研究所
I03 S1 郑州果树研究所
I04 S2 郑州果树研究所
I05 S9 郑州果树研究所
I06 寿白 郑州果树研究所
I07 白单瓣 郑州果树研究所
I08 粉寿星 郑州果树研究所
I09 寿星桃(粉红) 武汉市林业果树研究所
I10 寿星桃(红色) 武汉市林业果树研究所
DOI :10.13332/j.1000-1522.2002.03.016
1.2　方　法
1.2.1　DNA提取　取采集的各桃种质幼嫩叶 1 ～ 2
片 ,剪掉叶脉 ,放入灭菌的研钵中 ,加入少量石英砂
和 700 μL 提取液[ 含 100 mmol/L Tris-HCl (pH
8.0),50 mmol L EDTA(pH 8.0),500 mmol L NaCl ,10
mmol L β-巯基乙醇 ,3%SDS] .研磨好后 ,将研磨液到
入灭菌的 1.5 mL 离心管中 ,然后在65℃水浴中保温
30 min ,取出平衡后离心 2 min(12 000 r min ,下同).
将上清液转入另一灭菌的离心管中 ,加入等体积苯
酚-氯仿(1∶1)混合液 ,上下颠倒数次 ,离心 5 min.
上清液再转入另一干净离心管 ,加入等体积氯仿 ,上
下颠倒数次 ,离心同前.上清液转入另一干净离心
管 ,然后加入 5 mol L 醋酸钠一滴和等体积的异丙
醇 ,缓慢摇匀 ,静置片刻 ,离心 2 min ,弃去液体 ,沉淀
的DNA用75%酒精加满试管 ,洗盐 1 h ,然后再换用
半管无水酒精去水 ,经干燥后 ,加入 100μL TE 液溶
解 ,加入 5 μL RNAse(5 mg μL)在 37℃水浴 30 min ,
重复上述离心过程.最后溶于 100 μL TE溶液中 ,在
紫外分光光度计测定 DNA 浓度.将原液稀释为 10
ng μL的工作液 ,保存在 4℃的冰箱中备用.
表 2　RAPD分析中所用的引物
TABLE 2　Primers with arbitrary sequence in the RAPD analysis
编号 引物碱基顺序 编号 引物碱基顺序
S17 AGGGAACGAG S125 CCGAATTCCC
S18 CCACAGCAGT S167 CAGCGACAAG
S21 CAGGCCCTTC S319 TGGCAAGGCA
S24 AATCGGGCTG S341 CCCGGCATAA
S29 GGGTAACGCC S360 AAGCGGCCTC
S43 GTCGCCGTCA S441 GGCACGTAAG
S51 AGCGCCATTG S444 AAGTCCGCTC
S60 ACCCGGTCAC S452 CAGTGCTGTG
S65 GATGACCGCC S459 GGTGCACGTT
S68 TGGACCGGTG S464 GTGTCTCAGG
S118 GAATCGGCCA S2134 AACACACGAG
1.2.2　PCR扩增及电泳检测　应用筛选的 22个引
物(表 2)进行 PCR扩增.扩增条件采用经优化的反
应体系 ,PCR反应的总体积 25 μL ,其中含 10×PCR
缓冲液 2.5 μL , MgCl2(25 mmol L)2.0 μL , dNTP(2
mmol L)2.5 μL ,Tag 酶(5 U μL)0.24 μL ,引物(16.5
ng μL)2.0 μL ,模板 DNA(10 ng μL)5.0 μL.引物购自
上海生工生物工程公司 ,PCR缓冲液 、Tag 酶 、MgCl2 、
dNTP均购自 Shanghai promega 公司.反应液混匀后 ,
在其上加一薄层矿物油.PCR扩增仪为 DNA Thermal
Cycler 480(the Perkin-Elmer Corporation ,USA).反应程
序为:93℃2 min ,36℃1 min , 72℃2 min 1 次循环;
93℃ l min ,36℃ l min ,72℃2 min ,42次循环;93℃1
min ,36℃1 min ,72℃10 min 1次循环.扩增完毕 ,在
1.4%琼脂糖凝胶上(西班牙产 ,加含 EB 0.5 μg mL)
电泳分离 ,以华美产 Lambda DNA EcoRI+Hind Ⅲ和
MBI 产Gene RulerTM 100 bp DNA Ladder Plus作Mark-
er.在紫外透射仪上观察 、照相.
1.2.3　数据记录与统计 　用 Gene RulerTM 100 bp
DNA Ladder Plus 和 Lambda DNA EcoRI+Hind Ⅲ作
分子量标记(寿星桃 、红叶桃 、垂枝桃 、碧桃 、硬肉桃 、
蜜桃 、水蜜桃 、蟠桃 、油桃 、黄肉桃等类群各取 1 ～ 2
个品种参与 Gene RulerTM 100 bp DNA Ladder Plus电
泳 ,对每一引物扩出桃中各类群这些代表品种比较
准确确定主要带的分子量 ,对其它用 Lambda DNA
EcoRI+Hind Ⅲ 作标记电泳的样品 ,可参照 100 bp
Ladder分子量标记的主要带及 Lambda DNA EcoRI+
Hind Ⅲ分子量标记带来综合确定分子量范围).将
PCR扩增中出现的清晰的带记为 1 ,不出现的记为
0 ,录入计算机 Excel表格中 ,以 NTSYS-PC 1.8 数据
软件进行分析 ,相似系数采用 Dice系数 ,最后用 UP-
GMA方法聚类.
2　结果与分析
2.1　寿星桃类型的带型识别
采用筛选的 22个随机引物对 10个寿星桃类型
的基因组 DNA 扩增分析 ,在不同引物中有多态出
现 ,粉寿星在S29引物扩出带中的S29-700 bp处较其
它寿星桃缺少一条带(图 1);红重瓣在 S17引物扩出
带中 S17-2 500 bp处少一条带(图2);S2 、寿星桃(粉
红)在S464-700 bp处较其它寿星桃少一条带 ,寿粉 、
寿白在S464-1 000 bp处多一条带(图 3).综合各引
物的扩增多态 , 得寿星桃类分子标记检索表.
J编号为碧桃　其余见表 1　
M1:Marker Lambda DNA EcoRI+Hind Ⅲ(下同)
图 1　S29引物
FIGURE 1　Primer S29
75第 3期 程中平等:寿星桃种质资源的 RAPD分析
图 2　S17引物
FIGURE 2　Primer S17
图 3　S464引物
FIGURE 3　Primer S464
寿星桃类分子标记检索表
1.有 S444-1 150 bp带 、S444-1 500 bp带 红重瓣……………
1.无 S444-1 150 bp带 、S444-1 500 bp带
　2.有 S68-1 400 bp 带 、S167-500 bp 带 寿星桃(红花…… )
　2.无 S68-1 400 bp 带 、S167-500bp 带
　　3.有 S459-1 100 bp带 S9…………………………………
　　3.无 S459-1 100 bp带
　　　4.有 S60-600 bp 带 寿粉……………………………
　　　4.无 S60-600 bp 带
　　　　5.有 S464-1 000 bp带 寿白………………………
　　　　5.无 S464-1 000 bp带
　　　　　6.有 S17-800 bp 带
　　　　　　7.有 S167-850 bp 带 S1………………………
　　　　　　7.无 S167-850 bp 带 白单瓣…………………
　　　　　6.无 S17-800 bp 带
　　　　　　　8.有 S167-850 bp 带 粉寿星………………
　　　　　　　8.无 S167-850 bp 带
　　　　　　　　9.无 S21-1 200 bp 带 S2…………………
　　　　　　　　9.有 S21-1 200 bp 带 寿星桃(粉红…… )
2.2　寿星桃聚类分析
通过 180个位点上的 RAPD标记带得到的聚类
图(图 4).在 0.894处作为接合线时 ,可明显将寿星
桃划为 3类 ,即:第 1类为寿星桃(红花)、寿星桃(粉
红);第2类为S9 、寿白 、白单瓣 、粉寿星;第3类为红
重瓣 、寿粉 、S1 、S2.第 3类的 S1 、S2的相似系数在全
部 10个寿星桃中最大.
图 4　寿星桃类的聚类图
FIGURE 4　Cluster of Shouxingtao(Amgdalus persica var.densa)
2.3　多态带数和特殊位点及重点保存种质
从表 3多态带数看 ,均在 100 ～ 107 条之间 ,其
中红重瓣 、S1 、寿白 、寿星桃(红花)虽然它们的多态
带数相等 ,但除红重瓣和 S1外 ,其它未聚到一个类 ,
说明它们之间有特殊带的存在.
经过特殊带分析 ,红重瓣独占 4个位点 ,寿星桃
(粉红)独占 2个位点 ,特殊带总数也分列第一和第
二 ,寿粉也有特殊带的存在.除优先考虑特殊位点
外 ,多态带数也值得考虑 ,故在保存这些供试的寿星
桃种质时 ,首先考虑的是红重瓣 、寿星桃(粉红),其
次则是寿粉 、白单瓣等种质.
3　讨　　论
关于 RAPD扩增产物的稳定性 ,汪小全等[ 7] 进
行了不同浓度的模板 DNA和干鲜叶的模板 DNA比
较 ,证明 RAPD产物具有很好的重复性;N.F.Weeden
等[ 8] 对扩增反应系统中成分的浓度范围进行了比较
试验 ,其结果认为模板 、引物及镁离子在一定范畴内
的变化都不会引起 RAPD扩增产物的变化.笔者也
进行了同一品种不同时间同一程序提取的 DNA 的
扩增试验 ,其结果是同一品种即使不同时间或不在
同一批次扩增 ,采用同一反应体系 ,得到的 DNA 扩
增带是一样的 ,其试验结果已在发表的论文中报
道[ 9] .笔者还采用同一引物对Warburton[ 10] 用集团分
离法(BSA)得到的桃粘离核的连锁标记进行了验
证 ,虽然和他的反应体系不一样 ,但同样得到了粘离
核在 1 500 bp分离带.可见在进行扩增时 ,如果控制
在同一反应体系条件下 ,得到的结果是稳定的.笔者
在对已知的遗传背景桃属中种间杂种同桃属中的种
进行聚类分析 ,得到的聚类位置与其遗传背景资料
极为相符[ 11] .由此说明 RAPD技术对系统发育的位
置确定也是可信的.
76 北　京　林　业　大　学　学　报 第 24卷　
表 3　多态带数及特殊位点
TABLE 3　Polymorphoric band and special locus
编号 名称 多态带数
特殊位点
S464-650bp S68-1400 bp S167-1 500 bp S60-600bp S444-600bp S444-1250 bp S444-1500 bp
该样独占位点
I01 红重瓣 107 1 0 0 0 1 1 1 4
I02 寿粉 101 0 0 0 1 0 0 0 1
I03 S1 107 0 0 0 0 0 0 0 0
I04 S2 105 0 0 0 0 0 0 0 0
I05 S9 104 0 0 0 0 0 0 0 0
I06 寿白 107 0 0 0 0 0 0 0 0
I07 白单瓣 103 0 0 0 0 0 0 0 0
I08 粉寿星 101 0 0 0 0 0 0 0 0
I09 寿星桃(粉红) 107 0 1 1 0 0 0 0 2
I10 寿星桃(红色) 100 0 0 0 0 0 0 0 0
　　本研究对 10个寿星桃类型作 RAPD分析 ,所采
用的筛选 22个引物 ,每个引物都能扩出一个或几个
供试材料的特殊带 ,利用此特殊带可以建立分子检
索表 ,从分子生物学方面为寿星桃的类型识别提供
了又一方法.对于寿星桃类型的遗传背景不十分清
楚的情形 ,可从聚类分析提示其系统发育关系.对过
去仅凭外观形态表现出的差异 ,提出重点保存种质
的方法 ,虽然较直观 ,但由于它是与环境共同作用的
结果 ,有的性状可能还未在适合的环境中得到完全
表达 ,有的用肉眼也难以区分.从遗传物质 DNA本
身进行研究 ,可为寿星桃种质的识别 、保存和利用提
供了分子生物学依据.
致谢　承蒙中国农业科学院郑州果树研究所朱更瑞先生 、江苏省园
艺所郭洪先生 、北京市林果所姜全先生及其他同仁提供试材和资
料 ,在此一并致谢.
参 考 文 献
1 　俞德浚.中国果树分类学.北京:农业出版社 ,1979.42～ 43
2 　吴耕民.中国温带果树分类学.北京:农业出版社 , 1984.139 ～
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3 　王宇霖.落叶果树种类学.北京:农业出版社 , 1988.251～ 268
4 　Welsh J , McClelland M.Fingerprinting genomes using PCR with arbi-
trary primers.Nucleic Acids Research , 1990 , 18:7 213～ 7 218
5　Willimas Jonh G K , Kubelik A R , Livak K J , et al.DNA ploypho-
risms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers.Nu-
cleic Acids Res , 1990 , 18:6 531～ 6 536
6 　张春英 ,林同香 ,戴思兰 ,等.桃花种质资源亲缘关系的研究———
RAPD分析.北京林业大学学报 , 1999 , 21(5):26～ 31
7 　汪小全 ,邹喻苹 ,张大明 ,等.RAPD应用于遗传多样性和系统学
研究中的问题.植物学报 , 1996 ,38(12):954～ 962
8 　Weeden N F , Timmerman G M , Hemmat M , et al.Inheritance and re-
liability of RAPD markers.Joint Plant Breeding Symposia Series.Appli-
cations of RAPD Technology to Plant Breeding.Minneapolis , Minneso-
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析.湖北农业科学 , 2001(3):41～ 43
10　Warburton M L , Becerra-VelasguezV L , Goff reda J C , et al.Utility of
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11　程中平 ,陈志伟 ,胡春根 ,等.利用 RAPD技术对新疆桃分类地位
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(责任编辑　董晓燕)
77第 3期 程中平等:寿星桃种质资源的 RAPD分析