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臭蒿水乳剂抗烟草黑胫病的作用



全 文 :第38卷第1期
2016年1月
湖北大学学报(自然科学版)
Journal of Hubei University(Natural Science)
Vol.38 No.1 
Jan.,2016 
收稿日期:2015-04-23
基金项目:国家烟草专卖局重点科技项目(110201302015)资助
作者简介:徐清辉(1988-),男,硕士生,E-mail:476019158@qq.com;胡国元,通信作者,教授,E-mail:hgy701@163.com;杨春雷,
通信作者,研究员,E-mail:ycl193737@163.com
文章编号:1000-2375(2016)01-0050-06
臭蒿水乳剂抗烟草黑胫病的作用
徐清辉1,胡国元1,杨春雷2,余君2,杨锦鹏2
(1.武汉工程大学化工与制药学院,湖北 武汉430074;2.湖北省烟草科学研究院,湖北 武汉430030)
摘要:采用菌丝生长速率法,测定臭蒿水乳剂对烟草疫霉菌丝生长的毒力及其药效稳定性;采用菌丝块诱导孢子囊
产生法测定臭蒿水乳剂对烟草疫霉孢子囊抑制的毒力;最后对盆栽防效结果进行探讨.结果表明,低浓度臭蒿水乳剂对
烟草疫霉菌丝生长和孢子囊的产生均有明显抑制作用,对烟草疫霉菌丝生长抑制的EC50和EC90值分别为5.93g·L-1、
52.56g·L-1,其对烟草疫霉菌丝生长的抑制作用具有良好的pH值稳定性、光稳定性、热稳定性以及贮藏稳定性;对烟
草疫霉孢子囊产生抑制的EC50、EC90值分别为6.56g·L-1,65.22g·L-1.盆栽防效及对烟草幼苗生长影响实验表明,
22d其对烟草黑胫病的防效为56.2%,且对烟草幼苗生长几乎没有影响.
关键词:臭蒿;烟草疫霉;毒力测定;稳定性;防效
中图分类号:Q936  文献标志码:A  DOI:10.3969/j.issn.1000-2375.2016.01.010
Inhibition activity of Artemisia hedini emulsion in water
against tobacco black shank disease
XU Qinghui 1,HU Guoyuan1,YANG Chunlei 2,YU Jun2,YANG Jinpeng2
(1.School of Chemical Engineering and Pharmacy,Wuhan Institute of Technology,Wuhan 430074,China;
2.Tobacco Research Institute of Hubei Province,Wuhan 430030,China)
Abstract:The toxicity and the efficacy stability of Artemisia hedinii Ostenf.et Pauls.emulsion in
water to mycelial growth of Phytophthora parasitica var.nicotianae were measured by means of the
methods of mycelium growth rate,and the toxicity of A.hedinii emulsion in water to P.parasitica
sporangium generation were determined by inducing sporangia formation method,and the potted plant
control effect were studied in this paper.The results showed that the low concentration A.hedinii
emulsion in water had obvious inhibitory effect to P.Parasitica mycelial growth and sporangium
production,the value of EC50and EC90to mycelial growth of P.parasitica were 5.93g·L-1 and
52.56g·L-1.The emulsion in water fromA.hedinii had a good pH stability,light stability,thermal
stability and storage stability on the inhibition of mycelial growth of P.Parasitica.The value of EC50
and EC90to inhibit sporangia formation of P.parasitica were 6.56g·L-1 and 65.22g·L-1.The
potted plant control effect and influence of tobacco seedlings growth experiment of the emulsion in
water from A.hedinii showed that the control effect of the emulsion in water to P.parasitica was
56.2%in 22d,and the emulsion in water fromA.hedini had almost no efect to tobacco seedling growth.
Key words:Artemisia hedinii Ostenf.et Pauls.;Phytophthora parasitica var.nicotianae;toxicity
measurement;stability;control effect
第1期 徐清辉,等:臭蒿水乳剂抗烟草黑胫病的作用 51 
0 引言
烟草黑胫病是烟草种植行业上一种毁灭性的真菌性病害,高温高湿环境,极易发病.发病时常常引
起“碎倒”症状,造成烟苗成片腐烂[1].目前,植物源杀菌剂在烟草黑胫病上的防治利用报道比较多,印度
研究者发现兰香、桉树、蒌叶3种植物叶片抽提物的10%水溶液对黑胫病菌的抑制率达到84.4%~
86.5%[2];杨晓凡[3]等发现2种中草药的提取物对烟草黑胫病菌有明显的抑制效果;赖荣泉等[4]研究发
现大蒜的水提物和乙醇浸出物对烟草黑胫病菌的抑制率高达100%.
臭蒿(Artemisia hedinii Ostenf.et Pauls.)为一年生草本,植株有浓烈臭味.具有有清热、解毒、凉
血、消炎、除湿之效,有报道其对粘虫有杀虫作用[5].张芊等[6]发现低浓度臭蒿醇提液对烟草黑胫病菌的
菌丝具有良好的抑制效果,本研究探索了臭蒿醇提液的适宜剂型,并对其抗烟草黑胫病的作用进行了初
步研究.
1 实验
1.1 实验材料、试剂及培养基 臭蒿,植物材料,选取地上部分,主要为叶和茎;鄂烟一号,供试植物;均
由湖北烟草科学研究院提供.烟草疫霉(Phytophthora parasitica var.nicotianae)由湖北省烟草科学研
究院提供.无水乙醇、吐温-80、蔗糖、七水硫酸亚铁、四水氯化锰、七水硫酸锌,均为分析纯;琼脂
(040010,日本)等.燕麦琼脂(OA)培养基[6],用于烟草疫霉菌的活化与培养.
1.2 实验方法
1.2.1 臭蒿的提取以及水乳剂的研制
1.2.1.1 植物材料的预处理 将臭蒿的茎和叶40℃烘干,粉碎过孔径为0.15mm筛子(100目),贮存
于棕色瓶中,置于干燥器中,备用.
1.2.1.2 植物材料的浸提 取预处理后的臭蒿20g于锥形瓶中,加入100mL无水乙醇,密封后于恒
温(40℃)摇床中震荡浸提3d,经布氏漏斗加压抽提后,利用旋转蒸发仪40℃减压浓缩[7-8]至25mL.
1.2.1.3 水乳剂的研制 在浓缩液中加入25mL蒸馏水和2mL吐温-80,90℃水浴下加热0.5h使乙醇挥
发,同时剧烈振荡使之乳化[9],补加蒸馏水至总体积为25mL后,超声波处理5min,制得含药浓度为
800g·L-1的臭蒿乙醇提取物水乳剂,贴上标签,注明药液名称、浓度和时间,密封保藏于冰箱(4℃)中,备用.
1.2.2 臭蒿水乳剂的毒力测定
1.2.2.1 菌丝生长速率法 向OA培养基内加入备用的臭蒿水乳剂,制成一定质量浓度的含药培养基
平板,每组设5个重复,对照组加同体积的乳化剂溶液.然后在培养皿中心接种直径7.68mm的烟草疫
霉的菌饼.于恒温培养箱中28℃恒温培养,在144h后观察记录菌丝生长情况,十字交叉法测量菌落生
长直径.用下述公式计算菌丝生长抑制率[6].
菌丝生长抑制率/% =(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-菌饼直径)×100.
1.2.2.2 菌丝块诱导烟草疫霉孢子囊产生法 采用菌丝块诱导孢子囊产生法[10],在超净台中,挑取生
长28d的烟草疫霉菌丝块(直径7.68mm),放入灭菌培养皿中,每皿6块,菌丝面朝上,然后向皿中加
入备用的臭蒿水乳剂和0.1%KNO3 溶液,制成一定质量浓度的含药溶液,对照组只加0.1%KNO3 溶
液,实验组和对照组体积均为10mL,置于28℃恒温培养箱中培养.3d后在显微镜(低倍镜:10×10)
下观察各组孢子囊产生情况[10-11].
孢子囊抑制率/%=(对照组孢子囊数量-处理孢子囊数量)/对照组孢子囊数量×100.
1.2.2.3 臭蒿水乳剂对烟草疫霉菌丝生长或孢子囊产生的毒力测定 根据倍比稀释法的原则,在一定
范围内设置5组药剂浓度梯度值,并采用菌丝生长速率法或菌丝块诱导孢子囊产生法测定每组对应的
抑制效果.利用浓度梯度值(X)和菌丝生长抑制率或孢子囊抑制率的机率值(Y),用Excel2012软件拟
合直线毒力回归方程,并求出抑制率达到50%和90%时所对应臭蒿水乳剂的浓度值EC50值和EC90
值[12],以评价臭蒿水乳剂对烟草疫霉菌丝生长或孢子囊产生的毒力大小.
52  湖北大学学报(自然科学版) 第38卷
1.2.3 臭蒿水乳剂的稳定性
1.2.3.1 pH稳定性 将配制好的已灭菌的OA培养基置于微波炉中融化,待其冷却至60℃左右,于
超净工作台中无菌操作,在培养基凝固前用1mol·L-1 HCl或1mol·L-1 NaOH调节4组的pH,使
pH值为6.0,7.0,8.0,9.0[12-13].然后将配置好的臭蒿水乳剂(800g·L-1)加入培养基中,使其在培养
基中的浓度为25g·L-1.之后操作同1.2.2.1.
1.2.3.2 热稳定性 分别量取一定量的臭蒿水乳剂置于烘箱中,并调节温度为100,110,120℃[12-13],
不同温度处理20min后.然后将处理后的臭蒿水乳剂(800g·L-1)加入培养基中,使其在培养基中的
浓度为25g·L-1.之后操作同1.2.2.1.
1.2.3.3 光稳定性 分别量取一定量的臭蒿水乳剂置于超净工作台上,以功率为30W 的紫外灯分别
处理15,30,45min,和60min,药液距紫外光源的距离约50cm[12,13].然后将处理后的臭蒿水乳剂(800
g·L-1)加入培养基中,使其在培养基中的浓度为25g·L-1.之后操作同1.2.2.1.
1.2.3.4 贮藏稳定性 分别量取一定量的臭蒿水乳剂置于室温(18~25℃)保存[13]30,60,90d,和120
d.然后将处理后的臭蒿水乳剂(800g·L-1)加入培养基中,使其在培养基中的浓度为25g·L-1.之后
操作同1.2.2.1.
1.3 盆栽防效实验 采用随机组合方案,实验共设4个处理:空白对照组1(无菌水);溶剂对照组2
(吐温-80溶液);加药组3(臭蒿水乳剂);阳性对照组4(农药甲霜灵500倍稀释液).供试烟草品种为:鄂
烟1号(烟龄为90d),实验地点为武汉工程大学.接种前2d对各组施加相对应的药剂,50mL/株,将已
配好的孢子悬液[10]注射到烟株茎基部,注射1mL/株.在接种黑胫病孢子后,保持室内温度不低于28
℃,相对湿度大于90%,时间保持在3~5d.接种后每隔4d于当天下午对烟苗定时进行灌根施药和发
病情况的调查.参考GB/T 23222-2008烟草病虫害分级及调查方法[14],统计烟草黑胫病发病分级情况,
同时参考GB/T 23223-2008烟草病害药效实验方法计算药效[15].
药效计算方法:
1)病情指数=[Σ(各级病株数或叶数×该病级值)]/(调查总株数或叶数×最高级值)×100,
2)防效效果=(空白对照区病指数-处理区病指数)/(空白对照区病指数)×100%.
1.4 臭蒿水乳剂对烟草幼苗生长的影响实验 设置2组分别为实验组1和空白组0,实验组1施加浓
度为100g·L-1臭蒿水乳剂,空白组0施加无菌水为空白对照,约10mL/株,每处理10株.以鄂烟一号
为供试植物,当幼苗长至6~8叶期喷药处理,第一次喷药前测株高,每隔7d喷药l次,每次喷药前测量
株高,共测4次,分析株高和形态变化情况,以及各处理株高与对照组相比是否存在显著性差异等[16].
培养条件为:28℃,光照时长16h/d,光照强度6 000 1x,相对湿度85%,于人工气候箱里培养,每
天浇适量的水并且每10d施一次 Honglands全营养液.
1.5 数据处理 采用Excel2012软件进行数据分析.
2 结果和分析
2.1 臭蒿水乳剂的毒力
2.1.1 臭蒿水乳剂对烟草疫疫霉菌丝生长的毒力 由表1和图1可知,随着臭蒿水乳剂浓度的提高,
其对烟草疫霉菌丝生长抑制作用也在增强.在144h,臭蒿水乳剂浓度在6.25g·L-1以上,对烟草疫霉
菌丝生长抑制作用均保持在50%以上.
表1 144h不同浓度臭蒿水乳剂对烟草疫霉菌丝生长的毒力
浓度/g·L-1 培养时间/h
菌落直径/mm
对照组 加药组
抑菌率/%
50.000  144h 70.42±0.85  18.23±0.39  83.18
25.000  144h 71.63±0.77  24.44±0.86  73.79
12.500  144h 73.00±0.61  33.45±0.60  60.55
6.250  144h 71.50±1.56  37.78±0.90  52.83
3.125  144h 70.21±1.32  46.88±0.65  37.31
第1期 徐清辉,等:臭蒿水乳剂抗烟草黑胫病的作用 53 
图1 不同浓度臭蒿水乳剂对烟草疫霉菌丝生长的毒力
1、2、3、4、5中CH水乳剂浓度分别为50、25、12.5、6.25、3.125g·L-1
1、2、3、4、5中左图为实验组,右图为对照组
 
表2 不同浓度臭蒿水乳剂对烟草疫霉孢子囊
数量产生的影响
水乳剂浓度/
(g·L-1)
孢子囊数/个
对照组 实验组
孢子囊抑制率/

5  27  16  40.74
10  27  13  51.85
20  27  9  66.67
40  27  6  77.78
80  27  1  96.29
  由表2可以得出,臭蒿水乳剂对烟草疫霉菌丝生长
的毒力回归方程为Y=0.857 8X+44.912 0,相关系数r
=0.913 2,由毒力回归方程计算出来的EC50值为5.93
g·L-1、EC90值为52.56g·L-1.
2.1.2 臭蒿水乳剂对烟草疫霉孢子囊产生的毒力 由
表2和图2可知,随着臭蒿水乳剂浓度的提高,其对烟草
疫霉菌孢子囊产生的抑制作用也在增强.根据表2可以
算出,不同浓度臭蒿水乳剂对烟草疫霉孢子囊产生抑制
的毒力回归方程为Y=0.681 9 X+45.526 0,相关系数
r=0.956 0.由毒力回归方程计算出来的EC50、EC90分别
为6.56、65.22g·L-1.
图2 不同浓度臭蒿水乳剂对烟草疫霉孢子囊数量产生的影响
1、2、3、4、5、6浓度分别为0、5、10、20、40、80g·L-1 
2.2 臭蒿水乳剂的稳定性测定
2.2.1 pH值的稳定性 结果如图3,臭蒿水乳剂浓度在25g·L-1时,在培养基pH 值为6~9范围
内,对烟草疫霉菌丝生长的抑制活性基本一致,均保持在70%以上.
2.2.2 热稳定性 由图4可知,臭蒿水乳剂在温度100、110、120℃的抑菌活性比较稳定,且经过100
℃处理20min的抑菌活性略高于其他各组,其次抑菌活性最高的是未经处理的水乳剂.
图3 不同pH值臭蒿水乳剂
对烟草疫霉菌丝生长的影响
 
    
图4 不同温度处理后的水乳剂
对烟草疫霉菌丝生长的影响
 
2.2.3 光稳定性 从图5可知,120h,在紫外光照射0~60min范围内,各处理组和未经处理组抑菌
活性均保持在75%左右可知,紫外光照射对水乳剂活性影响不大.在72h,浓度25g·L-1的水乳剂在
紫外光下分别处理15、30、45、60min时,对烟草疫霉的抑制率分别为83.39%、81.12%、80.47%、
78.28%均略高于同浓度未经紫外光处理的水乳剂对烟草疫霉的抑制率75.83%.在120h时,各组对烟
54  湖北大学学报(自然科学版) 第38卷
草疫霉菌丝的抑菌率大致接近.
2.2.4 贮藏稳定性 由图6可知,随着时间的延长水乳剂的活性逐渐降低,保存30、60、90d的水乳剂
在144h的抑菌率分别78%,74.01%,69.31%.但水乳剂90d和120d的抑菌率相差不大,抑菌活性基
本稳定.也就是说在0~90d之间可能部分抑菌活性物质不稳定或者分解,导致其活性降低,90~120d
的抑菌活性基本维持在70%.
图5 不同紫外光照射时间的臭蒿水乳剂
对烟草疫霉菌丝生长的影响
 
    
图6 室温不同贮藏时间臭蒿水乳剂
对烟草疫霉菌丝的生长的影响
 
2.3 臭蒿水乳剂的盆栽防效实验 由表3可知,试验中化学农药甲霜灵对烟草黑胫病的防治效果很
好,几乎对烟草黑胫病的防治达到100%.臭蒿水乳剂对烟草黑胫具有防治的效果但低于甲霜灵的防治
效果,同时,从病指来看,对照组病情指数呈现上升趋势,而实验组病情指数出现下降趋势,同时也从侧
面说明该水乳剂对烟草黑胫病的病情具有抑制作用.实验中,发现实验组植株发病的病斑并无扩大趋势
和发病初期形成的病斑大小大致相同,这说明有部分植株已经痊愈,更深层反映该水乳剂对烟草黑胫病
可能有一定的治疗作用.
表3 不同时间各处理组对烟草黑胫病的防治效果
发病天数
不同组烟草黑胫病发生的病情指数
1  2  3  4
烟草黑胫防治效果
1  2  3
10d 60.0  68.0  46.7  0  22.2% 31.3% 100%
14d 64.4  76.0  46.7  0  44.1% 38.5% 100%
18d 73.3  76.0  46.7  0  50.9% 38.5% 100%
22d 82.2  76.1  36.0  0  56.2% 38.5% 100%
防效1为加药组3(水乳剂组)以组1(无菌水组)为对照的防效,防效2为加药组3(水乳剂组)以组
2(吐温-80组)为对照防效,防效3为阳性对照组4(农药组)以组1(无菌水组)为对照的防效.
图7 不同施药时间臭蒿水乳剂对烟草幼苗生长状况的影响
0代表空白组、1代表臭蒿水乳剂组
 
2.4 臭蒿水乳剂对烟草幼苗的影响 由表4和图7可知,空白对照组烟苗和实验组烟苗平均增长率在
0~21d,大致相同,但空白对照烟苗株高平均增长率稍高于实验组.由图8可知,21d时,实验组烟叶有
稍许变黄,占总叶数的10%以下,推测原因可能是施药浓度过大,也可能施药频率过高或者其他原因造
成.综合表4和图8,推测施加100g·L-1的臭蒿水乳剂对烟苗生长基本不造成危害.
第1期 徐清辉,等:臭蒿水乳剂抗烟草黑胫病的作用 55 
表4 不同施药时间臭蒿水乳剂对烟苗株高生长的影响
组别 喷药天数 株高平均值 增长率/% 平均增长率/%


 0  10.29  0
 7  11.52  11.94
14  12.87  11.66
21  14.36  11.62
 0  11.52  0
 7  12.72  10.36
14  14.07  10.61
21  15.51  10.23
11.74
10.40
3 结语
1)通过毒力测定,得出144h时臭蒿水乳剂对烟草疫霉菌丝生长的抑菌率,由其拟合的毒力回归方
程计算出其EC50为5.93g·L-1,同时由不同浓度臭蒿水乳剂对烟草疫霉孢囊产生抑制的毒力回归方
程计算出其EC50为6.56g·L-1.上述结果说明低浓度臭蒿水乳剂对烟草黑胫病病原菌具有很好的抑
制作用.
2)稳定性实验结果表明该水乳剂具有良好的稳定性,尤其是光稳定性和常温贮藏稳定性比较好.
作为农药使用的植物提取物,可能存在储存中的氧化问题,最典型的例子是天然除虫菊素,由于光稳定
性差而限制其在大田农作物上的应用,由于该水乳剂光稳定性比较好,且在很长时间内依然保持很高抑
菌率,故其有开发成大田使用的植物源农药的潜能.
3)臭蒿水乳剂22d对烟草黑胫病的防效为56.2%,盆栽防效实验表明其对烟草黑胫病具有一定
防治效果和治疗效果,同时由烟苗生长影响实验结果说明臭蒿水乳剂对烟苗基本不造成危害.
上述对烟草黑胫病的药效实验结果表明臭蒿水乳剂具有较高的抑菌活性,且对烟苗基本不造成伤害.
在烟草生长周期内保持较高抑菌活性,且具有良好的光稳定性,因此,用臭蒿水乳剂来防治烟草作物病害,
不仅能高效地防治病害的发生,且符合环保、健康、持续发展的理念,后续可以考虑进一步改进该植物源杀
菌剂剂型,将其广泛地应用于烟区,生产高品质、无残留的烟叶,降低农药残留对人身体造成的危害.
4 参考文献
[1]孔凡玉,朱贤朝,石金开,等.我国烟草侵染性病害发生趋势及防治对策[J].中国烟草,1995(1):31-34.
[2]Patel D N,Patel B N.Evalution of plant extracts and Trichoderma harzianum Rifai against Phytophthora parasitica
var nicotianae[J].Tobacco Research,1999,25(1):4-8.
[3]杨晓凡,花日茂,吴祥为,等.抗烟草黑胫病菌的植物源杀菌剂的筛选研究[J].安徽农业大学学报,2006,33(2):189-191.
[4]赖荣泉,姜林灿,陈志敏,等.大蒜粗提物对烟草黑胫病菌的室内抑制作用[J].烟草科技,2009(9):62-64.
[5]李刚.臭蒿对粘虫的生物活性及杀虫成分的分离鉴定[D].甘肃:甘肃农业大学,2008.
[6]张芊.臭蒿茎叶中抑菌活性成分研究[D].武汉:武汉工程大学,2014.
[7]李超影,胡国元,胡坚,等.艾蒿提取物对烟草病原菌的抑制作用[J].湖北大学学报:自然科学版,2013,35(4):469-473.
[8]李超影.箬竹叶提取物对烟草病原菌的抑制[D].武汉:武汉工程大学,2013.
[9]江茂生.艾蒿提取物对植物病原菌的抑制活性研究[D].福州:福建农林大学,2007.
[10]杨建卿,江彤,陈学平,等.烟草疫霉菌的培养及大量产生游动孢子囊和游动孢子方法的研究[J].植物保护,2001,27
(4):12-14.
[11]刘晓娇.拮抗放线菌对烟草黑胫病的控制研究[D].重庆:西南大学,2011.
[12]胡坚.箬竹叶提取物对烟草病原菌的抑制[D].武汉:武汉工程大学,2013.
[13]卢金清,王琴,何冬黎,等.两种植物源农药对烟草赤星病的药效试验[J].湖北农业科学,2011,50(6):1155-1157.
[14]GB/T 23222-2008,烟草病虫害分级及调查方法[S].北京:中国标准出版社,2009.
[15]GB/T 23223-2008,烟草病虫害药效试验方法[S].北京:中国标准出版社,2009.
[16]李永刚.一种植物源杀菌剂的研制及其在番茄叶霉防治中的应用[D].哈尔滨:东北农业大学,2003.
(责任编辑 游俊)