全 文 ：［基金项目］国家自然科学基金（编号：８１４６０６３８，８１３６０６７１）　［作者简介］胡娜，女，硕士研究生，研究方向：临床检验诊断学，电话：０９９３－
２８５５８２７，Ｅ－ｍａｉｌ：１４４１５９９８６９＠ｑｑ．ｃｏｍ　［通讯作者］曹文疆，男，副主任技师，电话：０９９３－２８５５８２８，Ｅ－ｍａｉｌ：ｃｗｊｗｘｃ＠１６３．ｃｏｍ；程江，男，主任技
师，研究方向：临床检验诊断学，电话：０９９３－２８５５８２７，Ｅ－ｍａｉｌ：ｊｙｋ６８５７＠ｖｉｐ．１６３．ｃｏｍ
香青兰总黄酮对血管紧张素Ⅱ诱导血管平滑肌细胞增殖与迁移的影响
胡娜１，曹文疆１，２，袁勇２，王新春２，王洋洋２，王艳芳２，程江１，２　 （１．石河子大学医学院，新疆 石河子８３２００２；２．石河子
大学医学院一附院，新疆 石河子８３２００８）
［摘要］　目的：研究香青兰总黄酮对血管紧张素Ⅱ（ＡｎｇⅡ）诱导的大鼠主动脉血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣ）增殖与迁移的作用。
方法：采用贴壁法培养大鼠胸主动脉平滑肌细胞，以 ＡｎｇⅡ 为诱导剂，建立 ＶＳＭＣ细胞增殖的模型，分别应用质量浓度为
１０－７　ｍｏｌ·Ｌ－１　ＡｎｇⅡ以及ＡｎｇⅡ＋不同浓度香青兰总黄酮组（２５，５０，１００　ｍｇ·Ｌ－１）作用２４　ｈ，并设空白对照组进行比较。采
用 ＭＴＴ法检测细胞的增殖；ｔｒａｎｓｗｅｌ法检测细胞的迁移；免疫组化法检测细胞内增殖细胞核抗原（ＰＣＮＡ）的表达水平。结
果：与对照组比较，ＡｎｇⅡ组能显著刺激大鼠ＶＳＭＣ的增殖和迁移，香青兰总黄酮不同剂量组联合ＡｎｇⅡ可在一定程度上抑
制ＡｎｇⅡ诱导的ＶＳＭＣ增殖，迁移以及细胞内ＰＣＮＡ的表达，且呈现一定的剂量依赖关系趋势。结论：香青兰总黄酮具有抑
制ＡｎｇⅡ诱导ＶＳＭＣ增殖与迁移的作用。
［关键词］　香青兰总黄酮；血管紧张素Ⅱ；血管平滑肌细胞；增殖；迁移
［中图分类号］Ｒ２８５．５　［文献标识码］Ａ　［文章编号］１００１－５２１３（２０１６）０７－０５４０－０４　ＤＯＩ：１０．１３２８６／ｊ．ｃｎｋｉ．ｃｈｉｎｈｏｓｐｐｈａｒｍａｃｙｊ．２０１６．０７．０５
Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｄｒａｃｏｃｅｐｈａｌｕｍ　ｔｏｔａｌ　ｆｌａｖｏｎｅｓ　ａｇａｉｎｓｔ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｍｉｇｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｖａｓｃｕｌａｒ
ｓｍｏｏｔｈ　ｍｕｓｃｌｅ　ｃｅｌｓ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ＡｎｇⅡ
ＨＵ　Ｎａ１，ＣＡＯ　Ｗｅｎ－ｊｉａｎｇ１，２，ＹＵＡＮ　Ｙｏｎｇ２，ＷＡＮＧ　Ｘｉｎ－ｃｈｕｎ２，ＷＡＮＧ　Ｙａｎｇ－ｙａｎｇ２，ＷＡＮＧ　Ｙａｎ－ｆａｎｇ２，
ＣＨＥＮＧ　Ｊｉａｎｇ１，２（１．Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｅｇｅ，Ｓｈｉｈｅｚｉ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉｎｊｉａｎｇ　Ｓｈｉｈｅｚｉ　８３２０００，Ｃｈｉｎａ；２．Ｔｈｅ　Ｆｉｒｓｔ　Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ
Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｅｇｅ，Ｓｈｉｈｅｚｉ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉｎｊｉａｎｇ　Ｓｈｉｈｅｚｈｉ　８３２００８，Ｃｈｉｎａ）
ＡＢＳＴＲＡＣＴ：ＯＢＪＥＣＴＩＶＥ　Ｔｏ　ｅｘｐｌｏｒｅ　ｔｈｅ　ｐｏｓｓｉｂｌｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｔｉｌｉａｎｉｎ　ｂｙ　ｏｂｓｅｒｖｉｎｇ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ
Ｄｒａｃｏｃｅｐｈａｌｕｍ　ｔｏｔａｌ　ｆｌａｖｏｅｓ　ｏｎ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｍｉｇｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒａｔ　ｖａｓｃｕｌａｒ　ｓｍｏｏｔｈ　ｍｕｓｃｌｅ　ｃｅｌｓ（ＶＳＭＣｓ）ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ＡｎｇⅡ．
ＭＥＴＨＯＤＳ　ＶＳＭＣ　ｗｅｒｅ　ｐｒｉｍａｒｙ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｂｙ　ｔｉｓｓｕｅ　ｓｔｉｃｋｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ．Ｃｅｌ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｍｏｄｅｌ　ｗａｓ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ｂｙ　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ
ｗｉｔｈ　ＡｎｇⅡ，Ｃｅｌ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｍｏｄｅｌ　ａｓ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ｂｙ　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　１０－７　ｍｏｌ·Ｌ－１　ＡｎｇⅡ．Ａｆｔｅｒ　ＡｎｇⅡｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ，ｃｅｌｓ
ｗｅｒｅ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｒｅｅ　ｄｏｓｅ　ｏｆ　Ｄｒａｃｏｃｅｐｈａｌｕｍ　ｔｏｔａｌ　ｆｌａｖｏｅｓ（２５，５０，１００　ｍｇ·Ｌ－１）ｏｆ　２４　ｈｏｕｒｓ，ａｎｄ　ａ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ；ＭＴＴ　ａｓ－
ｓａｙ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｅｖａｌｕａｔｅ　ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｅｌｓ．Ｔｒａｎｓｗｅｌ　ａｓｓａｙ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｅｖａｌｕａｔｅ　ｔｈｅ　ｍｉｇｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｅｌｓ．Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｏｆ　ｉｎｔｒａｃｅｌｕｌａｒ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ　ｃｅｌ　ｎｕｃｌｅａｒ　ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＣＮＡ）ｗｅｒｅ　ｍｅａｓｕｒｅｄ　ｂｙ　ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．ＲＥＳＵＬＴＳ　Ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ
ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ，ｔｈｒｅｅ　ｄｏｓｅ　ｇｒｏｕｐｓ　ｏｆ　Ｄｒａｃｏｃｅｐｈａｌｕｍ　ｔｏｔａｌ　ｆｌａｖｏｅｓ　ｃｏｕｌｄ　ｉｎｈｉｂｉｔ，ｉｎ　ｖａｒｙｉｎｇ　ｄｅｇｒｅｅｓ，ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ｍｉｇｒａｔｉｏｎ
ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｉｎｔｒａｃｅｌｕｌａｒ　ＰＣＮＡ　ｏｆ　ＶＳＭＣｓ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ＡｎｇⅡ，ｉｎ　ａ　ｄｏｓｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｍａｎｎｅｒ．ＣＯＮＣＬＵＳＩＯＮ　Ｔｈｅ　Ｄｒａｃｏ－
ｃｅｐｈａｌｕｍ　ｔｏｔａｌ　ｆｌａｖｏｅｓ　ｃｏｕｌｄ　ｉｎｈｉｂｉｔ　ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｍｉｇｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＶＳＭＣ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ＡｎｇⅡ．
ＫＥＹ　ＷＯＲＤＳ：Ｄｒａｃｏｃｅｐｈａｌｕｍ　ｔｏｔａｌ　ｆｌａｖｏｅｓ；ＡｎｇⅡ；ｖａｓｃｕｌａｒ　ｓｍｏｏｔｈ　ｍｕｓｃｌｅ　ｃｅｌ；ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ；ｍｉｇｒａｔｉｏｎ
　　香青兰总黄酮（Ｄｒａｃｏｃｅｐｈａｌｕｍ　Ｍｏｌｄａｖｉｃａ　ｔｏ－
ｔａｌ　ｆｌａｖｏｎｅｓ，ＴＦＤＭ）是从新疆特色资源香青兰中提
取得到的一类天然黄酮类活性成分，具有降血
脂［１－３］、抗氧化及防治心脑血管疾病等作用［４－５］。血
管紧张素Ⅱ（ＡｎｇⅡ）是已知的缩血管活性物质之
一，其通过调节细胞生长、炎症和纤维化的作用在血
管壁的结构和完整性中起关键作用，对平滑肌细胞
的增殖有促进作用［６－７］。内皮细胞，平滑肌细胞和成
纤维细胞是构成血管壁的主要成分。平滑肌细胞的
异常增殖是高血压、冠心病、动脉粥样硬化等多种心
血管疾病的病理机制，抑制主动脉血管平滑肌细胞
（ＶＳＭＣ）的过度增殖是治疗动脉粥样硬化的主要目
标之一。因此，本文通过研究香青兰总黄酮对 Ａｎｇ
Ⅱ诱导的ＶＳＭＣ增殖的影响，探讨香青兰总黄酮干
预治疗动脉粥样硬化的作用及可能机制，以期为香
青兰药材的开发提供实验依据。
１　材料
ＣＯ２培养箱（型号：３１３１）购于美国 Ｔｈｅｒｍｏ公
司，倒置显微镜（型号：ＣＫ２）购于日本 Ｏｌｙｍｐｕｓ公
司；酶标仪（型号：ｘＭａｒｋ）购于美国 ＢＩＯ－ＲＡＤ 公
司；香青兰总黄酮（新疆自治区药物研究所，纯度：
５７％，批号２０１３１１０９）；ＤＭＥＭ 高糖培养基（批号
·０４５· 中国医院药学杂志２０１６年４月第３６卷第７期Ｃｈｉｎ　Ｈｏｓｐ　Ｐｈａｒｍ　Ｊ，Ａｐｒ　２０１６，Ｖｏｌ　３６，Ｎｏ．７
１６４５７９９）、０．２５％胰蛋白酶（批号Ｔ１３２０）和胎牛血
清（批号１００９９－１４１）均购于美国 Ｇｉｂｃｏ公司；Ａｎｇ
Ⅱ（批号ＳＬＢＭ２８２４Ｎ）、ＭＴＴ（批号３０３Ｈ０５２１）均
购于美国 Ｓｉｇｍａ公司；ＰＣＡＮ 单克隆抗体（批号
ａｂ２９）购于美国Ａｂｃａｍ公司。
２　方法
２．１　原代 ＶＳＭＣｓ的培养和鉴定　大鼠胸主动脉
ＶＳＭＣｓ采用组织贴块法进行原代培养。取体质量
在２００　ｇ左右的ＳＤ大鼠，购自新疆医科大学动物中
心，用颈椎脱臼法处死后，７５％酒精里浸泡５　ｍｉｎ后
在无菌条件下取出大鼠胸主动脉，在ＤＭＥＭ 高糖
培养基中去除脂肪组织和内皮细胞。剥离出来的中
膜用眼科剪剪碎，均匀铺于培养瓶中。倒置培养瓶
中加入２０％胎牛血清的ＤＭＥＭ高糖培养基，４　ｈ后
待血管完全贴壁后翻正。绝对静止３　ｄ后进行换液，
倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长状况。
ＶＳＭＣ的鉴定采用免疫细胞化学染色法，取３～８
代进行实验。
２．２　细胞培养与细胞分组　均按１×１０５／ｍＬ的密
度接种于培养瓶中，待细胞长到８０％左右时，用无
血清的培养基继续培养２４　ｈ使细胞都处于Ｇ０期，然
后随机分组：（１）空白对照组（无血清培养基），对细
胞不加任何处理；（２）ＡｎｇⅡ刺激组（１０－７　ｍｏｌ·
Ｌ－１）；（３）ＡｎｇⅡ＋不同浓度香青兰总黄酮组：加入
ＡｎｇⅡ（１０－７　ｍｏｌ·Ｌ－１）和不同浓度的香青兰总黄酮
（２５，５０，１００　ｍｇ·Ｌ－１）；在培养箱中培养２４　ｈ后进行
以下实验。
２．３　观察指标及检测方法
２．３．１　四唑盐比色法测定细胞增殖　在９６孔板中
分别接种细胞，每孔加入５×１０３个细胞，每组做６
个复孔，培养２４　ｈ后，弃去培养基，用无血清培养基
培养２４　ｈ后给药，分为空白组、ＡｎｇⅡ组和ＡｎｇⅡ＋
不同浓度香青兰总黄酮组，在培养箱中培养２４　ｈ后，
弃去培养基，每孔加入２０μＬ　ＭＴＴ溶液，ＭＴＴ溶
液质量浓度为５　ｍｇ·ｍＬ－１，避光培养４　ｈ后，弃去
ＭＴＴ溶液，ＰＢＳ洗涤３次，每孔加入１５０μＬ　ＤＭＳＯ
溶液，振荡１０　ｍｉｎ，酶标仪于５７０　ｎｍ处检测ＯＤ值。
２．３．２　Ｔｒａｎｓｗｅｌ检测细胞迁移　在ｔｒａｎｓｗｅｌ 小
室上层加入上述细胞悬液２００μＬ（细胞数为１×１０
５
个），下层加入不同的刺激因子分为正常对照组、实
验组。其中正常对照组：含１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ 培
养液６００μＬ；实验组：分别加入１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ
培养液及药物共６００μＬ，培养２４　ｈ。弃去上室孔中
培养基，将上室移入新孔中，用预热的ＰＢＳ漂洗１～
２遍。在下室加入４％多聚甲醛６００μＬ，４℃固定
２０　ｍｉｎ，吸出液体，在下室中加入０．１％结晶紫染色
６００μＬ室温染色２０　ｍｉｎ，用ＰＢＳ洗２回，用棉签轻
轻去除膜上层表面未迁移的细胞，２００倍显微镜下
随机５个视野观察细胞，计算迁移的细胞数目。
２．３．３　免疫组化检测细胞中ＰＣＮＡ的表达水平细
胞　用胰酶消化后接种于盖玻片上，２４　ｈ等细胞贴
壁后给药，２４　ｈ后取各组细胞爬片，用４％多聚甲醛
于４℃固定２０　ｍｉｎ，空气干燥５　ｍｉｎ，０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ
孵育细胞２０　ｍｉｎ，３％Ｈ２Ｏ２孵育１５　ｍｉｎ以灭活内源
性酶，１０％正常山羊血清封闭２０　ｍｉｎ，以兔抗ＰＣＮＡ
抗体作为一抗，二抗用中杉金桥ＰＶ６０００，最后以
ＤＡＢ显色，苏木素轻度复染，无水乙醇脱水后于显
微镜下观察。ＰＣＮＡ阳性为细胞核被染成棕黄色，
每张爬片随机选取５个视野，通过计算阳性率来看
各组ＰＣＮＡ的表达水平（阳性率＝阳性细胞的个
数／视野中所有细胞个数）。
２．４　统计学分析　采用ＳＰＳＳ　１７．０软件进行统计
学分析，所有数据用珚ｘ±ｓ表示，多组间比较采用
Ｏｎｅ－Ｗａｙ　ＡＮＯＶＡ单因素方差分析。Ｐ＜０．０５为
差异有显著性。
３　结果
３．１　大鼠平滑肌细胞原代培养及鉴定　血管中膜
铺瓶铺好后，绝对静止３　ｄ后，每３天换新鲜培养基，
每２天用倒置显微镜观察，组织块贴壁后第７天，
组织块边缘有少量细胞爬出（图１Ａ ）；第１２天时，
细胞生长密度达到８０％左右，可见细胞沿着组织块
周边放射性生长，即可传代（图１Ｂ）；免疫细胞化学
染色显示：细胞α－ＳＭＡ表达呈阳性，细胞的胞质呈
棕黄色，可见肌丝，细胞核不着色（图１Ｃ）。免疫组
化结果证实培养的细胞为 ＶＳＭＣ，可以进行后续实
验。
图１　Ａ．原代培养血管平滑肌细胞第７天（×２００）；Ｂ．原代培养血
管平滑肌细胞第１２天（×２００）；Ｃ．免疫细胞化学染色 （×４００）
Ｆｉｇ　１　Ａ．Ｔｈｅ　７　ｄａｙ　ｏｆ　ｒａｔ　ｐｒｉｍａｒｙ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ＶＳＭＣｓ（×２００）；Ｂ．Ｔｈｅ
１２　ｄａｙ　ｏｆ　ｒａｔ　ｐｒｉｍａｒｙ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ＶＳＭＣｓ（×２００）；Ｃ．Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏ－
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒａｔ　ｐｒｉｍａｒｙ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ＶＳＭＣｓ（×
４００）
３．２　香青兰总黄酮对ＡｎｇⅡ诱导ＶＳＭＣ增殖的影
响　与空白组比较，经 ＡｎｇⅡ诱导的平滑肌细胞
２４　ｈ后，ＯＤ值发生明显的增加，差异具有统计学意
义；而不同浓度的香青兰总黄酮进行干预后，相对
ＡｎｇⅡ诱导组血管平滑肌细胞增殖明显降低，差距
·１４５·中国医院药学杂志２０１６年４月第３６卷第７期Ｃｈｉｎ　Ｈｏｓｐ　Ｐｈａｒｍ　Ｊ，Ａｐｒ　２０１６，Ｖｏｌ　３６，Ｎｏ．７
具有统计学意义，香青兰总黄酮呈浓度依赖性抑制
ＡｎｇⅡ诱导的ＶＳＭＣ增殖，即随着香青兰总黄酮的
含量逐渐增高，抑制 ＡｎｇⅡ促进 ＶＳＭＣ增殖的作
用越明显（结果见表１及图２）。
表１　香青兰总黄酮对 ＡｎｇⅡ诱导大鼠 ＶＳＭＣ增殖的影响
（珚ｘ±ｓ）
Ｔａｂ　１　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｔｏｔａｌ　ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｄｒａｃｏｃｅｐｈａｌｕｍ　ｍｏｌｄ－
ａｖｉｃａ　ｏｎ　ＡｎｇⅡ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ｒａｔ　ＶＳＭＣｓ　ｍｉｇｒａｔｉｏｎ（珚ｘ±ｓ）
组别
例数
／例 ０ｈ　 ２４　ｈ　 ４８　ｈ
空白对照组 ６　 ０．３０３±０．０３１　０．３４４±０．０４０　０．３５８±０．０５５
ＡｎｇⅡ组 ６　 ０．３３９±０．０６５　０．４７８±０．０６５　０．５９５±０．０３３
ＡｎｇⅡ组＋香
青兰总黄酮高
剂量组
６　 ０．３２１±０．０５５　０．３８１±０．０５０ａ０．３９９±０．０６７ｂ
ＡｎｇⅡ组＋香
青兰总黄酮中
剂量组
６　 ０．３３６±０．０６０　０．４４９±０．０５３　０．４７９±０．０４９ａ
ＡｎｇⅡ组＋香
青兰总黄酮低
剂量组
６　 ０．３１０±０．０２６　０．４６８±０．０６７　０．５７４±０．０６８
注：与ＡｎｇⅡ组比较，ａＰ＜０．０５，ｂ　Ｐ＜０．０１
图２　香青兰总黄酮作用对 ＡｎｇⅡ诱导大鼠 ＶＳＭＣ增殖的影响
（２４　ｈ，４８　ｈ）
Ｆｉｇ　２　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｔｏｔａｌ　ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ　ｆｒｏｍＤｒａｃｏｃｅｐｈａｌｕｍＭｏｌｄａｖｉｃａｏｎ
ＡｎｇⅡ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ｒａｔ　ＶＳＭＣｓ　ｍｉｇｒａｔｉｏｎ（２４　ｈ，４８　ｈ）
３．３　香青兰总黄酮对ＡｎｇⅡ诱导ＶＳＭＣ迁移的影
响　与空白组比较，经 ＡｎｇⅡ诱导的平滑肌细胞
２４　ｈ后，细胞迁移明显增多。不同浓度的香青兰总
黄酮进行干预后，相对ＡｎｇⅡ组诱导的血管平滑肌
细胞迁移明显减少（ａＰ＜０．０５；ｂ　Ｐ＜０．０１），且表现
出一定的剂量依赖关系趋势（结果见图３）。
图３　香青兰总黄酮对ＡｎｇⅡ诱导大鼠ＶＳＭＣ迁移的影响
Ｆｉｇ　３　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｔｏｔａｌ　ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ　ｆｒｏｍＤｒａｃｏｃｅｐｈａｌｕｍＭｏｌｄａｖｉｃａｏｎ
ＡｎｇⅡ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ｒａｔ　ＶＳＭＣｓ　ｍｉｇｒａｔｉｏｎ
３．４　香青兰总黄酮对ＡｎｇⅡ诱导ＶＳＭＣ中ＰＣＮＡ
分子的表达影响　免疫组化的结果显示，空白对照
组ＰＣＮＡ阳性细胞所占比例较少，然而经过ＡｎｇⅡ
的刺激后ＰＣＮＡ阳性细胞（如图所示，黑色箭头所
指为阳性细胞）比例明显增多，与空白组比较Ｐ＜
０．０５。不同浓度的香青兰总黄酮对 ＡｎｇⅡ诱导的
ＰＣＮＡ分子表达均有不同程度的抑制作用（ａＰ＜
０．０５；ｂ　Ｐ＜０．０１），且表现出一定的浓度依赖性的关
系趋势（结果分别见图４及图５）。
图４　香青兰总黄酮对 ＡｎｇⅡ诱导大鼠 ＶＳＭＣ　ＰＣＮＡ表达的影响
（×２００）Ａ．空白对照；Ｂ．ＡｎｇⅡ组；Ｃ．ＡｎｇⅡ＋总黄酮低剂量组（２５
μｇ·ｍＬ－１）；Ｄ．ＡｎｇⅡ＋总黄酮中剂量组（５０μｇ·ｍＬ－１）；４Ｅ：ＡｎｇⅡ
＋总黄酮高剂量组（１００μｇ·ｍＬ－１）
Ｆｉｇ　４　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｔｏｔａｌ　ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ　ｆｒｏｍＤｒａｃｏｃｅｐｈａｌｕｍＭｏｌｄａｖｉｃａｏｎ
ＡｎｇⅡ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ＰＣＮＡ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｒａｔ　ＶＳＭＣｓ（×２００）Ａ．Ｃｅｌｓ
ｗｉｔｈ　ｎｏ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ；Ｂ．ｃｅｌｓ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＡｎｇⅡ（１０－７　ｍｏｌ·Ｌ－１）；Ｃ．
ｃｅｌｓ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＡｎｇⅡ（１０－７　ｍｏｌ·Ｌ－１）ａｎｄ　ｔｏｔａｌ　ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ（２５
μｇ·ｍＬ－１）；Ｄ．ｃｅｌｓ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＡｎｇⅡ（１０－７　ｍｏｌ·Ｌ－１）ａｎｄ　ｔｏｔａｌ
ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ（５０μｇ·ｍＬ－１）；Ｅ．ｃｅｌｓ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＡｎｇⅡ（１０－７　ｍｏｌ·
Ｌ－１）ａｎｄ　ｔｏｔａｌ　ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ（１００μｇ·ｍＬ－１）
图５　香青兰总黄酮对ＡｎｇⅡ诱导大鼠ＶＳＭＣ　ＰＣＮＡ阳性率表达的
影响。ＰＣＮＡ的阳性率表达水平通过计算阳性细胞在这个视野中细
胞中所占比率
Ｆｉｇ　５　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｔｏｔａｌ　ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ　ｆｒｏｍＤｒａｃｏｃｅｐｈａｌｕｍＭｏｌｄａｖｉｃａｏｎ
ＡｎｇⅡ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ＰＣＮＡ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｒａｔｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｒａｔ　ＶＳＭＣｓ．Ｑｕａｎ－
ｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＰＣＮＡ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｂｙ　ｃａｌｃｕｌａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ｐｅｒ－
ｃｅｎｔａｇｅ　ｏｆ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｓｔａｉｎｅｄ　ｃｅｌｓ　ｐｅｒ　ｈｉｇｈ－ｐｏｗｅｒ　ｆｉｅｌｄ
４　讨论
本课题组前期研究发现［８］，香青兰总黄酮可有
效抑制ＴＮＦ－α诱导的大鼠主动脉ＶＳＭＣ的增殖能
力。因此，为进一步探讨香青兰总黄酮抗动脉粥样
硬化的作用机制，课题又围绕与动脉粥样硬化发生
发展密切相关的 ＴＧＦ－β／Ｓｍａｄ信号通路开展了研
究。ＡｎｇⅡ 是 肾 素－血 管 紧 张 素－醛 固 酮 系 统
（ＲＡＡＳ）中最重要的一种激素，具有促 ＶＳＭＣｓ增
殖的作用［９］，能促进 ＶＳＭＣ生长、迁移、分化、钙
·２４５· 中国医院药学杂志２０１６年４月第３６卷第７期Ｃｈｉｎ　Ｈｏｓｐ　Ｐｈａｒｍ　Ｊ，Ａｐｒ　２０１６，Ｖｏｌ　３６，Ｎｏ．７
化［１０］。ＡｎｇⅡ参与体内多种信号通路，如磷脂酶激
活、络氨酸磷酸化、丝裂原活化蛋白激酶及ＴＧＦ－β／
Ｓｍａｄ信号通路等，其中 ＴＧＦ－β／Ｓｍａｄ信号通路在
动脉粥样硬化的发生发展过程中发挥着重要的作
用［１１－１２］。ＡｎｇⅡ可以促进ＴＧＦ－β的分泌
［１３］，从而吸
引单核细胞在内皮表面黏附、聚集，并穿过内膜间隙
在内膜下转变为巨噬细胞，通过吞噬ＯＸ－ＬＤＬ，再转
变为泡沫细胞，形成最早的脂质条纹；巨噬细胞还能
分泌多种细胞因子，在这些细胞因子的作用下，促使
脂肪条纹演变为纤维脂肪病变，再发展为纤维斑块
最终导致动脉粥样硬化。
通过体外培养的大鼠胸主动脉 ＶＳＭＣ，采用
ＡｎｇⅡ诱导 ＶＳＭＣ的过度增殖，建立细胞增殖模
型，观察香青兰总黄酮与 ＡｎｇⅡ诱导的 ＶＳＭＣｓ的
相互作用，评价不同浓度的香青兰总黄酮对ＶＳＭＣ
的增殖和迁移能力的影响。
ＰＣＮＡ被发现在进行细胞分裂的核酵母、植物
和动物细胞中，他的表达和合成仅表现在增殖细胞
中，在Ｇ１期开始增加，然后在Ｓ期达到一个高峰，是
一个非常重要的细胞增殖指数，其表达水平直接与
细胞增殖的程度成正比。增殖细胞核抗原检测是细
胞增殖状态评价的可靠指标［１４－１５］。实验结果表明：
ＡｎｇⅡ诱导 ＶＳＭＣ增殖和迁移（Ｐ＜０．０５），ＰＣＮＡ
的表达水平也显著升高（Ｐ＜０．０１），说明 ＡｎｇⅡ能
促进培养的血管平滑肌细胞增殖和迁移。不同剂量
香青兰总黄酮（２５，５０，１００　ｍｇ·Ｌ－１）作用２４　ｈ后可
抑制ＶＳＭＣ增殖和迁移（Ｐ＜０．０５）。在相同的时
间内，随着香青兰总黄酮浓度的增加细胞增殖活度、
迁移细胞数和ＰＣＮＡ表达水平逐渐降低，差异均有
统计学意义（Ｐ＜０．０５或Ｐ＜０．０１）。因此，香青兰
总黄酮能够抑制 ＡｎｇⅡ诱导 ＶＳＭＣ的异常增殖和
迁移，可能对血管再狭窄及动脉粥样硬化斑块形成
的起到防治作用，其作用机制还有待于进一步研究。
参考文献：
［１］　曹文疆，彭克军，袁勇，等．香青兰总黄酮抗大鼠动脉粥样硬
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［收稿日期］２０１５－１１－１７
·３４５·中国医院药学杂志２０１６年４月第３６卷第７期Ｃｈｉｎ　Ｈｏｓｐ　Ｐｈａｒｍ　Ｊ，Ａｐｒ　２０１６，Ｖｏｌ　３６，Ｎｏ．７