全 文 ：天然产物研究与开发 NatProdResDev2008, 20:436-439
文章编号:1001-6880(2008)03-0436-04
　
　
　收稿日期:2007-09-18　　　接受日期:2007-11-08
＊通讯作者 Tel:86-25-85811512;E-mail:liangqiaoli@sohu.com
地胆草倍半萜内酯化合物体外抗肿瘤作用的研究
梁侨丽 1＊ ,龚祝南 2 ,绪广林 2 ,赵　烨 2
1南京中医药大学 ,南京 210046;2南京师范大学 ,南京 210097
摘　要:采用四甲基偶氮唑盐比色法和琼脂糖凝胶电泳法等研究地胆草倍半萜内酯化合物 scabertopin(1)和
isodeoxyelephantopin(2)在体外对 SMMC-7721、Hela和 Caco-2三种肿瘤细胞增殖的影响。发现这两个化合物在 1
～ 100 μM浓度内对三种肿瘤细胞增殖有显著的抑制作用 , 且呈一定剂量依赖关系。二者抑制 SMMC-7721细胞
增殖的 IC50值分别为 29.27和 9.54μM;抑制 Hela细胞增殖的 IC50值分别为 22.19和 25.39 μM;抑制 Caco-2细
胞增殖的 IC50值分别为 35.99和 25.76 μM。时效性实验还显示 2对 Hela细胞增殖的抑制作用呈时间依赖关
系。 2浓度 100 μM作用 Hela细胞 48h,琼脂糖凝胶电泳显示明显的细胞凋亡 “梯状”条带(DNAladder), 提示
isodeoxyelephantopin抑制 Hela细胞作用是通过诱导其凋亡。
关键词:地胆草;倍半萜内酯化合物;肿瘤细胞;凋亡
中图分类号:R966;Q946.91 文献标识码:A
TheAntitumorEffectsinvitroofSesquiterpene
LactonesfromElephantopusscaber
LIANGQiao-li1＊ , GONGZhu-nan2 , XUGuang-lin2 , ZHAOYe2
1NanjingUniversityofChineseMedicine, Nanjing210046 , China;
2NanjingNormalUniversity, Nanjing210097 , China
Abstract:Theantitumorefectsofsesquiterpenelactonesscabertopinandisodexyelephantopinfromthewholeplantof
ElephantopusscaberwerestudiedinvitroonSMMC-7721, HelaandCaco-2cancercellines.InMTTassay, scabertopin
andisodexyelephantopinatthedoseof1-100 μMmarkedlyinhibitedthegrowthofthreecancercellinesindose-de-
pendentmanner.TheIC50 valueofscabertopinandisodexyelephantopinonSMMC-7721 cellsafter48hoftreatmentwere
29.27and9.54 μM, respectively, withtheirIC50 valueonHelacelsof22.19 and25.39 μMandonCaco-2 celsof
35.99 and25.76 μM.Thetime-efectexperimentalsoshowedthatisodexyelephantopininhibitedthegrowthofHela
cellsintime-dependentmanner.DNAagarosegelelectrophoresisofHelacelsrevealedobviousnuclearfragmentation
(DNAladder)treatedwithisodexyelephantopinfor48 h, whichsuggestedthecompoundcouldinducetheapoptosisof
Helacel.
Keywords:Elephantopusscaber;sesquiterpenelactones;cancercellines;apoptosis
　　地胆草 (ElephantopusscaberLinn.)是菊科地
胆草属植物 ,其全草是中药苦地胆的来源 ,我国资源
丰富。民间认为地胆草有清热 、凉血 、解毒 、利湿的
功效 ,主治感冒 、百日咳 、眼结膜炎 、黄疸 、肾炎水肿 、
湿疹等症。地胆草的重要化学成分是牻牛儿型倍半
萜内酯 ,其中的地胆草内酯对体外人鼻咽癌 KB细
胞和小鼠白血病 P388有显著的抑制作用 ,而去氧地
胆草内酯能显著抑制肉瘤 W256 ,该属其它种植物
所含的倍半萜内酯也有较强的抗肿瘤和细胞毒活
性[ 1-3] 。为寻找地胆草中的新活性化合物 ,我们对其
干燥全草进行研究 ,从中分得多个化合物[ 4-6] 。本文
首次报道其中的 2个倍半萜内酯化合物:scabertopin
(1)和 isodeoxyelephantopin(2)的体外抗人肝癌细
胞 SMMC-7721,人宫颈癌细胞 Hela,人结肠腺癌细
胞 Caco-2的活性 。
1　材料与方法
1.1　肿瘤细胞
SMMC-7721人肝癌细胞株 , Hela人宫颈癌细胞
株 , Caco-2人结肠腺癌细胞株皆由南京师范大学分
子生物学研究所提供。
图 1　化合物 1和 2的结构
Fig.1　Thestructuresofcompounds1 and2
1.2　供试样品
供试药品 scabertopin(1)和 isodeoxyelephantopin
(2),分子量分别为 358和 344,均为白色细针晶 ,是
从菊科地胆草属植物地胆草(购自广西省)中经提
取 、分离 、纯化得到的单体化合物 ,经 IR、NMR和
ESI-MS等波谱方法鉴定结构和纯度 ,并用 DMSO配
制成 10-3 M储备液(DMSO终浓度≤0.5%),滤膜滤
菌后 ,保存于 4℃冰箱中 ,用时以三蒸水稀释成需要
的浓度 。
1.3　仪器和试剂
5400型 CO2恒温培养箱(美国 Napco公司), d-
63450型超净工作台(德国 Herus公司), DMIL型
倒置显微镜(德国 Leica公司), ELx800型酶联免疫
检测仪(美国 Bio-Tek公司), MSI型震荡器(美国
Ika公司), PowerPac200型电泳仪(美国 Bio-Rad公
司), 770型电子分析天平(美国 Kern公司)。
RPMI-1640和 DMEM培养基(Gibco公司),小
牛血清和胎牛血清(杭州四季青公司),四甲基偶氮
唑盐(MTT, Sigma公司),琼脂糖(Yito公司)。
1.4　方法
1.4.1　细胞培养
三种肿瘤细胞株接种于培养瓶中 , SMMC-7721
人肝癌细胞和 Hela人宫颈癌细胞分别加入 DMEM
和 RPMI-1640培养基(均含 10%小牛血清 、青霉素
100U/mL和链霉素 100U/mL), Caco-2人结肠腺癌
细胞加入 DMEM培养基(含 10%胎牛血清 、1%非必
需氨基酸 、青霉素 100 U/mL和链霉素 100 U/mL),
于 37℃, 5% CO2培养箱中培养 ,细胞呈单层贴壁
生长 ,每 3 ～ 5d传代一次 ,用 0.25%胰酶消化传代 。
1.4.2　MTT显色法[ 7]
分别取对数生长期的 SMMC-7721、Hela、Caco-2
细胞(5×104个 /mL),按每孔 100 μL接种到 96孔
板上 ,设六复孔 ,培养 24 h后 ,换液 ,加入培养基 180
μL,再分别加入不同浓度的药液 20μL,阴性对照组
加入 20 μL终浓度为 0.5%DMSO,空白对照组加入
20 μL培养基 , 培养 48 h,每孔加入浓度为 5 g/L
MTT溶液 20μL,继续培养 4 h后 ,弃去培养液 ,加
入 100 μLDMSO/孔终止反应 ,振荡 10 min使结晶
完全溶解 ,用酶联仪于 490 nm波长测定光密度值
(OD值)。各组 OD值取均值后 ,以下式计算细胞
生长抑制率:
抑制率(%)=(1- OD药敏组 -OD空白组OD阴性对照组 -OD空白组)×100%
1.4.3　倒置显微镜观察不同培养时间细胞形态的
变化
取对数生长期的 Hela细胞 ,按每孔 100 μL接
种到 5块 96孔细胞培养板中 ,设不加药物的阴性对
照组 、空白对照组以及浓度分别为 50、100 μM的 2
药物实验组 。加药后分别培养 0.5、2、12、24、48 h
后取出 ,在倒置显微镜 ×200倍下观察细胞形态并
拍照记录 ,再用 MTT法检测。
1.4.4　DNA琼脂糖凝胶电泳分析 [ 8]
将对数生长期的 Hela细胞接种在 4个直径为 6
cm的培养皿内 , 3个皿内加入化合物 2(终浓度为 100
μmol/L),一个皿作对照;分别于 12、24、48h后取出培
养皿。分别收集细胞 , PBS洗涤两次 (2000 rpm, 5
min),加 1mLTris饱和的酚(pH7.9)使细胞破壁 ,沉
淀蛋白 ,静置 5 min;用 Tris饱和的酚 /氯仿(1:1, pH
8.0)抽提两次 ,充分混匀 ,每次离心 5 min(12000
rpm);取上清液 ,加入 1/10体积的 3mol/L醋酸铵(pH
7.8)及两倍体积的冷无水乙醇 ,混匀 , -20℃过夜;取出
后 ,离心 5 min,用 70%冷乙醇溶液洗涤两次 ,自然干
燥;加 TE及 RNA酶(终浓度 100μg/mL), 37℃作用 1
h。取制备好的样品 20μL,用 2%琼脂糖凝胶 , 40V电
泳 3h, UV下观察结果并拍照。
1.5　数据统计学处理
每组数据用样本的均数 x±s表示 ,采用 t检验
(Excel软件)进行组间比较 。
2　结果
2.1　Scabertopin(1)和 isodeoxyelephantopin(2)对
SMMC-7721、Hela、Caco-2肿瘤细胞增殖的影响
经 MTT法检测 , 发现不同浓度的 1和 2对
SMMC-7721、Hela、Caco-2肿瘤细胞的增殖均有一定
的抑制作用 ,化合物 2在低浓度时对 SMMC-7721细
胞的百分抑制率高于化合物 1,但在高浓度时正好
相反 ,而 1对 Hela细胞的抑制率在各浓度都明显高
于 2,对 Caco-2细胞的抑制率 ,两化合物相近;且化
437Vol.20 梁侨丽等:地胆草倍半萜内酯化合物体外抗肿瘤作用的研究
合物 1和 2对各肿瘤细胞的抑制作用均呈浓度依赖
关系(见表 1 ～ 3)。回归分析 ,化合物 1和 2抑制
SMMC-7721细胞增殖拟合的剂量效应曲线方程分
别为 Y=0.004X2.2743 , Y=0.1705e0.0805X,计算 IC50值
分别为 29.27和 9.54 μM;抑制 Hela细胞增殖拟合
的剂量效应曲线方程分别为 Y=0.0096X1.98 , Y=
1.3293e0.059X,计算化合物 1和 2的 IC50值分别为
22.19和 25.39 μM;化合物 1和 2抑制 Caco-2细胞
增殖拟合的剂量效应曲线方程分别 为 Y=
0.3277X1.0212 , Y=0.0107X1.9904 ,计算 IC50值分别为
35.99和 25.76μM。
表 1　1和 2对 SMMC-7721细胞生长的抑制作用
Table1　Inhibitoryefectsof1 and2 onthegrowthofSMMC-
7721
浓度
Concentration
(μM)
抑制率 Inhibitionrate(%)
1.0 5.0 10.0 50.0 100.0
1
13.95±
8.26
19.77±
7.29
27.03±
6.24
72.67±
8.51
82.56±
7.51
2
22.67±
5.52
40.12±
5.47
51.45±
3.78
71.80±
1.99
78.20±
2.29
表 2　1和 2对 Hela细胞生长的抑制作用
Table2　Inhibitoryeffectsof1 and2 onthegrowthofHela
浓度
Concentration
(μM)
抑制率 Inhibitionrate(%)
1.0 5.0 10.0 50.0 100.0
1
9.44±
9.34
26.88±
5.90
35.84±
3.73
80.63±
2.25
90.80±
3.44
2
1.45±
2.38
15.01±
2.50
33.17±
9.78
64.65±
6.08
72.40±
2.50
表 3　1和 2对 Caco-2细胞生长的抑制作用
Table3　Inhibitoryefectsof1 and2onthegrowthofCaco-2
浓度
Concentration
(μM)
抑制率 Inhibitionrate(%)
1.0 5.0 10.0 50.0 100.0
1
2.44±
2.09
10.22±
3.61
17.11±
2.59
83.33±
3.45
91.11±
3.21
2
13.00±
4.56
17.00±
3.43
27.56±
4.59
85.44±
1.31
87.56±
2.08
2.2　Isodeoxyelephantopin(2)对 Hela细胞生长形
态的影响以及影响的时效性实验
Hela细胞分别用 50、100 μM浓度 2处理后 ,在
倒置显微镜下观察到 ,加药 0.5 h,作用不明显;2 h
后药物已显出效果 ,细胞贴壁能力降低 ,部分贴壁细
胞已经变圆浮起;作用 12 h,全部细胞均已变圆浮
起 。作用 24 h,细胞形态发生很大改变 ,细胞核皱
缩 ,与发生凋亡的细胞形态类似 。而空白对照组的
细胞形态未发生显著变化(见图 2)。MTT法检测也
显示 2的光密度值随着时间延长与空白组差值增
大 ,表明 2对 Hela细胞生长的抑制作用随着时间延
长而增强(见图 3)。
2.3　化合物 2的 DNA琼脂糖凝胶电泳分析
实验结果显示:Hela细胞在终浓度为 100 μM
的 isodeoxyelephantopin(2)作用下 , 37 ℃培养 24、48
h后 ,出现明显的显示细胞凋亡过程中 DNA降解的
特征性 “梯状”条带(见图 4)。
438 天然产物研究与开发　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　Vol.20
3　讨论
　　倍半萜内酯化合物是一类庞大的和具有多种生
物活性的植物成分 ,主要来自菊科植物。医药学研
究已确认这类成分可有效的用于治疗实体瘤 、胃溃
疡以及具有强心作用 [ 9] 。而菊科地胆草的重要成
分就是倍半萜内酯类 。我们从地胆草中分离到倍半
萜内酯化合物:scabertopin(1)和 isodeoxyelephanto-
pin(2),这两个化合物母核同为牻牛儿烷型 ,前者侧
链为当归酰氧基 ,后者为异丁烯酰氧基。
本实验结果显示这两个化合物对人肝癌细胞
SMMC-7721、人宫颈癌细胞 Hela和人结肠腺癌细胞
Caco-2的生长有抑制作用 ,但作用有差异 ,化合物 2
在低浓度时对 SMMC-7721细胞的百分抑制率高于
化合物 1,但在高浓度时正好相反 ,而 1对 Hela细胞
的抑制率在各浓度都明显高于 2,对 Caco-2细胞的
抑制率 ,两化合物相近;另 1和 2抑制 SMMC-7721
细胞增殖的 IC50值分别为 29.27和 9.54 μM;抑制
Hela细胞增殖的 IC50值分别为 22.19和 25.39 μM;
抑制 Caco-2细胞增殖的 IC50值分别为 35.99和
25.76 μM。同时发现随着 2作用时间延长 , Hela细
胞贴壁能力降低 ,细胞形态发生很大改变 ,先变圆浮
起 ,然后细胞核皱缩 ,与发生凋亡的细胞形态类似 ,
而空白对照组的细胞形态未发生显著变化 ,且 2对
Hela细胞增殖的抑制作用呈时间依赖关系。我们
对 2抑制 Hela细胞增殖的机理进行初步研究 ,发现
Hela细胞经 100 μM的 2作用 48 h,琼脂糖凝胶电
泳出现明显的 DNA片段 ,即 “梯状 ”条带(DNAlad-
der),这是细胞凋亡的特征变化。
scabertopin和 isodeoxyelephantopin对这三种肿
瘤细胞的抑制作用有选择性 ,这两化合物的母核结
构相同 ,差异只是 8位上侧链取代基不同 ,是否侧链
结构不同影响其细胞毒性 ,母核结构变化是否也有
影响 ,如何影响 ?需要分离或合成更多的类似物 ,进
行活性比较 ,总结出地胆草倍半萜内酯化合物的抗
肿瘤构效关系 ,同时研究其体外抗肿瘤机制和体内
抗肿瘤活性 ,为将其开发为新型抗肿瘤药物提供依
据。
参考文献
1　CompilationCommitteeofZhong-Hua-Ben-Cao.Zhong-Hua-
Ben-Cao(中华本草).Shanghai:ShanghaiScienceandTech-
nologyPress, 1999, 7:821-827.
2　ZhangDC, MitsumasaH, McphailAT, etal.Cytotoxicger-
macranolidesofelephantopuscarolinianusandthestructure
andstereochemistryofisodeoxyelephantopin.Phytochem,
1986, 25:899-901.
3　ToshimitsuH, JunkoK, McphailAT, etal.Structureandab-
solutestereochemistryofTomenphantopin-Aand-B, twocy-
totoxicsesquiterpenelactonesfromElephantopustomentosus.
Phytochem, 1987, 26:1065-1069.
4　LiangQL(梁侨丽), MinZD(闵知大), ChengL(成亮).
StudiesonthetwodipepetidesfromElephantopusscaber.J
ChinPharmUni(中国药科大学学报), 2002, 33;178-180.
5　LiangQL, MinZD.SesquiterpenelactonesfromElephantopus
scaber.ChinChemLet, 2002, 13:343-346.
6　LiangQL, MinZD.Anewelemanolidesesquiterpenelactone
fromElephantopusscaber.JAsianNatProdResh, 2007, in
press.
7　SituZQ(司徒镇强), WuJZ(吴军正).CellCulture(细胞
培养)第一版 ,世界图书出版公司 , 1996.186-191.
8　XinH(辛花).CelBiologyExperiment(细胞生物学实
验).Beijing:SciencePublishingHouse, 2001.189-193.
9　LiGQ(李国庆), ZhongZX(钟正贤).Aprogressinthe
studyonanimalpharmacognosy, pharmacologyandneurotoxi-
cologyofsesquiterpenelactones.WorldPhytomedicines(国外
医药·植物药分册), 1998, 13:10-12.
439Vol.20 梁侨丽等:地胆草倍半萜内酯化合物体外抗肿瘤作用的研究