全 文 ：中国农学通报 第23卷 第 6期 2007年 6月
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山杏[Armeniaca.sibirica(L.)Lam.]，蔷薇科，李
属，通常为落叶灌木或乔木。主要分布于河北、辽宁西
部及内蒙古等地，多处于野生、半野生状态[1~3]。杏仁
食用、药用价值很高，营养丰富，富含多种氨基酸、不
饱和脂肪酸、微量元素、维生素[4]。杏仁并具有润肺定
喘、生津止渴之功效；叶可治疗目疾、水肿；花具有主
补不足、寒热痹等功用；枝、树皮、树根均可入药，具有
解毒等功效[5]。另外山杏树具有耐寒、耐旱、耐瘠薄等
特性，又兼具有经济效益，可作为防风固沙的优势树
种之一。然而对山杏的研究多数集中在栽培管理、嫁
接技术等方面，在分子水平开展的研究较少，因此建
立一套适合山杏分子生物学研究的整套体系具有重
要意义。
RAPD技术是1990年由Wiliams[6]、Welsh[7]等人
建立的。因其具有快速、灵敏、准确、多态检出率高、可
自动化分析等特点，在分类研究、品种鉴定、系谱分
析、遗传图谱构建、基因标记等方面得到广泛应用。随
着技术的发展和完善，许多动植物相继采用RAPD技
术进行了研究，并取得成功。但RAPD技术对反应条
件的比较敏感，所以需要对影响RAPD反应的各因素
山杏RAPD反应体系条件的优化
李振江 1,葛会波 1,2,张学英 1,王 勇 3
(1河北农业大学园艺学院，保定071001；2河北省林业局，石家庄050081；
3河北农业大学海洋学院，秦皇岛066000)
摘 要:以山杏新鲜叶片为材料,研究了山杏RAPD分析过程中的影响因素,包括Taq酶、Mg2+、dNTP、
引物、模板DNA浓度、变性时间、循环次数等,建立了适合山杏RAPD反应的 PCR体系,即 20μl反应
体系中含有 Taq酶 1.0U、Mg2+2.0mM,四种dNTP各 0.1mM,引物 0.5μM,模板 DNA50ng。扩增程序
为:94℃预变性 4mins;94℃变性 1min,36℃退火 1min,72℃延伸 1.5mins,10个循环;94℃变性
30s,36℃退火40s,72℃延伸60s,30个循环;最后72℃延伸5min。
关键词:山杏;RAPD;优化
中图分类号:S662.2 文献标识码:A
OptimizationforRAPDReactionSystemofArmeniacasibirica
LiZhenjiang1,GeHuibo1,2,ZhangXueying1,WangYong3
(1ColegeofHorticulture,AgricultureUniversityofHebei,Baoding071001;
2ForestrybureauofHebeiProvince,Shijiazhuang050081;
3ColegeofOcean,AgricultureUniversityofHebei,Qinhuangdao066000)
Abstract:ThefactorsinfluencingRAPDanalysis,includingTaqpolymerase,Mg2+,dNTP,primers,
templateDNAsconcentration,denaturingtimeandthermalcyclesinArmeniaca.sibirica (L.)Lam.were
studied.AnoptimalPCRsystemforRAPDinfreshleavesofA.sibirica (L.)Lam.hasbeenfound：in
20μlreactionsolution,contained1UTaqpolymerase,2.0mMMg2+,0.1mMdNTP,0.5μMprimers,50ng
templateDNA.Theamplificationprogramwasdevised：initialdenaturingat94℃for4mins;denaturingat
94℃ for1mins,annealingat36℃ for1min,extensionat72℃ for1.5mins,10cycles;denaturingat94℃
for30s,annealingat36℃for40s,elongationat72℃for60s,30cycles;finalextensionat72℃for5mins.
Keywords:Armeniacasibirica,RAPD,Optimization
第一作者简介:李振江，男，1981年出生，河北魏县人，硕士，主要从事分子生物技术研究。通信地址：071001河北农业大学园艺学院，E-mail:lzj729@ya-
hoo.com.cn。
通讯作者:张学英，女，1972年出生，河北迁西人，副教授，硕士生导师，主要从事果树栽培生理与生物技术的研究。通信地址：071001河北农业大学园艺
学院，Tel：0312-7528337，E-mail:zhxy97421@yahoo.com.cn。
收稿日期:2007-03-27，修回日期：2007-04-02。
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进行系统比较研究，以确定最佳反应条件，获得稳定
的扩增结果。
针对山杏生产中品种落后问题，在张家口和承德
地区进行了丰产、晚花及其他特异类型的初选，为了
很好地利用这些资源，必须对其遗传特性加以鉴定。
本研究目的是建立RAPD-PCR反应体系，为进一步
应用其进行山杏种内分类和种质特性研究提供理论
依据。
1材料与方法
1.1试验时间、地点
试验于 2006年 5月—12月在河北农业大学园
艺学院生物技术实验室进行。
1.2试验材料
供试材料为山杏，采自张家口赤诚县、承德丰宁
县。
试验所用试剂，包括随机引物、Taq酶、Mg2+、
Bufer、dNTP、Marker(DL2000)均为上海生工生物公司
产品。琼脂糖(EEO为0.15，由基因科技(上海)有限公
司分装)、石蜡油(Sigma分装)，其它试剂均为国产分析
纯试剂。
1.3基因组DNA提取及检测
DNA提取方法参考Doyle等[8]，DNA质量和浓度
分别采用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计测定。并
将其稀释至100ng/μl，置于冰箱-20℃保存备用。
1.4RAPD反应体系、扩增程序优化及其产物的检测
1.4.1对影响反应的5个主要因素Taq酶浓度、dNTP
浓度、Mg2+浓度、引物浓度、模板DNA浓度进行了比较
试验。各个因素浓度梯度如下：
(1)Taq酶设 7个浓度：0.5U，0.8U，1.0U，1.2U，
1.6U，2.0U，2.5U；
(2)Mg2+设 6个浓度：1.0mM，1.5mM，2.0mM，
2.5mM，3.0mM，3.5mM；
(3)引物设 7个浓度：0.1mM，0.2mM，0.3mM，
0.4mM，0.5mM，0.6mM，0.7mM；
(4)dNTP设7个浓度：0.1mM，0.15mM，0.20mM，
0.25mM，0.30mM，0.35mM，0.40mM；
(5)DNA设9个浓度：5ng，10ng，20ng，40ng，60ng，
100ng，150ng，220ng，300ng。
对所设浓度梯度进行单因素优化分析，即进行第
一个因素筛选时，其余因素参照预备试验中的用量；
进行第二个因素筛选时，第一个因素使用筛选出的最
佳值，其余因素仍参照预备试验用量，依次类推，直到
筛选出最后一个因素的最佳值为止。
预备试验反应体系为：20μl反应体积中，Taq酶
1.0U，dNTP 0.2mM，Mg2+ 2.0mM， 引 物 0.6mM，
Bufer1×，模板DNA50ng，其余用水补齐。
基本扩增程序：94℃预变性 4mins；94℃变性
30s，36℃退火 40s，72℃延伸 60s，50个循环；72℃延
伸8mins；4℃保存。扩增反应在美国BIO-RAD公司
生产的MyCyclerTM型扩增仪中进行。
1.4.2本试验对五种程序参数进行了比较，程序如下：
程 序 1：94℃ 4mins；94℃ 30s，36℃ 40s，72℃
60s，50个循环；72℃8mins
程序 2：94℃ 4mins；94℃ 1min，36℃ 1min，72℃
1.5mins，40个循环；72℃8mins
程序 3：94℃ 4mins；94℃ 1min，36℃ 1min，72℃
1.5mins，35个循环；72℃8mins
程序 4：94℃ 4mins；94℃ 1min，36℃ 1min，72℃
1.5mins，45个循环；72℃8mins
程序 5：94℃ 4mins；94℃ 1min，36℃ 1min，72℃
1.5mins，10个循环；94℃ 30s，36℃ 40s，72℃ 60s，30
个循环；72℃5mins
1.4.3扩增产物用含 0.5μg/mlEB的 1.2%琼脂糖凝
胶(W/V)电泳分离，电泳缓冲液为1倍TAE，4~5V/cm
稳压条件下进行电泳，染色，凝胶成像系统下观察、照
相。
2结果与分析
2.1基因组DNA的检测
将提取的基因组DNA在1.2%的琼脂糖凝胶上电
泳检测，DNA条带较亮(见图1)，说明提取的DNA量较
多；DNA谱带整齐，无弥散，表明DNA完整无降解。经
UV-765BP紫外分光光度计测定OD260及 OD280值，其
OD260/OD280比值检测核酸纯度，比值在1.5~2.0之间，
符合试验的要求。
图1山杏基因组DNA电泳检测结果
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物，Mg2+浓度为1.0mM时有谱带缺失现象，而 Mg2+
浓度为 4.0mM 时有谱带弥散现象，在 1.5mM、
2.0mM、2.5mM、3.0mM4种 Mg2+浓度下均可产生稳
定、清晰、一致的扩增带型。只是随浓度增加，扩增图
谱的背景有所加深，本试验选用Mg2+浓度为2.0mM。
2.2.3RAPD扩增中引物的适宜浓度 引物的用量对
RAPD反应也有一定的影响，结果表明(如图4所示)，
20μL反应体系中引物浓度在0.1mM~0.7mM时均有
条带产生，而且当引物浓度低于0.4mM及浓度高于
0.5mM时扩增条带较少，故本试验引物用量选用
2.2RAPD反应体系的建立
2.2.1RAPD扩增中Taq酶的适宜浓度 结果表明 (如
图2所示)在浓度为0.5U、0.75U、1.0U时有扩增，带型
清晰，易辨别，在0.5U时扩增条带较少；在较高浓度
1.5U、2.0U、2.5U、3.0U时，扩增明显加强，带型丰富，
但出现弥散现象，不易辨别。可见Taq酶是RAPD扩
增反应中关键的因素，它的浓度变化对扩增的结果影
响比较大。从试验的效果和费用考虑，Taq酶浓度选
择1.0U为宜。
2.2.2RAPD扩增中 Mg2+的适宜浓度 在 PCR反应
中，Mg2+的浓度也是影响扩增结果的关键因素之一。
结果表明(如图3所示)，在该浓度范围内均有扩增产
注:1~7依次为:0.5U,0.75U,1U,1.2U,1.5U,2.0U
图2TaqDNA聚合酶浓度对RAPD扩增的影响
注:1~6依次为:1.0mM,1.5mM,2.0mM,2.5mM,3.0mM,3.5mM
图3Mg2+浓度对RAPD扩增的影响
0.5mM。
2.2.4dNTP的适宜浓度 dNTP的量对循环次数、扩增
产物的量有较大的影响。试验结果表明(如图5所示)，
0.1mM时带型清晰、稳定，0.15mM，0.20mM时条带总
数少于0.1mM时，0.25mM，0.30mM浓度下条带缺失
严重，0.35mM，0.40mM时则没 0.1mM有条带产生。
dNTP过高时与Taq酶竞争，造成聚合酶Taq酶活性
降低，扩增效果不理想，故本试验 dNTP浓度选用
0.1mM。
2.2.5模板 DNA的适宜用量 本试验所设定的模板
DNA的用量对RAPD反应的影响不大(如图6所示)，
DNA在 10ng~150ng范围内均能扩增出比较清晰的
条带，且效果没有太大差别，扩增条带基本一致，模板
DNA为 5ng和 220ng扩增稍弱且缺失部分条带，
注:1~7依次为:0.1mM,0.2mM,0.3mM,0.4mM,0.5mM,0.6mM,0.7mM
图4引物浓度对RAPD扩增的影响
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300ng条带严重缺失。综合考虑本试验模板DNA选
用40ng。
2.2.6热循环温度参数对 RAPD反应的影响 各个文
献资料所报道的RAPD反应变性、退火、延伸温度参
数大体一致，而各自的反应时间则不尽相同，有长有
短，因此仅仅考虑各反应时间来设置程序并逐一试验
即可，最后结果表明程序5相对于其他四种程序的条
带清晰稳定，反应时间适中，本试验选用程序5。
3讨论
RAPD技术简单快捷，试验成本低，无须预先了
解DNA序列的信息。该技术使用的引物较短，要求退
火温度较低，提高了引物和模板的配对几率和随机
性，从而大大提高了基因组分析的效率和多态性的检
出[6]，但同时也会导致标记的稳定性和可重复性差等
问题，因此RAPD试验条件的标准化十分重要[9]。
建立相对稳定的RAPD反应体系是该技术应用
的基础。关于RAPD优化反应体系的建立在许多物种
上均有报道，但不同物种之间反应体系存在一定差
异[10~20]。Taq酶用量是重要的因子，它直接影响多态性
的检出率和扩增结果的重复性及忠实性[15]。Mg2+浓度
是影响Taq酶活性的主要因子，不同物种对Mg2+浓
度的要求不同，从已有的报道看，Mg2+浓度范围大多
在1.5~3.0mmol/L之间[10~19]，也有高达7.5mmol/L的报
道[20]，本试验结果是 2.0~3.0mmol/L时扩增产物均较
清晰，且在这个浓度范围内设置的3个浓度梯度的扩
增效果差异不大，高出这个浓度扩增效果较差，出现
这种现象的原因可能是高浓度Mg2+反而影响Taq酶
的活性[15]。一般认为模板DNA，引物和dNTP等3种
因素适宜用量的范围较宽，本试验结果也印证了这一
点。
试验发现每一个扩增条件的变化会对 RAPD图
谱产生较大的影响，都有一个较理想的扩增范围，同
时，反应体系各因素间存在相互影响关系，需要对主
要因素进行互作的研究，寻找优化的反应体系。并且
此体系用于山杏遗传多样性鉴定有待于进一步研究。
4结论
4.1建立了山杏 RAPD分析的优化体系条件，即
20μL 反 应 体 系 中 含 有 1.0U Taq 酶 ，
2.0mMMg2+，0.1mMdNTP，0.5μM随即引物，50ng模
板DNA。
4.2扩增程序为：94℃预变性 4mins；94℃变性 1min，
36℃退火1min，72℃延伸1.5mins，10个循环；94℃变
性30s，36℃退火40s，72℃延伸60s，30个循环；最后
72℃延伸5mins。
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注:1~7依次为:0.1mM,0.15mM,0.20mM,0.25mM,0.30mM,0.35mM,0.40mM
图5dNTP浓度对RAPD扩增的影响
图6模板DNA对RAPD扩增的影响
注:1~9依次为:5ng,10ng,20ng,40ng,60ng,100ng,150ng,220ng,300ng
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(责任编辑：王运琼)
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