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关苍术HPLC指纹图谱研究及白术内酯Ⅰ和Ⅲ的含量分析



全 文 :China Pharmacy 2012Vol.23No.39 中国药房 2012年第23卷第39期
文献的换算关系,经讨论后自拟了换算公式,能否准确地反映
蕨菜总黄酮的实际含量,尚需进一步研究。
本试验所得到蕨菜总黄酮含量在3.45%~3.77%之间,较
文献[2]报道的7.8%有较大差距,这可能与测定选取的方法有
关,尚需进行2种方法的比较研究。
参考文献
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(收稿日期:2011-10-12修回日期:2012-05-18)
关苍术HPLC指纹图谱研究及白术内酯Ⅰ和Ⅲ的含量分析
刁继红1*,杨绍群2,刘 爽2,梁 刚2,梁 贺2,张善玉2#(1.延边大学附属医院药剂科,吉林 延吉 133000;2.长
白山生物资源与功能分子教育部重点实验室,吉林 延吉 133000)
中图分类号 R284.1;R917 文献标志码 A 文章编号 1001- 408(2012)39-3714-0
DOI 10.6039/j.issn.1001- 408.2012.39.24
摘 要 目的:建立关苍术的高效液相色谱(HPLC)指纹图谱,并测定关苍术中白术内酯Ⅰ和Ⅲ的含量。方法:指纹图谱和含量测
定研究的色谱柱分别为 Kromasil C18(250mm×4.6mm,5μm)和 ODS Hypersil C18(250mm×4.6mm,5μm),检测波长分别为240
nm和220nm,流动相分别为水-乙腈(梯度洗脱)和甲醇-水(60∶40,V/V),流速为1mL·min-1,进样量为10μL。结果:关苍术指纹
图谱中共标定了9个共有指纹峰,10批样品的相似度均>0.9。白术内酯Ⅰ和Ⅲ的进样量分别在50.1~417.5ng(r=0.9997)和
49.5~412.5ng(r=0.9998)范围内与各自峰面积积分值呈良好线性关系,平均加样回收率分别为101.02%和97.12%,RSD分别为
4.32%和4.01%(n均为9)。结论:所建指纹图谱具有较好的精密度、重复性和稳定性;所建含量测定方法简单、灵敏、结果可靠,均
可用于关苍术的品质评价和质量控制。
关键词 关苍术;指纹图谱;高效液相色谱法;白术内酯Ⅰ;白术内酯 Ⅲ;含量测定
Study on HPLC Fingerprint of Atractylodes japonica and Analysis of the Contents of AtractylenolideⅠand
Atractylenolide Ⅲ
DIAO Ji-hong(Dept. of Pharmacy,The Affiliated Hospital of Yanbian University,Jilin Yanji 133000,China)
YANG Shao-qun,LIU Shuang,LIANG Gang,LIANG He,ZHANG Shan-yu(Key Laboratory for Natural Reso-
urce of Changbai Mountain &Functional Molecules,Ministry of Education,Jilin Yanji 133000,China)
ABSTRACT OBJECTIVE:To establish HPLC fingerprint of Atractylodes japonica,and to determine the contents of atractyleno-
lideⅠand atractylenolide Ⅲ in A. japonica. METHODS:Fingerprint study and content determination were performed on Kromasil
C18column(250mm×4.6mm,5μm)and ODS Hypersil C18column(250mm×4.6mm,5μm);the detection wavelength was set at
240nm and 220nm;mobile phase consisted of water-acetonitrile(gradient elution)and methanol-water(60∶40,V/V)at the flow
rate of 1mL·min-1. The injection volume was 10μL. RESULTS:There were 9common peaks in the fingerprints of A. japonica,
and the similarity of 10batches of samples was higher than 0.9. The linear ranges were 50.1~417.5ng(r=0.9997)for atractyleno-
lideⅠand 49.5~412.5ng(r=0.9998)for atractylenolide Ⅲ. The average recoveries were 101.02% and 97.12%,and RSDs were
4.32% and 4.01%,respectively(n=9). CONCLUSION:Established fingerprint has good precision,reproducibility and stability;
the method is simple,sensitive and reliable. It is suitable for quality evaluation and control of A. japonica.
KEY WORDS Atractylodes japonica;Fingerprint;HPLC;AtractylenolideⅠ;Atractylenolide Ⅲ;Content determination
*副主任药师。研究方向:临床药学。电话:0433-2660042。
E-mail:jhdiao123@163.com
# 通讯作者:研究员,硕士。研究方向:中药质量标准。电话:
0433-2435063。E-mail:syzhang@ybu.edu.cn
􀤊􀤊􀤊􀤊􀤊􀤊􀤊􀤊􀤊􀤊􀤊􀤊􀤊􀤊􀤊􀤊􀤊􀤊􀤊􀤊􀤊􀤊􀤊􀤊􀤊􀤊􀤊􀤊􀤊􀤊􀤊􀤊􀤊􀤊􀤊􀤊􀤊􀤊􀤊􀤊􀤊􀤊􀤊􀤊􀤊􀤊􀤊􀤊􀤊􀤊􀤊􀤊􀤊􀤊􀤊􀤊􀤊􀤊􀤊􀤊􀤊􀤊􀤊􀤊
关苍术为多年生草本菊科植物关苍术Atractylodes japoni-
ca Koidz. ex Kitam的干燥根茎,别名关东苍术、抢头菜。其味
辛、苦,性温无毒,具有健脾燥湿、发汗解表、明目、祛风、辟秽
的功效[1]。在日本和韩国,关苍术根茎常被作为白术使用;而
··3714
中国药房 2012年第23卷第39期 China Pharmacy 2012Vol.23No.39
我国朝鲜族民间经常把关苍术作为治疗胃溃疡、慢性胃炎及
消化系统疾病的药物,疗效甚佳。关苍术中含有苍术酮和白
术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ等桉烷型倍半萜烯类和聚乙炔类及多糖等化
合物[2]。本研究建立了关苍术的高效液相色谱(HPLC)指纹图
谱,同时对关苍术中白术内酯Ⅰ和Ⅲ的含量进行了测定,为建
立稳定、可靠、全面的关苍术质量控制方法提供借鉴。
1 仪器与试药
HPLC 仪,包括 LC-10ATvp 泵、SPD-10Avp 紫外检测器、
AT-330柱温箱(日本岛津公司);AS3120A超声波清洗脱气器
(天津奥特赛恩斯仪器有限公司,功率:120W,频率:40kHz)。
乙腈、甲醇为色谱纯,水为重蒸水,其他试剂均为分析纯;
苍术、白术对照药材(中国食品药品检定研究院,批号分别为
120932-200405、120925-200708);白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅲ对
照品(芜湖甙尔塔医药科技有限公司,纯度均>98%)。关苍
术于2008-2010年分别采集或购买于吉林(汪清、延吉)和黑
龙江(黑河、伊春)等地(来源见表1),经延边大学药学院生药
学教研室吕慧子副教授鉴定均为真品。
表1 样品来源、相似度和白术内酯Ⅰ、Ⅲ含量测定结果
Tab 1 Source and similarity of samples and content determi-
nation of atractylenolideⅠandⅢ
编号
S 1
S 2
S 3
S 4
S 5
S 6
S 7
S 8
S 9
S 10
B 1
C 1
品种
关苍术
关苍术
关苍术
关苍术
关苍术
关苍术
关苍术
关苍术
关苍术
关苍术
白术
苍术
来源
吉林汪清(野生,2008-10)
吉林延吉(野生,2008-10)
吉林延吉(野生,2009-10)
黑龙江伊春(野生,2008-10)
黑龙江伊春(野生,2009-10)
黑龙江黑河(野生,2009-10)
吉林延吉(栽培,2009-05)
吉林汪清(栽培,2010-05)
吉林汪清(野生,2009-10)
吉林汪清(野生,2010-10)
中国食品药品检定研究院
中国食品药品检定研究院
相似度
0.988
0.941
0.991
0.960
0.938
0.913
0.975
0.954
0.913
0.904
0.733
0.309
白术内酯Ⅰ/%
0.106
0.102
0.081
0.055
0.067
0.120
0.082
0.128
0.096
0.103
0.059
-
白术内酯Ⅲ/%
0.064
0.053
0.046
0.030
0.084
0.079
0.038
0.094
0.061
0.058
0.049
-
2 方法与结果
2.1 HPLC指纹图谱研究
2.1.1 色谱条件 色谱柱:Kromasil C18(250mm×4.6mm,
5μm);柱温:25℃;流动相:水(A)-乙腈(B),梯度洗脱(0~8
min,40%B→50%B;8~28min,50%B→85%B;28~40min,
85% B→100%B;40~50min,100%B→100%B;50~51min,
100% B→80% B;51~60min,80% B→40% B);流速:1mL·
min-1;检测波长:240nm;进样量:10μL。
2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取白术内酯Ⅲ对照品适
量,以甲醇溶解并定容于100mL量瓶中,过0.45μm微孔滤膜,
即得白术内酯Ⅲ浓度为18.7μg·mL-1的对照品溶液。
2.1.3 供试品溶液的制备 取样品粉末0.2g,加甲醇10mL,称
重,超声提取30min,再次称重,以甲醇补足失重,再以3000r·
min-1离心5min,取上清液,过0.45μm微孔滤膜,即得供试品
溶液。
2.1.4 精密度试验 取S1样品适量,按“2.1.3”项下方法制备
供试品溶液,精密吸取10μL,在上述色谱条件下连续进样6
次,记录指纹图谱,选择9个共有峰进行比较。结果表明,各共
有峰相对保留时间的RSD均<0.9%,相对峰面积的RSD均<
2.7%,表明本方法精密度良好,符合指纹图谱技术要求。
2.1.5 重复性试验 取S1样品适量,按“2.1.3”项下方法平行
制备6份供试品溶液,精密吸取10μL,在上述色谱条件下进样
分析,选择9个共有峰进行比较。结果表明,6份样品色谱中各
共有峰相对保留时间的 RSD 均<0.7%,相对峰面积的 RSD
均<2.3%,表明本方法重复性良好。
2.1.6 稳定性试验 取S1样品的供试品溶液适量,在上述色
谱条件下分别于0、1、3、6、12、24h进样分析,记录指纹图谱,
选择9个共有峰进行比较。结果,各共有峰相对保留时间的
RSD均<0.8%,相对峰面积的RSD均<2.1%,表明供试品溶
液在24h内稳定。
2.1.7 HPLC指纹图谱共有模式的建立 取各样品粉末适量,
分别按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液,精密吸取10μL,在
上述色谱条件下进样分析,记录指纹图谱。根据《中药注射剂
指纹图谱研究的技术要求(暂行)》规定,进行指纹图谱相似度
的比较,制成标准对照指纹图谱,见图1;10批关苍术的HPLC
指纹图谱见图2。统计各批次样品共有峰面积比,结果为
90.7%~97. %。
2.1.8 参比峰的选择 通过色谱图比较,可知各样品色谱图
中3、4、5、6、7、9号峰信号较强,且有较好的分离。经与白术内
酯Ⅲ对照品溶液的色谱峰进行比对,确定保留时间约为15.78
min处的色谱峰(4号峰)为白术内酯Ⅲ对应色谱峰,故选取4
号峰为参照峰(S),计算各峰的相对保留时间。结果,10批关
苍术样品中各共有峰相对保留时间的RSD均<1.55%。
2.1.9 指纹图谱相似度分析 样品与对照指纹图谱共有模
式之间的相似度以峰面积积分值的夹角余弦法计算,结果见
表1。
0 10.83 21.76 32.50 43. 4 54.17 min
1
2
3
4(S)
5
6
7
8 9
图1 关苍术的HPLC标准对照指纹图谱
4.白术内酯Ⅲ(S)
Fig 1 Standard HPLC fingerprints of A. japonica
4. atractylenolide Ⅲ(S)
R
S10
S9
S8
S7
S6
S5
S4
S3
S2
S10 10.83 21.76 32.50 43. 4 54.17 min
图2 10批关苍术的HPLC指纹图谱
Fig 2 HPLC fingerprints of 10batches of A. japonica
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China Pharmacy 2012Vol.23No.39 中国药房 2012年第23卷第39期
2.1.10主成分分析 采用SPSS16.0软件对10个不同产地关
苍术药材和白术、苍术对照药材共有模式的色谱数据进行主
成分分析,分别求得对应于2个最大特征值的主成分 PC1和
PC2,投影见图3。按照图示,将关苍术药材聚为一类,白术和
苍术分别单独归于一类,可较明显地与关苍术样品进行区分。
2.2 白术内酯Ⅰ和Ⅲ的含量测定
2.2.1 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱:ODS Hypersil
C18(250mm×4.6mm,5μm);流动相:甲醇-水(60∶40,V/V);流
速:1mL·min-1;柱温:28℃;进样量:10μL;检测波长:220
nm。在此色谱条件下,取适量供试品溶液和对照品溶液进样
测定。结果表明,供试品溶液色谱图中,在与对照品溶液相同
保留时间处有相应的色谱峰,且与杂质有较好的分离。理论
板数按白术内酯Ⅰ和Ⅲ峰计算均不应低于3000,分离度>
1.5。色谱见图4。
2.2.2 混合对照品溶液的制备 分别精密称取白术内酯Ⅰ和
Ⅲ对照品各适量,以甲醇溶解并定容于100mL量瓶中,得白术
内酯Ⅰ和Ⅲ浓度分别为16.7和16.5μg·mL-1的混合对照品溶
液,过0.45μm微孔滤膜,即得。
2.2.3 供试品溶液的制备 取样品粉末(过40目筛)0.5g,精
密称定,加25mL甲醇,称重,超声提取30min,再次称重,以甲
醇补足失重,再以3000r·min-1离心5min,取上清液,过0.45
μm微孔滤膜,即得。
2.2.4 线性关系考察 按“2.2.1”项下色谱条件,取混合对照
品溶液分别进样3、5、10、15、20、25μL,依法测定。以进样量
(X,ng)为横坐标,峰面积积分值(Y)为纵坐标,进行线性回归,
得白术内酯Ⅰ和Ⅲ的回归方程分别为Y=2217.8X+3678(r=
0.9997,n=6)、Y=2955X-8460.7(r=0.9998,n=6)。结果
表明,白术内酯Ⅰ和Ⅲ的进样量分别在50.1~417.5、49.5~
412.5ng范围内与各自峰面积积分值呈良好的线性关系。
2.2.5 精密度试验 取同一混合对照品溶液适量,连续进样6
次,记录峰面积。结果,白术内酯Ⅰ和Ⅲ的 RSD 分别为
0.366%和0.369%(n均为6),表明仪器精密度良好。
2.2.6 稳定性试验 取S3样品的供试品溶液适量,分别于0、
3、6、20h 进样测定,记录峰面积。结果,白术内酯Ⅰ和Ⅲ的
RSD分别为1.07%和2.82%(n均为4),表明供试品溶液在20h
内稳定性良好。
2.2.7 重复性试验 称取 S3样品粉末约0.5g,精密称定,按
“2.2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液,依法测定。结果,
样品中白术内酯Ⅰ和Ⅲ的平均质量分数分别为0.082%和
0.045%,RSD分别为2.78%和4.19%(n均为6),表明本方法重
复性良好。
2.2.8 加样回收率试验 称取 S3样品粉末约0.25g,精密称
定,分别精密加入330μg·mL-1的白术内酯Ⅰ对照品溶液0.5、
0.6、0.7mL 和520μg·mL-1的白术内酯Ⅲ对照品溶液0.20、
0.25、0.30mL,分别按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液(各水
平平行3份),测定样品含量并计算加样回收率。结果,白术内
酯Ⅰ和Ⅲ的平均加样回收率分别为101.02%和97.12%,RSD
分别为4.32%和4.01%(n均为9)。
2.2.9 样品含量测定 取各样品适量,分别按“2.2.3”项下方
法制备供试品溶液,照“2.2.1”项下色谱条件进样测定,以外标
法计算样品中白术内酯Ⅰ和Ⅲ的质量分数,结果见表1。
3 讨论
试验考察了乙腈、乙腈-甲醇(1∶1,V/V)、70%甲醇、甲醇等
不同提取溶剂的超声(30min)、回流(2h)和索氏(3h)提取法,
结果以甲醇超声提取效果较好,并且方法更简便、快捷;再经
考察15、30、45、60min超声提取1次或2次的提取效果比较,
确认以甲醇超声提取30min,一次即可提取完全。
经205、220、240、254、300nm 等检测波长下的色谱图比
较,发现在240nm波长处色谱图信号丰富,各色谱峰分布较均
匀,且关苍术中各成分在此波长处吸收良好、分离度较好,而
白术内酯Ⅰ和Ⅲ在220nm波长处峰面积较大,故指纹图谱研
究和含量测定中分别选用240nm和220nm作为检测波长。
在流动相的选择中,对不同比例的乙腈-水和甲醇-水进行
了考察[3,4]。结果发现,以甲醇-水(60∶40,V/V)为流动相系统,
样品中白术内酯Ⅰ和Ⅲ可得到很好的分离;而在指纹图谱研
究中,采用乙腈-水进行梯度洗脱,各色谱峰保留时间适中,相
互之间分离度较好。
关苍术、白术和苍术是亲缘关系很近的同科同属药用植
物,以往进行的鉴别研究基本是在外观性状、显微鉴别、薄层
色谱等层面上进行区别,本试验首次同时测定了关苍术中白
术内酯Ⅰ和Ⅲ的含量,还首次将HPLC指纹图谱法运用到关苍
术药材的鉴定与质量评价中。从试验结果可知,虽各批样品
成分的含量有差异,但色谱图概貌一致,指纹图谱相似度均≥
0.904,而白术、苍术与关苍术标准图谱的相似度分别为0.733
和0.309,表明本方法对关苍术的鉴别具有较好的专属性。
综上所述,本研究制定的指纹图谱具有精密、稳定、重复
性好的特点;白术内酯Ⅰ和Ⅲ的含量测定方法简单、灵敏、结
果可靠,可应用于关苍术的品质评价和质量控制。
参考文献
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1.5
1.0
0.5
0.0
-0.5
-1.0
-1.2
-2.0
-2.5
-3.0-1.5 -1.0 -0.5 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
PC1
PC
2
图3 主成分投影图
S1~S10.关苍术;B.白术;C.苍术
Fig 3 PCA projection plot
S1~S10. A. japonica;B. A. macrocephala;C. A. lancea
0 5 1015202530354045min
A
1 2
0 5 1015202530354045min
B
1
2
图4 高效液相色谱图
A. 供试品;B. 混合对照品;1.白术内酯Ⅲ;2.白术内酯Ⅰ
Fig 4 HPLC chromatograms
A.test sample;B.mixed control;1.atractylenolide Ⅲ;2. atractylenolide Ⅰ
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中国药房 2012年第23卷第39期 China Pharmacy 2012Vol.23No.39
陈皮(Citri Reticulatae Pericarpium)来源于芸香科(Rutace-
ae)柑橘属(Citrus L.)柑橘种(Citrus reticulata Blanco)及其变
种,常见的种及变种有大红袍(C. reticulata‘Dahongpao’)、茶
枝柑(C. reticulata‘Chachi’)、朱橘(C. erythrosa Tanaka)、福橘
(C. reticulata‘Tangerina’)等,为9~12月份果实成熟时采摘
的果皮。业界一般认为来源于茶枝柑、四会柑等的广陈皮品
质较佳,其他来源的陈皮次之;多年者更佳。陈皮的功效为理
气健脾、燥湿化痰;作用部位主要在中上焦[1~4]。重庆市的万州
区、江津区盛产大红袍红橘,特别是万州区,是全国种植大红
袍红橘历史悠久、面积和产量都最大的地区。本试验以来源
于重庆产大红袍红橘的陈皮为研究对象,系统地研究其中的
挥发油成分。
中药的挥发油是一个十分复杂的体系,含有数以百计的
化学成分。挥发油的气相色谱-质谱(GC-MS)数据也包含许
多重叠,甚至内嵌峰。这些重叠与内嵌峰可能给正确的定性、
定量分析带来困难[4,5]。为解决这一难题,有研究人员应用化
学计量学方法,如交互移动窗口因子分析法(Alternative
Moving Window Factor Analysis,AMWFA)、直观推导式演进
特征投影法(Heuristic Evolving Latent Projections,HELP)等,
对陈皮挥发油成分的GC-MS数据进行解析和比较[4,5]。基于
GC-MS 数据分析与自动质谱退卷积定性系统(Automated
Mass Spectral Deconvolution & Identification System,AMDIS)
*讲师,博士研究生。研究方向:中药药效物质基础与质量标
准。E-mail:wj_2000_abc@163.com
# 通讯作者:副教授。研究方向:中药鉴定。E-mail:cqzyhd@163.
com
源于重庆产大红袍红橘的陈皮挥发油成分研究
王 坚*,王 刚 #(重庆医科大学中医药学院,重庆 400016)
中图分类号 R284.1;R917 文献标志码 A 文章编号 1001- 408(2012)39-3717-04
DOI 10.6039/j.issn.1001- 408.2012.39.25
摘 要 目的:研究源于重庆产大红袍红橘的陈皮挥发油成分。方法:采用水蒸气蒸馏法提取挥发油,气相色谱-质谱(GC-MS)联
用技术测定挥发油成分;利用GC-MS数据分析与自动质谱退卷积定性系统(AMDIS)软件对挥发油总离子流(TIC)中的重叠峰进
行解析。结果:共定性、定量了70个化合物,总含量为96.343%。含量最高的5个化合物分别为柠檬烯、芳樟醇、百里香酚、γ-萜品
烯、α-甜橙醛,分别占总含量的48.089%、16.066%、6.776%、5.916%、2.899%。单萜烯(共13个)是含量最大的一类化合物,占
56.062%;含氧化合物(共44个)占的比重较大,为36.497%,主要的几类物质是醇、酚、醛。结论:源于重庆产大红袍红橘的陈皮挥
发油成分属于柠檬烯/芳樟醇化学型。GC-MS数据分析与AMDIS软件的联合使用可以较好地解决中药挥发油TIC中重叠峰解析
的难题。本研究结果将促进重庆产大红袍红橘的深层次开发利用。
关键词 陈皮;大红袍红橘;挥发油;化学型;气相色谱-质谱联用技术;自动质谱退卷积定性系统
Study on Volatile Oil of Citri Reticulatae Pericarpium in Citrus reticulata‘Dahongpao’from Chongqing
WANG Jian,WANG Gang(College of Traditional Chinese Medicine,Chongqing Medical University,Chongqing
400016,China)
ABSTRACT OBJECTIVE:To investigate the volatile oil of Citri Reticulatae Pericarpium in Citrus reticulata‘Dahongpao’from
Chongqing. METHODS:The volatile oil was extracted by steam distillation and analyzed by GC-MS. The overlapped peaks of TIC
were resolved by the programs of GC-MS data analysis and AMDIS. RESULTS:A total of 70compounds in volatile oil were identi-
fied,accounting for 96.343% of total content. The five compounds that had the highest content were limonene,linalool,thymol,
γ-terpinene and α-sinensal,accounting for 48.089%,16.066%,6.776%,5.916%,and 2.899%,respectively. Monoterpenes(13
compounds)had the largest content,representing 56.062%. The oxygenated compounds(44compounds)occupied a large propor-
tion(36.497%),and the main compounds were alcohol,phenol,and aldehyde. CONCLUSION:The volatile oil of Citri Reticula-
tae Pericarpium in C. reticulata‘Dahongpao’from Chongqing belongs to the chemotype of Limonene/Linalool. The combined use
of GC-MS data analysis and AMDIS can efficiently solve the difficulty in the qualitative and quantitative analysis of overlapped
peaks of TIC. The study will boost the development and utilization of C. reticulata‘Dahongpao’produced in Chongqing deeply.
KEY WORDS Citri Recticulatae Pericarpium;Citrus reticulata‘Dahongpao’;Volatile oil;Chemotype;GC-MS;AMDIS
(3):50.
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(收稿日期:2012-03-16修回日期:2012-08-28)
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