全 文 ：军 医 大 学 学 报
S e eMi l M ed U n i v
20 0 婆 J天,亡 ; 2吕( 2 2 )
1 3 8 5
· 实脸研究 ·奇篙不同溶剂提取物对大鼠烧伤创面愈合的作用
E f f e c t s o f A r t e m i s i a a n o m a l a 5
.
M o o r e e x t r a e t s o n w o u n d h e a l i n g o f b u r n e d r a t s
华 ’ ,秦路平 “ , 郑汉 臣 ` , 张巧燕 里 , 邢 新“
第二军 医大学药学院生药学教研室 , 上海 2 0 0 4 3 3 ; 2 . 长海医院整形 外科 , 上海 2 0 0 4 3 3)
年(l
仁摘要〕 目 的 : 研究奇篙对伤 口 愈合的影响 , 以证实其在创面愈合过程 中所起的重要作 用 。 方 法 : 将奇篙不同溶剂 ( 石 油醚 、
氛仿 、 乙酸 乙醋 、 正 丁醇 )提 取 物应用于大 鼠背部深 皿度烫伤模型 , 通过 不同时间创 面 愈合 的肉眼 观察 、 计算机图像分析 、 活检
标本的细胞 D N A 周期分析及创面 组 织 病理切 片等方法观察上皮愈合的情况 。 结 果 : 奇篙氯仿提取物组创面平均愈合 时间为
( 1 5
.
0 1士 1. 0 0 ) d , 空 白组为 ( 2 1 . 1 2士 1 . 3 4 ) d ( P < 0 . 0 1 ) ; 氯仿 组创面径脯氨酸 ( 伤后 5 、 1 0 、 1 5 d )及 S 期细 胞 百分 比 (伤后 1 0 、
20 d) 明显高于对照组 (尸 < 。 . 01 ) , 提示其有促进创面 愈合 的疗效 。 结击 : 奇篙氧仿提取物有明显的促进创面愈合的作用 。
[关键词 〕 奇篙 ; 氯仿 ;创 面愈合 ; 烧伤
[中图分类号 ] R 2 8 2 . 7 1 0 . 7 仁文献标识码 ] B [文章编号 ] 0 2 5 8 一 s 7 9X ( 2 0 0 4 ) 1 2一 x 3 8 5一 0 3
奇篙 (乃 rt e胡 i s za * n o o a za 5 . M o o r e ) 又名南刘寄奴 、 六月
霜 , 全草人药 , 始载于南北朝 的《雷公炮制论 》 , 以后历代主要
本草如 《唐本草 》 、 (证类本草 》和 《中华本草 》等均有收载 , 为
传统中药刘寄奴 的正 品 。 《本草蒙荃 》川中就有记载其能 “ 消
锨肿痈毒 , 灭汤火热痛 。 ” 中 医认为奇篙具有敛疮消肿 、 破癖
通经的功效 , 主治跌打损伤 、 金疮 出血 、烫 伤等症 。 尤其在治
疗跌打损伤 、 金疮出血方面有非常好的疗效 。 本研究应用大
鼠背部深 皿度烧伤创面模 型 , 研究奇篙 的促伤 口愈合作 用 ,
并探讨其可能的机制 。
材料和方 法
1
.
1 试 别和仪 器 奇篙药材 〔购于杭州胡庆余堂药店 ) , 积
雪草昔 (上 海 亚东制药 厂 ) , 氯氨 T ( is g m a ) , 胶 原酶 ( w or -
t h in g t o n )
,
R N A 酶 ( A m r e s e o ) ,碘化丙呢 ( 上海普飞生物技术
有限公司 ) 。 流式细胞计数仪 ( B e e s o n D ie k in s o n ) , 计算机 图
像分析仪 ( A S T 3 8 6 / p F G Im a g e b r o a d ) ,控温控压电烫仪 (第
二 军 医大学 烧伤中心研制 ) , U l t r 。 、 p e c 3 o 。。 型 分光光 度仪
( p h ” r o a e ia B i o t o e h ) , 电子恒 温电烫仪 。
1
.
2 提取物的制备 将 4 0 k g 干燥原药材用 80 % 乙醇渗流
法提取 ( 6 5 C ) , 渗谁液经薄膜蒸发装置浓缩 、 干燥成粉末 , 取
干燥粉末约 I k g , 用石油醚浸泡 24 h , 过滤 、 浓缩 、 干燥 得石
油醚提取物 ;滤渣干燥 后以氯仿浸泡 24 h , 过滤 、 浓缩得氯仿
提取物 ; 滤渣干燥后用 乙酸 乙醋浸泡 2 4 h ,过 滤 、 浓缩得乙 酸
乙醋提取物 ;滤渣 干燥后再用正丁醇浸泡 24 h ,过滤 、 浓缩得
正丁醇提取物 。
1
.
3 动物模 型的建立 清洁级 S D 大鼠 , 体质量 2 0 ~ 2 50
g
, 雌雄各半 ( 由第二军 医大学实验动物中心提供 ) 。 随机分成
6组 : 空白组 ( 生理盐水组 ) 、 积雪草昔组 (阳性对照组 ) 、 奇篙
石油醚 、 氯仿 、 乙酸乙醋和正丁醇提取物组 。 实验前 l d , 剪去
大鼠背部毛 , 用 8 %硫化钠脱毛 。 实验当天动物在 2 . 5纬戊巴
比妥钠 ( 35 m g / k g ,腹腔注射 )麻醉下 , 用恒温控压 电烫仪在
动物背部一侧以 90 C烫 10 5 的致伤条件 , 制成直径 为 2 . 5
c m 的圆形深 皿度烧伤创 面 (烧伤深度由病理组 织 切 片证
实 ) ,待醒后分组给药 , 单笼饲养 。
1
.
4 创 面 处 理和 用 药方 法 用药前用无 菌生理盐 水 ( N )S
擦拭创 面 , 去腐皮 及局部坏死组织 。 清创后 , 每个创面按分组
分别滴加 N S ( 。 . 2 0 1) 、 奇篙不同提取物 (每个创面每天用 药
量 以生药计为 1 9 c/ m Z , 再覆盖无菌纱布包扎 ) 、 积雪草昔 0 . 2
m l (浓度为 2 0 % , 以 N S 配制 ) , 连续 Zo d 每天 1 次 。
1
.
5 治 疗效 果评 价 在创面愈合过 程中照相 , 用计算机 图
像灰度积分分析系统来 比较创面愈合的程度 。 通 过观察伤后
不同时间点的创面 面积大小 , 同原始创 面比较 , 计算愈合率
和 平均愈合天数 。 在用药的第 1 0 、 2。 天 ,取创面组织做活检 ,
经 胶原酶 37 C 恒温烘箱内消化 30 m in , 分离表 皮及上皮 细
胞 , 用流式 细胞计数仪分析创面愈合过程 中细胞 D N A 周期
的变化陈 3了。 伤后第 l 。 、 1 5 、 2 0 天 , 取创 面组织进行匀浆 ,采用
氯氨 T 氧化法比 5 〕测定组织中经脯氨酸 含量 。 每天观察创 面
的 干湿 度和上皮皮岛出现的情况 , 同时观察创 面愈合情况 口
病理 活检组织 取下 后置 40 % 甲醛中保存 , 采用石蜡包埋切
片 , 行常规 H一 E 染色病理学观察 , 观察皮肤组织形态学变化 。
1
.
6 统计 学处理 数据以 于 士 、 表示 , 采用 ` 检验 。
结 果
2
.
1 创面 大体观察和病理 活检 与空 白组相 比 , 奇篙氯仿
提取物创面上皮皮岛出现多 , 伤后 24 h 氯仿提取物组 伤 口
开始出现 少许红晕 , 表 明肉芽组织 已在 生长 , 而 空白组伤 口
湿润 ; 伤后 3 d , 氯仿提取物组 肉芽组织生 长明显 , 局部 己 长
出薄层或点状上皮 ,创 缘皮肤 收缩明显 , 其余各提取 物组 与
空 白组无明显差异 ;伤后 10 d , 氯仿提取物组伤 口干燥 、 无感
染 , 创面 已基本为肉芽组织所填充 , 而阳性 对照组伤口湿润 ,
渗出物较多 , 收缩不 明显 ,仅见薄层肉芽 , 未 见明显的新生上
皮 。 病理 活检表明 , 伤后第 5 天氯仿提取物组 毛囊残余上皮
细胞生长 明显 ( 图 I A ) , 空 白组毛囊残余上皮细胞仅有少量
扛基 金项 目」 全军 医药科研 “ 十五 ”规划课题青年课题 ` 01 Q o 8 5 ) .
仁作者简介」 年 华 ( 1 9 78 一 ) , 男 (纳西族 ) , 博士生 .
E
一
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: za e k y n i a n @ h o tm a i l
. e o m
`
C o r r e s p o n d i n g a u rh o r
·
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: q 宝n 了u p至n g @ h o t m a i i . e o m
·
3 18 6
· 第二军 医大学学报 20 0 4 年 1 2月 , 第 25 卷
增生 ; 伤后第 10 天 , 氯仿提取物组 上皮生 长活跃 , 胶原粗大
( 图 I B ) , 空 白组细胞结构较疏 松 , 胶原纤维稀疏 , 生长缓 慢 。
伤后 10 d 氯仿提取物组 上皮层次 多 , 纤维组织增生较厚 , 真
皮层有较丰富的毛细血管 。
2
.
4 创 面 组织 舟脯氛酸含量 奇篙氯仿提取物的创面羚脯
氨酸 含量 均高于 空 白组 (尸 < 0 . 05 , P < 0 . 01 , 表 3 ) , 实验结
果 与光镜检测及 D N A 检测结 果相一致 , 提示其具有 很好的
胶原修复及重塑能力 。
表 3 创面经脯氨酸含 t 的变化
(刀 一 8 , j 士 、 · 刀 ,一; /产g · m g l )
伤后天数 ( l / d)
班日 力 lJ _ _ _ _
5 I U l b
空 白
积雪草昔
石 油醚提取物
氯仿提取物
乙酸乙酷提取物
正 丁醇提取物
2 0
.
3 4士 0 . 4 6 2 0 . 6 3土 0 . 42 18 . 3 5士 0 . 3 4
2 1
.
8 6士 0 . 6 7 . 2 0 . 7 8土 0 . 50 18 . 9 8士 0 . 5 6 `
18
.
9 7士 0 . 3 2 2 0 . 4 2士 0 . 7 7 17 . 9 6士 0 . 7 3
2 3
.
9 8士 0 , 9 7 侣 万 22 . 8 9土 0 . 4 9 “ 份 1 9 . 9 7土 0 . 42
1 9
.
7 8士 0 . 5 5 2 0 . 5 8士 0 . 2 2 1 7 . 94 士 0 . 57
2 0
,
0 1士 0 . 5 3 1 9 . 96 士 0 . 3 7 18 . 2 1士 0 . 4 1
图 l 创面组织病理检 查结果 (H 一 E )
A
: 伤后 s d ( 只 4 ) ; B : 伤后 l o d ( x 1 o )
`
P < 。 . ()5 · “ ’ P < 0 . 0] 与空白组 比较
3 讨 论
2
.
2 创 面愈合 结果 奇篙各提取物组创面结痴时间较对 照
组 早 , 创面渗出物少 ;氯仿提取物平均愈合时间为 ( 1 5 . 01 士
1
.
0 0 ) d
. 积雪草昔组为 ( 1 7 . 2 3 士 0 . 1 4 ) d , 与空 白组 ( 2 1 . 1 2 士
1
.
3,1 ) d相 比存在显著差异 (尸 < 。 . 01 ) 。 同时外用氯仿提取物
伤后 5 、 10 和 巧 d 的 创面 愈合率也 高于空 白组 ( P < 。 . 01 ,
表 l ) 。
表 l 奇禽提取物对烧伤创面愈合率的影响
(
, , = 1 5
, 于 士 , , % )
伤后天数 ( t / d )
牛以 刀 lJ 一 - ,一一一一 - - -一一一5 10 1 5.一- - 一一 、一一一一 -空 白积雪草昔石油醚提取物氧仿提取物乙 酸乙酷提取 物正 丁醇提取物 0 . 2 5士 0 . 1 10 . 2 9士 0 . 10 两0 . 2 2士 0 . 0 80 . 3峨士 0 . 12 ’0 . 2 3 士 0 . 10( ) . 2 5 士 0 . 12 0 . 5 1 土 0 . ( )90 . 6 1 士 0 . 1 1 盈0 . 4 0士 0 . 0 80 . 7 0 士 ( ) . 0 6 杏 `0 . 4 7士 0 . 0 70 . 5 2士 0 . 1 1 0 . 7 7土 0 . 1 20 . 8 1士 0 . 1 4 件0 . 6 8士 0 . 1 30 . 9 8士 0 . 1 6 甘0 . 7 0 士 0 . 1 10 . 7 6 + 0 . ] I
尸< 0 . 0 5 , ’ ` P < 。 . 01 与空 白组 比较
2
.
3 全厚皮肤 D N A 的流式 细胞仪分析结果 奇篙氯仿提
取物的 S 期细胞百分比均高于空 白组 ( P < 0 . 01 ,表 2 ) , 表明
其具有促进表皮细胞 和上皮组织的细胞增殖与修复的功能 。
表 2 外 用奇禽不 同提取物后烧伤
创面 S 期 细胞百分 比的变 化
( , , 一 l ( ) , 于士 、 , % )
组 别 伤后天数 ( l/ d)-一 - ~一 ~一一一 `- ~一 ~- 一一一- -1 0 ? 门空白
积雪 草普
石油醚提取物
氯仿提取物
乙 酸乙酷提取物
正丁醇提取物
1 0
.
0 1士 1 . 4 3
1 2
.
9 8士 1 . 6 7 `
1 0
.
0 2 士 1 . 1 1
3 5
.
58 上 2 . 9 7 `
9
.
3 4士 1 . 0 0
9
.
3 2士 1 . 0 3
4
,
1 5土 0 . 4 2
5
.
9 7士 0 . 5 0 `
要. 0 1士 () . 7 7
1 0
.
3 5士 1 . 4 9 . 祖
3
.
9 2士 0 . 22
烧伤创面愈合主要包括炎性 反应 、 细胞增殖 、 结缔组织
形成和组织塑形等过程 , 且创面愈合又要符合细胞生长的许
多微环境 。 炎性 反应不仅为清除坏死组织 和异物所必需 , 且
同时启动和调控创面修复 。 细胞增殖 主要为成纤维细胞 和表
皮细胞 的增殖 , 是烧伤愈合过 程关键环节 。 创面愈合是细胞
不断增殖分化的过程 , 当细胞分裂增殖时 , 细胞周期中的 G
期细胞不断进人 S 期 , 使 S 期细胞所占比例增加 , D N A 的合
成和含量就增加 , 检测 S 期细胞 比例是评价创面细胞增殖强
弱 的有效指标 厂` 1 , 本组结果表明 , 氯仿提取物组 S 期细胞 百
分率较 空 白组高 , 说 明细胞增殖更活跃 , 从 而使创面愈合时
间缩短 。 此外 . 结缔组织主要成分是成纤维细胞及其形成的
胶原蛋白 。 胶原的沉积 和修复是创面愈合的重要表现 , 胶原
的主要成分是经脯氨酸 , 其在胶 原中所 占的 比例是恒定的 ,
测 经脯氨酸含量可反映胶原含量 , 这也是创面愈合的主要指
标川 , 实验 发现奇篙氯仿提取物能明显 促进创面胶原的合
成 , 与空 白组相 比经脯氨酸含量达峰时间早且峰值高 。
通 过前期的大量实验研究观察了低 、 中 、 高不同浓度剂
量下外用提取物对伤 口愈合的影响 , 我们发现本实验中的剂
量能很好的在创面发挥作用 , 不 同提取物 的化学成分稳定 、
无不 良作用 。 而且 ,我们采用 了目前临床上疗效确切的中药
提取物积雪草昔为阳性对照 , 增强 了模型筛选的可靠性 8[, g J。
研究结 果提示 :奇篙氯仿提取物对烧伤创面的愈合具有
很好的促进作用 , 这可能是 通过促进胶原合成及影响细胞增
殖的途 径来实现 的 。 我们的研究还发现奇篙氯仿提取部位的
化学成分主 要为黄酮类化合物 , 该类成分有 很强 的抗 炎 、抗
菌活性 , 这可 能更好 的帮助创面愈合 . 为创 面修复提供合适
的微环境 , 其促进愈合的确切机制及活性成分的研究有待进
一步探索 。
“
P < 0
.
()5
, .
P < 0
.
01 与空白组比较
仁参 考 文 献 ]
仁门 陈嘉漠 . 本草蒙签仁M 〕. 北京 : 人民 卫生 出版社 , 1 98 . 1 94 .
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第 二 军 医
A e ad J Se e M
大 学 学 报
11 M
e
d U ni v 2
0 0 4 D
e e ; 2 5 ( 1 2 )
.
1 3 87
.
[ 3」 B a t a一 e s o r g o Z , H a m m e r b e r g e , v o o r h e e s JJ . 尸 l 。 1 . F l o w 。 y , o -
m e t r i e id e n t i f i e a t i o n o f p r o l i f e r a r i v
e s u b p o p u l a t l o n w i t hi n n o r
-
m a l h u m a n e p id
e r m i
s a n d t h e Io e a li z a t i o n o f t h e p
r im a r y h y p e r
-
p r o l i fe r a t i v e p o p
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l o t i o n i n p 、 o r i。 、 15 〔J」二了& 户桥口 . 1 9 9 3 . 2 7 8
( 4 )
:
12 7 1
一
12 8 1
.
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r
m
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[收稿 日期 j 2 0 0 4一 0 5一 0 4 [修回 日期 习 20 0 4一 0 9一 。
〔本文编辑」 尹 茶
一 十一卜一卜 目斗 一卜 , 州卜一卜 , ~ 卜 . 十 , 十 , + , 十 、 ~十 . 十 一十 . 十 . 十 . 十 勺斗 时 日卜 为斗 勺冲 , 十 · 刁卜 一刊卜 · 洲卜一卜 · 刊卜 , 州卜 · 斗~ · 叫卜 ~ .十 一卜 · 州卜 · 司卜一卜 . 州卜一卜一卜 ~ 十 · 十 . 十 . 十 , ~十 , 州卜一卜一卜一十 ·州卜 , 叫卜 ·
· 临床研究 ·卵巢上皮癌组织及腹腔液中 C K 7 m R N A 表达的意义
E x P r e s s i o n o f C K 7 m R N A i n e P i t h e l i a l t i s s u e o f o v a r i a n n e o P l a s m a n d i n a s c i t e s
仲建新 “ ,张 私 2 , 邓 艳 ’ ,魏
l(
. 南通 医学院附属医院妇产科 , 南通
群 2 , 史锦云 ’ ,施公胜 “
2 2 6 0 0 1 ; 2
. 消化实验室 ; 3 . 病理科 )
[摘要」 目 的 : 探讨 c K 7 m R N A 在检测卵巢上皮癌 腹腔液微 转移的价值 。 方法 : 用 R T 一 P c R 法检测 39 例 卵巢上皮癌组 织
及腹腔液中 C K 7 m R N A 的表达 , 腹腔液常规作细胞学检查 ; 同时检测 2 6 例良性卵巢上皮性肿瘤及 16 例正 常卵集组织及腹
腔 液作对照 。 结 果 : 癌组 织及其腹 腔液 中的 C K 7 m R N A 的阳性率分别为 10 % 和 89 . 7 % , 两者差异 无显著性 , 与腹腔液细胞
学检查结果 ( 61 . 5% )具有显著差异 (尸 < 0 . 05 ) ; 工~ I 期 卵巢上皮性癌腹 腔液 的 C K 7 m R N A 的 阳性率为 8 4 . 6% , 明显高于其
细 胞 学检查结果 ( 3 0 . 8 % , 尸 < 0 . 05 )及 良性肿 瘤组 ( 26 . 9 % , P < 0 . 01 ) ; 皿 ~ 份 期 卵巢上皮性癌腹腔液 的 C K 7 m R N A 的阳性
率为 9 2 . 3% , 高于其细胞学的阳性率 ( 76 . 9 % , p < 0 . 05 ) 。 结 击 : 卵巢上皮癌腹腔液 中 c K 7 m R N A 的表达是检测腹腔液中癌
细 胞微转移 的有效方法 , 结合腹腔液的细胞 学检查 , 更有助于诊断 。
仁关键词〕 卵巢肿瘤 ; 腹腔液 ; C K 7 m R N A ; 肿瘤转移
仁中图分类号 ] R 7 3 7 . 3 1 仁文献标识码 ] B [文章编号 ] 0 2 5 8 一 8 7 9X ( 2 0 0 4 ) 1 2 一 1 3 5 7 一 0 3
由于现代医学的发展 ,诸多恶性肿瘤的预后有 了很大改
善 .但卵巢癌由于易扩散 、 复发及 缺乏有效的早期诊断方法 ,
近 2。年来 5 年生存率无 明显提高 。 因此及早发现卵巢癌的
微转移癌细胞 , 对预防复发及转移 , 指导临床治疗 , 改善临床
预后非常重要 。 本研究应用 R T 一 P C R 法 , 检测正常卵巢 、 良 、
恶性卵巢上皮性肿瘤组织及腹腔液中 C K 7 m R N A 的表 达 ,
旨在寻找一种早期 、特异 、 灵敏的诊断方法 , 现报告如下 。
材料和方法
1
.
1 研究对 象 收集 2 0 01 年 8 月至 2 0 0 3 年 12 月在我科行
卵巢肿瘤手术患者术后病理证实的新鲜标本及腹水或腹 腔
冲洗液 。 其中良性卵巢上皮性肿瘤 26 例 , 包括浆液性囊腺瘤
1 8 例 ,赫液性囊腺瘤 8 例 ; 卵巢上皮性癌 39 例 , 浆液性囊腺
癌 23 例 ,郭液性囊腺癌 12 例 , 子宫内膜样癌 3 例 , 透明细胞
癌 1 例 。 39 例卵巢上皮性癌按 FI G O 分期 I 期 9 例 , l 期 4
例 , 皿期 16 例 、 刊期 10 例 。 另收集 16 例正常卵巢组织及腹
腔冲洗液 。
1
.
2 标本的收 集与保存 术 中探 查时取腹水 (或腹 腔冲洗
液 ) 20 m l , 3 O0 r /m in 离心 ;取沉渣 ,一半送细胞学检查 , 另
一半一 80 C冷冻保存 。 切取肿瘤组织约 40 9 , 一半送病理学
检查 , 另一半 一 80 C冷冻保存待用 。 子宫肌瘤手术时取部分
卵巢组织及腹腔 冲洗液作为对照 。
1 3 R T
一
P C R 检测 C K 7 m R N A 用天平分别称取 正常 卵
巢 、 良 、恶性卵巢肿瘤组 织 50 m g , 腹腔液离心沉淀标本进行
细胞计数 , 调节细胞密度为 1 0 6 ~ 1 0 7 /m l 。 然后均采用 T R Ioz l
一步法抽提各标本的总 m R N A , 按说明书操作 , 并于紫外分
光光度计上检测其光密度值 ( D ) 。 结果显示 D Z。 /D 28。大于
1
.
8。 ,提示 R N A 的纯度良好 。 C K 7 m R N A 基因引物序列参
照文献 [ 1〕 , 采用 rP im e r 3 软件设计 , 引物序列为 : C K 7 正义
5气 C A C C A T G T C C A T C C A C T T C A 一 3 , , 反 义 5 , 一 C T T
G A T C T G C T C G C T C T C C T
一
3
` , 每例标本 均用管家基 因
仔ac it n 作为内参照 , 引物均 由上 海生物工程 公 司合成 , R T -
P C R 采用 晶美生物工 程有限公司 R ob u s T l R T 一 P C R 试剂
盒 , 按说明书操作 。 逆转录反应条件 : 5 6 C 45 m in 逆转 录合
成 c D N A 。 P C R 反 应条件 : 预变性 9 4 〔、 3 m in ;变性 9 4 ( 3 0
S
, 退火 5 5 ( 、 3 0 5 , 延伸 7 2 〔、 3 0 5 , 循环 4 0 次 ;最后 7 2 ( 、 延伸
5 m in
, 得到反应终产物 。 用 1 . 3%琼脂糖凝胶电泳 , 澳化乙 咤
染色 , 紫外线灯下 观察 。
1
.
4 病理学检查 甲醛固定标本 , 石蜡包埋切片 , H 一 E 染色
[苍金项 目 ] 南通市科技局社会 发展基金资助项 目(S 10 3 1 ) .
仁作者简介〕 仲建新 ( 19 65 一 ) , 男 (汉族 ) , 硕 士 , 副教 授 、 副主任 医
师 .
“
C o r r o s p o n d i n g a u t h o
r .
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