全 文 ：军队/十五0青年基金资助项目( 01Q085)
奇蒿 80%乙醇提取物对大鼠深 Ò 度烧伤创面愈合的影响
谭蔚锋1 郭家红1 邢 新1 年 华2 秦路平2
( 1.第二军医大学长海医院整形外科 , 200433,上海; 2. 第二军医大学药学院, 200433, 上海
/ /第一作者男, 1977 年生,硕士研究生)
摘 要:目的:探讨中药奇蒿 80% 乙醇提取物对大鼠背部深 Ò 度烧伤创面愈合的影响。方法: 采用大鼠
背部深 Ò 度烧伤模型, 创面直径 3cm,创面外用奇蒿 80% 乙醇提取物的生理盐水溶液, 每个创面用药液 0.
2ml,通过伤后不同时相点创面取材,检测羟脯氨酸( OHP)和细胞周期变化, 并统计创面愈合时间,以生理盐
水组(每个创面 0. 2ml)作为对照组, 观察奇蒿 80%乙醇提取物对深 Ò 度烧伤创面愈合的影响。结果: 奇蒿
80%乙醇提取物组创面 OHP 含量及 S 期细胞百分比明显高于生理盐水组 ( P < 0. 01) ;创面愈合时间, 奇蒿
80%乙醇提取物组为17. 88 ? 1. 24 天,生理盐水组为 20. 13 ? 0. 83 天( P < 0. 01) ,提示奇蒿 80%乙醇提取物
可促进创面愈合。结论: 奇蒿 80%乙醇提取物有明显的促进创面愈合的作用, 局部 OHP含量增高, S 期细胞
百分比升高, 创面愈合时间缩短。
关 键 词: 奇蒿; 深 Ò 度烧伤; 创面愈合; 羟脯氨酸; 细胞周期
中图分类号: R931 文献标识码 :A 文章编号: 1009 - 5276( 2004) 05 - 0840 - 03
奇蒿 ( Artemisia anomala S. Moore ) , 菊科艾属植物,
又名刘寄奴、金寄奴、六月霜等, 性味辛、苦、平, 全草入
药, 始载于南北朝的5雷公炮制论6 ,以后历代主要本草如
5唐本草6、5证类本草6和5中华本草6等均有收载。中医
认为奇蒿具有/ 敛疮消肿、破瘀通经、消化积食0的功效,
可治疗痢疾112, 跌打损伤122, 金疮出血、烧伤、乳腺炎132
等疾病。药学研究提示14~ 62:奇蒿具有活血化瘀、抗缺氧
和抗氧化等药理学作用。现代临床使用中发现其能明显
促进创伤愈合, 并且能有效防治创面的感染172, 为验证奇
蒿对烧伤创面愈合的影响, 本实验设计制作了大鼠背部
深 Ò 度烧伤创面模型, 外用/ 奇蒿 80%乙醇提取物0的生
理盐水溶液后, 活检测定创面组织羟脯胺酸( OHP)含量、
细胞周期, 并统计创面愈合时间。
1 实验材料
试剂及仪器 奇蒿 80%乙醇提取物( 40kg干燥原药
材, 80% 乙醇 200L , 65e 渗漉提取, 薄膜蒸发, 干燥待
用) ,氯氨 T( Sigma Inc. 美国) , Ñ 型胶原酶( Wor thington
Inc.美国) , RNA 酶( AMRESCO Inc. 美国) , 1% Triton -
100( AMRESCO Inc. 美国) , 碘化丙啶 PI ( CALBIOHEM
I .美国) , 多功能渗漏提取器 (常州市新祥天然产物分离
设备有限公司 ) , 流式细胞仪 ( Becton Dickinson Inc. 美
国) , Ultrospec 3000 型分光光度仪 ( Pharmacia Bio tech) ,
精确天平(上海天平仪器厂 JA - 2003 型) , 电热恒温培养
箱(上海益恒实验仪器有限公司 DHP - 9272 型) ,水平离
心机(上海安亭科学仪器厂 TDL - 40B 型) , 台式高速离
心机(上海医用分析仪器厂 TGL - 16G 型) ,电子恒温电
烫仪(江苏泰州机械厂)。
实验动物及分组 清洁级 Sprague - Dawley 大鼠 64
只(第二军医大学动物实验中心提供) , 雌雄各半, 重 200
~ 250g。完全随机分两组, 奇蒿 80% 乙醇提取物组 (以
下简称奇蒿提取物组)和生理盐水组,每组 32 只。每只
动物背部烫 1 个创面,按烧伤后 5、10、15、21 天共 4 个时
相点进行取材。
2 实验方法
创面模型的制烧伤备 SD大鼠背部深 Ò 度烧伤模
型制作: 2%戊巴比妥钠( 40~ 45mg /kg 体质量)腹腔注射
麻醉后,剪除背部长毛, 涂 8%硫化钠溶液脱毛, 然后用
温水清洗背部并拭干, 置于室温 25 e 、湿度 50% 的环境
中分笼饲养, 24h 后, 同样麻醉后,用 75%酒精消毒背部,
待酒精挥发后用电子控温控压电烫仪 90 e 烫 12s, 在实
验动物背部制成直径为 3cm 圆形深二度烧伤创面(经病
理切片证实)。制创后用乳酸钠林格输液 5ml腹腔注射
行复苏。
创面处理 生理盐水组创面清洗拭干后, 用生理盐
水 0. 2ml均匀滴布大鼠背部烧伤创面, 然后用 1% 磺胺
嘧啶银霜( SD - Ag )纱布覆盖一层, 再加盖无菌纱布包
扎;奇蒿提取物组, 将提取物溶于生理盐水, 浓度 10% ,
用药液 0. 2ml均匀滴布大鼠背部创面, 然后用 1% 磺胺
嘧啶银霜纱布覆盖一层,再加盖无菌纱布包扎,两组动物
均每日换药一次,换药至伤后 21 天。换药时先以0. 05%
醋酸洗必泰清洗创面, 尽可能清除创面坏死组织。烧伤
动物分别在伤后 5、10、15、21 天在无菌条件下进行创面
活检取材,每个时相点每组各取 8个创面,活检取材用于
OHP含量和细胞周期测定, 同时对创面愈合时间进行观
察比较。
创面 OHP 含量测定182 采用氯氨 T 氧化法, 将
25mg 组织块剪碎加入 2B1 氯仿甲醇混合液 2ml, 匀浆后
浸泡 2h, 用 4B1 乙醇水混合液、丙酮分别冲洗过滤, 将滤
纸上有形成分于 60e 烤箱过夜。得到脱水、脱脂样品,
精确称取样品 2. 5mg, 加 6mmol/ L 盐酸 1. 5ml, 110 e 条
件下密闭酸解 12h 以上,以甲基红为指示剂, 用 10mmo l/
L调节 PH 值至 7. 0, 过滤,精确计量液体总体积(方程中
第 22卷 第 5期
2 0 0 4 年 5 月
中 医 药 学 刊
CHINESE ARCHIVES OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE
Vol. 22 No. 5
May . 2 0 0 4
中医药
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学刊
DOI：10.13193/j.archtcm.2004.05.69.tanyf.039
用 Vml表示) , 取 1ml稀释到 2ml, 然后取稀释液 1ml加
入样品管( 10ml) , 在空白管及标准管中分别加入 1ml蒸
馏水、标准液 ( 10Lg /ml) , 各管依次加入柠檬酸缓冲液
1ml,氯胺 T 溶液 1ml, 于室温下培养 20min, 加入3. 15
mmol /L过氯酸 1ml, 常温下培养 5min,加入 10%对二甲
氨基苯甲醛 1ml, 混匀后在 60 e 水浴中培养 20min,冷却
后在 560nm 波长下比色,比色皿直径 1cm, 根据所得 OD
值带入以下方程计算被测组织羟脯氨酸的含量。OHP
含量( ug /mg 组织 ) = (样品管 OD 值 /标准管 OD 值 ) #
( 2Lg /ml) #10# ( Vml /2. 5mg)
创面细胞周期测定19~ 112 取部分创面全厚皮肤组
织,约 500mg, 将其剪碎, 用 4ml 胶原酶172 ( 200U /ml)
37e 恒温烘箱内消化 30min, 0. 1ml小牛血清终止消化。
尖吸管充分吹打, 200 目筛网过滤, 水平离心机 800rpm
离心 6min,去上清液去除消化液, 加适量 D - Hank. s 平
衡液清洗, 800rpm 离心 6min, 去上清液, 重复加 D -
Hank. s 液清洗,再以 400 目筛网过滤,同上法离心,去上
清液, 边吹打,边加入经预冷处理的 70%乙醇( 4 e ) , 4 e
条件下固定 2h, 固定结束后加适量 D - Hank. s 液清洗,
800rpm 离心 6min, 去上清液, 重复加 D - Hank. s 清洗,
离心, 去上清液,加入 2ml RNA 酶溶液( 10U /ml) , T riton
- 100( 1% ) 0. 1ml, 37 e 水浴孵育 30min 后, 同上离心, 去
上清,加入 3ml DNA 特异染色剂碘化丙啶( 50Lg /ml)避
光染色 2h, 染色后调节样品细胞数在 1. 0 @ 104~ 1. 0 @
105 个 /ml, 用流式细胞仪检测各期生长细胞所占比例。
创面愈合时间 由两名研究人员共同判断。创面完
全上皮化时, 计算创面愈合时间(天, x? s)。
统计学处理方法 由第二军医大学卫生统计教研室
进行成组资料的 t 检验处理和方差性齐性, 分析软件
SAS。
3 实验结果
烧伤创面观察及创面愈合时间 大鼠烧伤后背部创
面表皮坏死, 部分表皮剥脱, 创面边缘正常组织充血明
显, 创面深达真皮深层。创面皮肤组织苍白,呈无生机状
态, 其下部分真皮组织淡红,整个创面呈质地较韧的软皮
革样表现。伤后 3 天, 两组动物创周充血反应完全消退,
两组创面坏死组织干燥, 奇蒿提取物组创面已部分形成
痂样组织。伤后第 4 天, 奇蒿提取物组创面已基本结痂,
生理盐水组创面部分结痂。伤后第 5 天, 生理盐水组创
面基本结痂, 奇蒿提取物组创面干痂较生理盐水组创面
干痂更成熟, 奇蒿提取物组创面平均比生理盐水组约早
1 天结痂。结痂后, 换药时尽可能去除大鼠背部创面的
坏死组织及干痂, 促进药物和肉芽组织接触, 同时, 动作
尽量轻柔, 避免给大鼠背部烧伤创面造成额外的机械损
伤。伤后第 7 天, 奇蒿提取物组创面干痂开始从创缘剥
脱, 可以观察到创周上皮向内生长的表现,生理盐水组创
面干痂进一步成熟,收缩。伤后第 10 天, 生理盐水组干
痂开始从创缘剥脱, 而奇蒿提取物组溶痂继续进行,创周
上皮进一步向内生长, 坏死组织较易去除。至伤后 15 天
左右,生理盐水组创面溶痂明显, 奇蒿 80% 乙醇提取物
创面坏死组织和干痂大部分脱落, 创面干净有新生上皮
生长,在随后几天, 可见创面上皮生长迅速, 至伤后 17~
19 天基本修复覆盖创面, 而生理盐水组创面愈合多在伤
后 20 ~ 21 天。两组平均愈合天数: 奇蒿提取物组为
17. 88? 1. 24 天, 生理盐水组为 20. 13 ? 0. 83 天 ( P <
0. 01)。
烧伤创面 OHP含量的变化 从检测结果看,两组创
面 OHP含量均表现出/ 低 -高 -低0的变化,但其变化规
律不尽相同。伤后第 5 天时, 奇蒿提取物组和生理盐水
组创面 OHP含量较正常值均显著增高 ( P < 0. 01) , 经
测定正常值为 16. 34? 0. 74ug /mg ,奇蒿提取物组创面组
织OHP 含量高于生理盐水组 ( P < 0. 05) ; 伤后第 10
天,奇蒿提取物组创面 OHP 含量明显高于生理盐水组
( P < 0. 01) ,奇蒿提取物创面 OHP 含量在伤后第 10 天
达到峰值,随后逐渐下降; 伤后第 15天, 生理盐水组创面
OHP含量达到高峰, 而且高于该时相点奇蒿提取物组创
面 OHP含量( P < 0. 05) , 生理盐水组创面 OHP 含量在
达峰值后下降;伤后第 21 天, 两组创面 OHP 含量接近,
两组间无明显差异,但均仍高于正常值( P < 0. 05)。以
上结果提示两组创面均表现出成纤维细胞增殖, 胶原合
成增加,但奇蒿提取物组 OHP 含量升高快, 而且达到峰
值时间较早,说明奇蒿提取物组创面愈合较生理盐水组
快。见表 1。
表 1 创面 OHP含量的变化 ( x ? s, n= 8,Lg/mg组
织)
分 组 伤后天数
5 10 15 21
生理盐水组 19. 97 ? 0. 87 21. 54 ? 0. 50 22. 41 ? 0. 60* 18. 37 ? 0. 99
奇蒿提取物组 21. 35 ? 0. 71* 23. 50 ? 0. 79* * 21. 40 ? 0. 53 17. 39 ? 0. 98
注: * P < 0. 05, * * P < 0. 01。
创面组织细胞周期的变化 创面组织 S 期细胞百分
比:伤后第 5 天, 奇蒿提取取物组 S 期细胞百分比高于生
理盐水组( P < 0. 05) ;伤后第 10 天, 奇蒿提取物组细胞
S 期百分比达到峰值, 奇蒿提取物组 S 期细胞百分比明
显高于生理盐水组( P < 0. 01) ; 伤后第 15 天,生理盐水
组细胞 S 期百分比达到峰值, 高于该时相点奇蒿提取物
组的 S 期细胞百分比( P < 0. 05) ,但是其峰值低于奇蒿
提取物组的峰值;伤后第 21 天, 两组 S 期细胞百分比均
下降,与正常细胞的 S 期细胞百分比没有明显差异,经测
定正常细胞 S 期百分比为 8. 14 ? 1. 43, 但生理盐水组细
胞 S 期百分比仍高于奇蒿提取物组( P < 0. 05) , 见表 2。
表 2 烧伤创面组织 S期细胞百分比的变化( x ? s,
n= 8)
分组 伤后天数
5 10 15 21
生理盐水组 4. 38 ? 1. 90 15. 28 ? 0. 99 19. 15 ? 1. 40* * 8. 91 ? 0. 78*
奇蒿提取物组6. 85 ? 1. 62* 23. 97 ? 1. 09* * 12. 79 ? 1. 88 7. 42 ? 1. 16
注: * P < 0. 05, * * P < 0. 01。
4 讨 论
炎症反应、细胞增殖和细胞外基质重建是创面愈合
的基本过程,且创面愈合又需要符合细胞生长的微环境,
任何影响这些过程和环境的因素都可影响创面愈合。胶
第 5 期 潭蔚锋等: 奇蒿 80%乙醇提取物对大鼠深 Ò 度烧伤创面愈合的影响
中医药
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学刊
原的沉积和修复是创面愈合的主要表现, 胶原的主要成
份是 OHP, 其在胶原中所占的比例相当恒定, 测定 OHP
含量可反映胶原含量, 是创面愈合的主要指标1122。本实
验 OHP 检测结果表明, 应用奇蒿 80% 乙醇提取物后能
明显促进创面胶原合成, 伤后应用奇蒿提取物 5 天,实验
组 OHP含量即高于对照组,尤其以伤后第 10 天最为明
显, 实验组 OHP含量早于对照组达到峰值, 而且,其峰值
高于对照组的峰值。另外, 创面修复是皮肤细胞不断地
活化增殖的过程, 当细胞分裂增殖时, 细胞周期中的 G
期细胞不断进入了 S 期,使 S 期细胞比例增加, DNA 的
合成和含量就增加, 流式细胞计数仪检测 S 期细胞比例
是衡量烧伤创面细胞增殖强弱的有效指标1132。检测表
明, 奇蒿提取物组细胞 S 期百分比的峰值出现较生理盐
水组早,且峰值较生理盐水组高, 说明细胞增殖更为活
跃, 从而使细胞完全覆盖创面的时间缩短;创面观察发现
奇蒿提取物组结痂较生理盐水组早, 创面愈合天数较生
理盐水组短。
实验结果提示: 奇蒿 80%乙醇提取物对深 Ò 度烧伤
创面的愈合具有良好的促进作用, 并可能是通过促进胶
原合成和细胞增殖的途径实现了促进创面愈合的作用。
从药理学方面分析, 奇蒿具有活血化瘀、抗缺氧和抗氧化
的作用, 故能保护创面细胞,增强创面细胞对缺氧环境的
耐受能力, 改善创面血供, 从而改善创面的供需矛盾, 促
进胶原合成和细胞增殖。
现代分子生物学研究开发了多种促进创面愈合的药
物, 虽然疗效显著,但是该类药物往往会带来创面愈合质
量差或瘢痕增生的后果 , 所以, 从祖国中药中开发疗效
好、副作用低、价格适当的新型创面愈合促进剂是重要的
途径之一。奇蒿促进创面愈合的显著作用展示了其良好
的药用前景,但是, 奇蒿 80% 乙醇提取物是复杂的化学
混合物, 本实验未提示明显的极性特征,其促进伤口愈合
的深刻机制以及其活性成分或活性单体的筛选、分离和
提纯尚有待进一步研究探索。
参考文献
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The Effects of the Alcoholic Extract of
Artemisia anomala S. Moore on Wound Healing
Abstract: OBJECTIVE: The effects o f the 80% alcoholic ex tract of Ar temisia anomala S. Moore on wound healing of
deep second - degree burned rats. METHODS: Six ty - four round deep second degree burn wounds( 3. 0 cm in diameter) w ere
made by Temperature- P ressure Controlled Electric Burning Equipment on the back of six ty - four healthy adult SD rats
w hich were randomly divided into 2 g roups. The experimental group was treated with 0. 2ml of the 80% alcoholic extracts of
Ar temisia anomals S. Moore, and the control group was treated with 0. 2ml o f saline solution, once a bay until complete heal-
ing of the burned wound. The mean healing time w ere compared. The g rowth of epidermis tissue and collagen fibers were e-
valuated under light microscope. Furthermore, dynamic analysis of local tissue hydroxyproline( OHP) contents w as performed
and DNA cell cycle analysis of the wound w as examined by flow cy tometry . RESULTS: All rats survived, the healing time of
experimental group( 17. 88+ / - 1. 24 day s) was much shor te than that of control group ( 20. 13+ / - 0. 83 days) ( P < 0.
01) . Light micro scipe observation showed that the grow th of epidermis and collagen fibers of experimental g roup were much
better than that of control group. The OHP contents and the percent of S phase DNA cell cycle of wound tissue also showed
that the experimental group was obviously higher than the control g roup( P < 0. 01) . CONCLUSION : The 80% alcoholic
ex tr acts of Ar temisia anomala S. Moo re accelerated the healing of burn wounds significantly .
Key words: A rtemisia anomala S. Moore; wound healing; deep second - deg ree burn; hydro xyproline; DNA cell cycle
中 医 药 学 刊 2004 年第 22卷
中医药
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