全 文 ：［收稿日期］ 20110118(006)
［基金项目］ 国家自然科学基金项目(81160525)
［通讯作者］ * 彭克军，副教授，Tel:028-68289237，E-mail:pengkejungym@ 163． com
香青兰总黄酮对 TNF-α诱导的
大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响
曹文疆1，邢建国2，王新春1，金家贵3，彭克军3*
(1. 石河子大学医学院第一附属医院，新疆 石河子 832008;2. 新疆维吾尔自治区药物研究所，
乌鲁木齐 830004;3. 成都医学院检验医学院，成都 610083)
［摘要］ 目的:通过观察香青兰总黄酮对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导的大鼠主动脉血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的影
响，探讨其治疗动脉粥样硬化的可能药效机制。方法:采用体外贴块法培养大鼠主动脉 VSMC，SABC-Cy3 荧光免疫组化技术鉴
定其纯度;分别应用质量浓度为 0. 02 mg·L － 1 TNF-α，TNF-α +不同浓度香青兰总黄酮组(25，50，100 mg·L － 1)作用 24 h，并设对
照组进行比较。采用 MTT 法检测细胞的增殖;免疫组化法检测细胞内增殖细胞核抗原(PCNA)的表达水平。结果:与对照组
比较，TNF-α 组能显著刺激大鼠 VSMC 的增殖，香青兰总黄酮不同剂量组联合 TNF-α 可一定程度抑制 TNF-α 诱导的 VSMC 增
殖以及细胞内 PCNA 的表达，且呈现一定的剂量依赖关系趋势。结论:香青兰总黄酮通过抑制 TNF-α 对 VSMC 的增殖作用，可
能是其治疗动脉粥样硬化的药效机制之一。
［关键词］ 香青兰总黄酮;血管平滑肌细胞;肿瘤坏死因子-α;增殖
［中图分类号］ R285. 5 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2011)21-0159-03
［DOI］ CNKI:11-3495 /R． 20110809． 1706． 015 ［网络出版时间］ 2011-08-09 17:06
［网络出版地址］ http:/ / www． cnki． net / kcms / detail /11． 3495． R． 20110809． 1706． 015． html
Inhibitory Effects of Dracocephalum Total Flavoes on
Proliferation of Rat Vascular Smooth Muscle Cells Induced by TNF-α
CAO Wen-jiang 1，XING Jian-guo2，WANG Xin-chun1，JIN Jia-gui3，PENG Ke-jun3*
(1. The First Affiliated Hospital of Medical College，Shihezi University，Xinjiang 832008，China;
2. Xinjiang Institute of Meteria，Urumqi 830004，China;
3. Laboratory Medical School of Chengdu Medical College，Chengdu 610083，China)
［Abstract］ Objective:To explore the possible mechanism of pharmacological activity of tilianin by observing
the effects of Dracocephalum total flavoes on proliferation of rat vascular smooth muscle cells(VSMCs)induced by
TNF-α． Method:The rat VSMCs were cultured in vitro，and the purity of cells was identified by SABC-Cy3
immunofluroescence technique． Cell proliferation model was established by stimulation with 0. 02 mg·L － 1 TNF-α．
After TNF-α stimulation，cells were treated with three dose of Dracocephalum total flavoes(25，50，100 mg·L － 1) ;
MTT assay was used to evaluate the proliferation of cells． The expression of intracellular proliferating cell nuclear
antigen(PCNA)were measured by immunoenzymatic histochemistry． Result:Compared with control group，three
dose groups of Dracocephalum total flavoes could inhibit，in varying degrees，the proliferation and expression of
intracellular PCNA of VSMCs induced by TNF-α，in a dose-dependent manner． Conclusion:The Dracocephalum
total flavoes could inhibit the proliferation of VSMC induced by TNF-α，which might be one of pharmacological
mechanisms of Dracocephalum total flavoes in treatment for atherosclerosis．
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第 17 卷第 21 期
2011 年 11 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 17，No． 21
Nov．，2011
DOI:10.13422/j.cnki.syfjx.2011.21.050
［Key words］ Dracocephalum total flavoes;vascular smooth muscle cell;TNF-α;proliferation
香青兰 Dracocephalum moldovica L，为唇形科青
兰属植物，是维吾尔民族药之一，主要用于治疗冠心
病及高血压、心绞痛、动脉粥样硬化、心肌缺血等疾
病［1-2］。其主要化学成分有黄酮类、挥发油、萜类、氨
基酸、微量元素及多肽等［3］，其中黄酮类化合物具有
降血脂、抑制血小板聚集及保肝、抗炎等作用［4］。本
文通过研究香青兰总黄酮对 TNF-α 诱导的大鼠主动
脉血管平滑肌细胞增殖的影响，探讨其在临床治疗
动脉粥样硬化中的可能药效机制。
1 材料
1. 1 仪器与试药 倒置荧光显微镜(日本 Olympus
公司) ，CO2 培养箱(美国 Thermo 公司) ，酶标仪(美
国 BIO-RAD 公司) ，香青兰总黄酮(总黄酮含量为
57%，新疆加斯特药业，批号 20100708)。DMEM 高
糖培养基和胎牛血清(Gibco 公司) ，MTT(Sigma) ，
抗鼠 α-SMA 抗 体 (批 号 201008) ，鼠 抗 PCNA
(Proliferating Cell Nuclear Antigen，批号 201007) ，抗
体 SABC-Cy3(批号 201008) ，SABC 免疫组化试剂盒
(批号 201008) ，均购自武汉博士德生物工程有限公
司，重组大鼠 TNF-α(美国 PeproTech 公司)。
1. 2 动物 SPF 级健康雄性 Wistar 大鼠，体重
150 ～ 180 g，购自新疆医科大学实验动物中心，合格
证号新医动字第 2003-0001 号。
2 方法
2. 1 大鼠 VSMC 培养及纯度鉴定 取大鼠 1 只，脱
臼处死后在 75% 乙醇中浸泡 5 min，沿腹中线切开
皮肤，暴露胸腔和腹腔，取出胸主动脉，小心剥去外
膜，刮下内膜，贴块法植入 2% 明胶包被的培养瓶
中，加入含有 20% 胎牛血清及 1 万 U·L － 1青霉素、
100 mg·L － 1链霉素的 DMEM 高糖培养基，置于 5%
CO2，37 ℃培养箱中进行培养，3 d 换液 1 次，待细胞
生长接近融合时按 1 ∶ 3传代。倒置显微镜下观察细
胞形态，并制作细胞爬片，以抗鼠 α-SMA 抗体作为
一抗，采用 SABC-Cy3 荧光免疫组织化学法染色技
术对培养的 VSMC 进行纯度鉴定，荧光显微镜下红
色荧光代表 α-SMA 抗原阳性。
2. 2 实验细胞分组 细胞均按 2 × 105 /mL 的密度
接种于培养板中，待细胞约 80% 汇合时，换用无胎
牛血清的 DMEM 高糖培养基继续培养 12 h，随机分
为空白对照组(未加任何干预因素) ，TNF-α 刺激组
(20 μg·L － 1) ，TNF-α + 不同质量浓度香青兰总黄酮
组(25，50，100 mg·L － 1) ，继续培养 24 h 后进行以下
检测。
2. 3 细胞活力实验 采用台盼蓝染色细胞计数法，
结果发现本研究所用浓度的香青兰总黄酮对 VSMC
生长无任何毒性，细胞存活率达 95%以上。
2. 4 检测细胞的增殖 将各组细胞分别接种于 96
孔板中，每组 6 个复孔，每孔加入 200 μL，培养 24 h
后，弃去培养液上清，每孔加入含 5 g·L － 1的 MTT 溶液
10 μL，继续培养 4 h 后，弃去 MTT 上清，PBS 洗涤 3
次，每孔加入溶解液 DMSO 100 μL，振荡 5 ～ 10 min，
待结晶完全溶解，酶标仪检测 A490 nm。
2. 5 检测细胞中 PCNA 分子的表达水平 取各组
细胞爬片，用 4%多聚甲醛固定，0. 5% Triton-X 处理
细胞，3% H2O2 灭活内源性酶，正常血清封闭，以鼠
抗 PCNA 抗体作为一抗(阴性对照用正常鼠源血清
代替一抗) ，生物素化羊抗鼠 IgG 作为二抗，先后孵
育后再滴加 SABC 工作液，最后以 DAB 显色，苏木
素轻度复染，常规脱水、透明及封闭后于显微镜下观
察。PCNA 以细胞核被染成棕黄色为阳性，每张爬
片随机选取 6 个视野，通过计数 PCNA 阳性细胞数
占视野总细胞数的百分比，计算细胞中 PCNA 分子
的表达水平。
2. 6 统计学分析 采用 SPSS 10. 0 统计学软件处
理，所有实验数据均以 珋x ± s 表示，多组间比较用单
因素方差分析，两两比较用 q 检验，率的检验采用 χ2
检验，P ＜ 0. 05 为差异有显著性。
3 结果与分析
3. 1 VSMC 培养及纯度鉴定 倒置显微镜下观察，
培养细胞呈梭形，长至融合状态时呈现典型的“峰”
与“谷”特征。细胞爬片以抗 α-SMA 单克隆抗体作
免疫组化 SABC-Cy3 荧光染色后，可见 95% 以上的
细胞在荧光显微镜下呈红色荧光(见图 1)。
图 1 培养平滑肌细胞的纯度鉴定(× 200)
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第 17 卷第 21 期
2011 年 11 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 17，No． 21
Nov．，2011
3. 2 对 TNF-α 诱导 VSMC 增殖的影响 TNF-α 作
用 VSMC 后，与空白组比较显著刺激了 VSMC 的增
殖，而不同浓度的香青兰总黄酮对 TNF-α 诱导的
VSMC 增殖具有不同程度的抑制作用，且表现出一
定的剂量依赖关系趋势(见表 1)。
表 1 香青兰总黄酮对 TNF-α诱导大鼠 VSMC
增殖的影响(珋x ± s，n = 6)
组别
药物终质量浓度
/mg·L － 1
VSMC 增殖
/A
空白对照 － 0. 573 ± 0. 0492)
TNF-α 0. 02 0. 769 ± 0. 066
TNF-α +香青兰总黄酮3) 25 0. 670 ± 0. 0571)
50 0. 643 ± 0. 0602)
100 0. 630 ± 0. 0472)
注:与 TNF-α 组相比1)P ＜ 0. 05，2)P ＜ 0. 01;3)TNF-α 终质量浓
度 0. 02 mg·L － 1(表 2 同)。
3. 3 对 TNF-α 诱导 VSMC 中 PCNA 分子表达的影
响 免疫组化结果显示，空白对照组 VSMC 在没有
任何干预下，PCNA 阳性细胞所占比例较少，在 TNF-
α 刺激后 PCNA 阳性细胞比例显著增多，而不同浓
度的香青兰总黄酮均对 TNF-α 诱导的 PCNA 分子表
达具有不同程度的抑制作用，且表现出一定的剂量
依赖关系趋势(见表 2)。
表 2 香青兰总黄酮对 TNF-α诱导 VSMC 中
PCNA 分子表达的影响(珋x ± s，n = 6)
组别
药物终质量浓度
/mg·L － 1
PCNA 阳性率
/%
空白对照 － 31. 4 ± 3. 502)
TNF-α 0. 02 58. 3 ± 6. 44
TNF-α + 香青兰总黄酮3) 25 52. 0 ± 4. 57
50 48. 6 ± 3. 911)
100 40. 0 ± 3. 482)
4 讨论
动脉粥样硬化的炎症学说已成为阐述动脉粥样
硬化发病机制的一个重要学说，该学说认为动脉粥
样硬化是以慢性炎症过程为基础，炎性细胞因子、血
管内皮细胞、血管平滑肌细胞及免疫因素等环节共
同参与的综合发生发展过程［5］。其中，TNF-α 是一
种重要的前炎性细胞因子，出现在炎症早期，由多种
炎症细胞释放，具有多种生物学活性，如趋化、活化
中性粒细胞和单核细胞，促进 VSMC 的分裂、增殖和
迁移等［6］。
香青兰作为新疆传统治疗心血管疾病的天然药
物，但其药理作用机制仍不十分清楚。由于平滑肌
细胞的增殖是动脉粥样硬化形成和发展过程中的重
要环节，本研究采用体外培养的大鼠主动脉 VSMC
为模型，探讨香青兰对 TNF-α 诱导的 VSMC 增殖的
影响。
本实验结果显示，香青兰总黄酮可有效抑制
TNF-α 诱导的大鼠主动脉 VSMC 的增殖能力，表现
出一定的剂量依赖关系趋势。由于本研究使用的香
青兰总黄酮药物浓度范围内对细胞贴壁无影响，台
盼蓝染色显示细胞存活率达 95%以上，因此可以排
除其对 VSMC 增殖的抑制作用是由于药物自身毒性
的原因。
PCNA 作为一种核蛋白，其表达为细胞进入细
胞周期进行 DNA 复制和分裂增殖所必需，表达水平
与细胞增殖程度成正比，检测 PCNA 是评价细胞增殖
状态的可靠指标［7］。本研究发现，VSMC 在 TNF-α 的
刺激下，其细胞核中 PCNA 的表达水平明显增强，但
香青兰总黄酮在一定剂量下可显著抑制 TNF-α 的这
种刺激作用，进一步说明香青兰总黄酮可抑制
TNF-α诱导的 VSMC 增殖效应。因此本研究充分表
明，香青兰总黄酮通过抑制 TNF-α 对 VSMC 的增殖
作用，可能是其治疗动脉粥样硬化的药效机制之一。
［参考文献］
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准［S］．维吾尔药分册，乌鲁术齐:新疆科技卫生出版
社，1999:181．
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大学学报，2009，32(5) :568．
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［7］ Naryzhny S N． Proliferating cell nuclear antigen:a
proteomics view ［J］． Cell Mol Life Sci，2008，65
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［责任编辑 聂淑琴］
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曹文疆，等:香青兰总黄酮对 TNF-α 诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响