全 文 ：　　收稿日期:2006-06-19
　　基金项目:浙江省科技厅科技攻关资助项目(2004C32047)
　　作者简介:陈婉君(1978-),女 ,硕士。
　　＊通讯作者 , E-mail:songhua@zju.edu.cn
木鳖子提取物对 Asia Ⅰ-O 型口蹄疫双价灭活苗的免疫佐剂作用
陈婉君1 ,刘迪文2 ,胡松华1＊　(1.浙江大学 动物科学学院 , 浙江 杭州 310029;2.浙江大学 医学院 , 浙江 杭州
310031)
摘要:分别将 2 500 、500、100、20 μg的木鳖子提取物(ECMS)或 100 μg 皂树皂甙(QA)和 Asia Ⅰ-O型口蹄疫(FMD)双
价灭活苗混合免疫豚鼠 ,以不另加佐剂的疫苗为对照组 , 于二免后 3 、6 、10 、14 周采血并分离血清 , 观测血清中抗 O
型FMDV的抗体滴度 、抗 O 型FMDV VP1结构蛋白抗体水平和抗 Asia Ⅰ型 FMDV的抗体水平。结果显示 ,当 ECMS
剂量等于或少于 500μg 时 , ECMS 和 FMD双价灭活苗混合免疫豚鼠 ,未见不良反应;疫苗中加入 ECMS 和 QA 后 , 则
诱导更高的抗O 型 FMDV抗体滴度 、抗 O 型 FMDV VP1 结构蛋白抗体和抗 Asia Ⅰ型 FMDV 抗体水平 , 尤其 ECMS
100 μg组和 QA 100μg 组(P<0.01)或(P<0.05);且 ECMS 100μg 组抗体水平高于 QA 100 μg组。本研究结果提示
ECMS 可作为FMD灭活疫苗的候选佐剂。
关键词:木鳖子提取物(ECMS);免疫佐剂;口蹄疫灭活苗;豚鼠
中图分类号:S852.65　　　文献标识码:A　　　文章编号:1005-4545(2008)01-0051-04
Adjuvant effect of extract of Cochinchina momordica seed on foot-and-mouth dis-
ease vaccination against Asia-Ⅰ and O type strain in guinea pigs
CHEN Wan-jun1 ,LIU Di-wen2 ,HU Song-hua1＊　(1.College of Animal Sciences , Zhejiang University , Hangzhou
310029 , China;2.College of Medicine , Zhejiang University , Hangzhou 310031 , China)
　　Abstract:An extract of Cochinchina momordica seed(ECMS)was evaluated for its adjuvant effects on inactivated foot-and-
mouth disease(FMD)vaccine in guinea pigs.Thirty five guinea pigs were randomly divided into 7 groups of 5 animals each and
immunized intramuscularly on day 1 and 21 , with a commercial FMD vaccine(control)or mixed with ECMS(2 500 , 500 , 100 , 20
μg)or QA(100 μg)or without any treatment.Blood samples were collected 3 , 6 , 10 and 14 weeks after the booster immunization
for the analysis of specific antibody responses.Results revealed that addition of ECMS or QA enhanced immune responses to VP1 ,
Asia Ⅰ and O strains in the host.While highest antibody level was found in guinea pigs injected by vaccine mixed with 100 μg
ECMS(P<0.05 or P <0.01)as compared with control.FMD vaccine mixed with 100 μg of ECMS induced somewhat higher anti-
body response than that mixed with QA but no statistically significant difference.No side-effects were found when the dose of ECMS
was or less than 500μg.It is concluded that ECMS may be used as a candidate adjuvant for FMD inactivated vaccine.
　　Key words:ECMS;adjuvant;FMD inactivated vaccine;guinea pigs
＊Corresponding author , E-mail:songhua@zju.edu.cn
　　口蹄疫(Foot-and-mouth disease , FMD)是偶蹄动
物烈性接触性传染病 ,主要危害牛 、羊 、猪等家畜 。
FMDV属于小 RNA 病毒科 ,口蹄疫病毒属 , 含有 4
种结构蛋白 ,分别为 VP1 、VP2 、VP3 、VP4。该病毒有
7个血清型和众多亚型 ,各血清型之间无交叉保护
反应[ 1] 。在亚洲主要流行 A 、O 、C 、Asia Ⅰ4 个血清
型 ,致病性各不相同 。FMD 传播途径多 、传播速度
快 ,曾多次在世界发生大流行 ,从而造成巨大的经济
损失 。使用 FMD 灭活疫苗仍是我国预防与控制
FMD暴发的主要手段 ,但就目前的使用情况来看 ,
FMD灭活苗免疫效果并不十分理想[ 2-3] 。
木鳖子始载于宋《开宝本草》(公元973年),能消肿
散结 、祛毒 、治痈肿 、疗疮等。木鳖子的化学成分主要
包括脂肪酸类 、皂甙 、活性蛋白类 、α-菠菜甾醇 、齐墩果
酸和木鳖子酸等成分。最近的研究发现木鳖子的一种
水提取物具有抗肿瘤[4-6]及抗氧化活性[7] 。Iwamoto
等[ 8]从木鳖子中分离出 2种皂甙 ,momordica saponin Ⅰ
和Ⅱ,并确认 Ⅰ为丝石竹皂甙 , Ⅱ为一种含皂皮酸的皂
甙。丝石竹皂甙为含双糖链的三萜皂甙。一些具有类
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DOI :10.16303/j.cnki.1005-4545.2008.01.016
似化学结构的皂甙已被证明具有免疫佐剂作用 ,和疫
苗同时使用可以提高疫苗的免疫效果[ 9-10] 。我们的前
期研究证明 ,木鳖子提取物(ECMS)具有免疫佐剂作用。
本研究以豚鼠为实验动物 ,探讨利用ECMS来增强口蹄
疫灭活苗的免疫效果的方法。
1　材料与方法
1.1　实验动物　普通级 DHP花豚鼠 35只 ,浙江大
学实验动物中心提供 。
1.2　疫苗和佐剂　AsiaⅠ-O型口蹄疫双价灭活苗 ,内
蒙古生物药品厂生产。ECMS由本实验室分离提取并
保存;皂树皂甙(QA),丹麦 NOR-VET 公司产品 。
1.3　主要试剂　山羊抗豚鼠 IgG 、IgG1 、IgG2抗体 ,
HRP标记的兔抗山羊 IgG-Fc 抗体 ,美国 BETHYL 公
司产品;FMDV VP1 结构蛋白抗体酶联免疫吸附试
验诊断试剂盒(200510002),上海优耐特生物医药有
限公司产品;FMD O型正向血凝抗原(051109),亚洲
Ⅰ型 FMD抗体检测 ELISA试剂盒 ,中国农业科学院
兰州兽医研究所产品 。
1.4　免疫接种　将 35只豚鼠随机分成 7组 ,每组 5
只 ,除第 7组不免疫外 ,其他各组肌肉注射疫苗 0.5
mL/只 ,注射2次 ,间隔 3周 ,佐剂剂量见表 1。
表 1　动物分组及处理方式
组别 豚鼠/只 佐剂类型和剂量
1 5 2 500μg(ECMS)
2 5 500μg(ECMS)
3 5 100μg(ECMS)
4 5 20μg(ECMS)
5 5 100μg(QA)
6 5 无
7 5 不免疫
1.5　临床观察　每次注射后观察全身变化和注射
部位局部反应。
1.6　采样和样品处理 　分别于二免后 3 、6 、10 、14
周心脏采血 ,血样静置于 4℃冰箱过夜 , 600×g ,离
心20 min ,吸取血清分装于 0.5 mL 塑料离心管 ,
-20℃保存。
1.7　间接血凝法检测血清中抗 O型 FMDV抗体　
按产品说明书操作 。被检血清在检测前须经 56℃
水浴灭活 30 min。
1.8　间接 ELISA法检测血清中抗 O型 FMDV VP1
结构蛋白抗体及亚类　按产品说明书操作 ,稍作修
改。使用前将试剂盒恢复至室温。简述如下:取出
抗原包被板。每孔加入稀释后的待检血清和对照血
清100 μL ,封板 ,置 37℃下孵育 60 min ,用洗涤液洗
涤5 次 , 每孔 300 μL , 拍干。每孔加入 100 μL 经
1∶1 000稀释的山羊抗豚鼠 IgG 、IgG1 、IgG2抗体 ,封
板 ,置 37℃下孵育 30 min ,用洗涤液洗涤 5次 ,每孔
300μL ,拍干。每孔加入 100 μL 经 1∶5 000稀释的
HRP 标记的兔抗山羊 IgG-Fc 抗体 ,封板 ,置 37℃下
孵育 30 min ,用洗涤液洗涤 5次 ,每孔 300 μL ,拍干。
每孔加入 100μL TMB底物工作液 ,封板 ,置 37℃下
孵育 15 min ,每孔加入 100μL 1 mol/L H2SO4终止反
应 ,并轻轻振荡混匀。在 15 min内 ,用酶标仪测定
D450值 。
1.9　间接双抗夹心 ELISA法检测血清中抗 Asia Ⅰ
型 FMDV抗体　使用前将试剂盒恢复至室温。参
照文献[ 11]进行 。在 ELISA板上每孔加入 50 μL 经
1∶800稀释的Asia Ⅰ 型FMDV兔抗血清 ,振荡均匀 ,
封板 ,室温过夜 。用洗涤液洗涤 5次 ,每孔 300 μL ,
拍干 。每孔加入 300 μL 封闭液 ,室温孵育 2 h。用
洗涤液洗涤 5 次 ,每孔 300 μL ,拍干。每孔加入 50
μL 经1∶10稀释的Asia Ⅰ 型FMDV抗原 ,振荡混匀 ,
封板 ,4℃孵育 2 h。用洗涤液洗涤 5 次 ,每孔 300
μL ,拍干。每孔加入 50 μL 稀释后的待测血清 ,封
板 ,37℃孵育 1 h。用洗涤液洗涤 5次 ,每孔 300μL ,
拍干。每孔加入 50μL经 1∶500稀释的 HRP 标记的
兔抗豚鼠抗体 ,封板 , 37℃孵育 1 h 。用洗涤液洗涤
5次 ,每孔 300 μL ,拍干 。每孔加入 50 μL OPD底物
工作液 ,37℃孵育 15 min。每孔再加入 50 μL 1.25
mol/L H2SO4终止反应 ,并轻轻振荡混匀。在 15 min
内 ,用酶标仪测定 D 492值。
1.10　间接双抗夹心 ELISA法检测血清中抗 Asia
Ⅰ型 FMDV抗体亚类　使用前将试剂盒恢复至室
温。参照文献[ 11]进行 。在 ELISA板上每孔加入 50
μL经 1∶800稀释的 AsiaⅠ型FMDV兔抗血清 ,振荡均
匀 ,封板 ,室温过夜。用洗涤液洗涤 5次 ,每孔 300
μL ,拍干。每孔加入300μL封闭液 ,室温孵育2 h。用
洗涤液洗涤5次 ,每孔 300μL ,拍干 。每孔加入 50 μL
经1∶10稀释的Asia Ⅰ型FMDV抗原 ,振荡混匀 ,封板 ,
4℃孵育 2 h。用洗涤液洗涤 5次 ,每孔 300 μL ,拍干。
每孔加入50μL稀释后的待测血清 ,封板 ,37℃孵育 1
h。用洗涤液洗涤 5次 ,每孔 300μL ,拍干。每孔加入
50μL经 1∶1 000稀释的山羊抗豚鼠 IgG1或 IgG2 ,封
板 ,37℃孵育1 h。用洗涤液洗涤5次 ,每孔300μL ,拍
干。每孔加入50μL经 1∶60 000稀释的HRP 标记的
兔抗山羊 IgG-Fc抗体 ,加盖 ,37℃孵育 1 h。用洗涤液
洗涤 5次 ,每孔 300μL ,拍干 。每孔加入 50μL OPD底
物工作液 ,37℃孵育 15 min。每孔再加入 50 μL 1.25
mol/L H2SO4 终止反应 ,并轻轻振荡混匀。在 15 min
内 ,用酶标仪测定 D492值 。
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1.11　数据处理　用 Microsoft Excel 处理 ,数据用
x ±s表示 ,用 t 检验法检测组间的统计学差异 。
2　结果
2.1　动物的局部和全身变化　1 ～ 4组用含 ECMS
的疫苗注射后 ,除 1组出现轻微的怕冷症状 , 2 ～ 3
组均无明显的全身反应 。注射部位无肿胀 、硬结等
异常变化 。表明 ECMS 安全性良好。
2.2　二免后血清中抗 O型 FMDV抗体滴度　见图
1。二免后 3 周血清中抗体滴度最高 ,此后 ,除第 5
组在第 6周时略有上升 ,其他组均有不同程度的下
降。疫苗中加入 ECMS(1 ～ 4 组)和 QA(第 5组)比
不另加佐剂的对照组(第 6组)可以诱导出更高的抗
体滴度。其中第 3 、5组和对照组比较有显著性或极
显著性差异(P<0.05或 P <0.01),并持续至第 14
周。二免后 3周第 3组的抗体滴度要高于第 5组 ,
但差异不显著(P >0.05)。
图 1　二免后各组豚鼠血清抗 O型 FMD抗体滴度
2.3　二免后血清中抗 O型 FMDV VP1抗体水平　
见图 2。疫苗中加入 ECMS(1 ～ 4组)和QA(第 5组)
比不加佐剂的对照组可以诱导出更高的抗体水平 。
1 ～ 3组和第5组的豚鼠血清中抗O型FMDVVP1水
平显著或极显著高于对照组(P <0.05 或 P <0.
01)。其中 2 、3组的抗体水平要高于第 5组 ,但差异
不显著(P>0.05)。
图 2　二免后各组豚鼠血清抗 VP1抗体水平
2.4　二免后血清中抗 Asia Ⅰ型 FMDV抗体　见图
3。疫苗中加入 ECMS(1 、3 、4组)和 QA 组(第 5组)
比不加佐剂的对照组可以诱导出更高的抗体水平。
其中第 3 、5组的豚鼠血清中抗Asia Ⅰ型 FMDV抗体
水平显著高于对照组(P <0.05)。
图 3　二免后血清中抗 Asia Ⅰ型 FMDV抗体水平
2.5　二免后血清中抗 Asia Ⅰ型 FMDV抗体亚类　
见图4 。疫苗中加入 ECMS(1 、3 、4组)和 QA组(第 5
组)比不加佐剂的对照组可以诱导出更高的 IgG1和
IgG2水平 。其中 3 、4 、5组的豚鼠血清中抗 Asia Ⅰ
型 FMDV IgG1 水平显著高于对照组(P <0.05),并
且第 3 、5 组 IgG2 水平显著或极显著高于对照组
(P<0.05或 P<0.01)。
图 4　二免后血清中抗 Asia Ⅰ型 FMDV抗体亚类水平
3　讨论
本研究发现 ,当 Asia Ⅰ-O 型 FMD双价灭活苗
和 ECMS混合注射豚鼠后 ,可以显著诱导血清中特
异性抗体水平。其中第 3 、5组诱导血清中抗O 型 、
Asia Ⅰ型 FMD抗体和对照组比较均有显著性差异
(P<0.05或 P <0.01);且第 3组抗体水平要高于
第 5组。QA是一种从南美奎拉雅属皂树皮提取物。
许多研究证明它可增强机体细胞免疫和体液免疫水
平 ,具有免疫佐剂活性[ 12] 。本研究证明 ,相同剂量
的 ECMS比 QA具有更强的佐剂活性 。
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不同剂量的 ECMS对 FMD疫苗的佐剂活性呈现
一种依赖关系 。在本试验中 , 100 μg 的 ECMS 对 O
型 、Asia Ⅰ型 FMDV 抗原均呈现较好的佐剂效果。
ECMS 2 500μg 组较100μg组呈现一种下降趋势 。这
可能是由于 ECMS 本身是一种粗提物 ,成分较复杂 ,
剂量越大所含的毒性成分可能也随着增加 ,从而对机
体免疫系统造成一定的副作用 ,本试验中 2 500μg 剂
量组的豚鼠就出现了全身不良反应。因此 ,将 ECMS
用于不同动物时 ,首先应作剂量筛选 ,以便其发挥最
好的佐剂效果 ,并避免毒副作用的出现 。
FMDV VP1区具有高度抗原性的蛋白片段 ,是诱导
产生中和抗体的主要成分[13] ,不同血清型之间该片段
的同源性不超过60%[14] 。利用局部有效抗原位点作为
诊断抗原 ,具有特异性 、敏感性和安全性高等优点[15] 。
本试验中 ,疫苗中混入2 500 、500 、100μg ECMS组比单
一的油佐剂组诱导血清中抗 O型 FMDV VP1 IgG1和
IgG2均有显著性提高;同时 100 μg ECMS 组血清中抗
AsiaⅠ型FMDV的 IgG1和 IgG2也均有显著性提高。可
能ECMS和油佐剂混合后 ,能协同发挥佐剂效应 ,共同
刺激免疫系统和促进抗原提呈细胞的作用。
佐剂免疫后抗体亚类合成方向可以间接说明刺
激Th1或 Th2反应的倾向。Th1-Th2和主要的 IgG
亚类的关系:IgG1 抗体与 Th2型反应有关 , IgG2 抗
体与 Th1型反应有关[ 16] 。本试验中 , ECMS 能同时
诱导豚鼠血清产生较高的抗O型 、Asia Ⅰ型 IgG1和
IgG2抗体水平。在实际生产应用上 ,激活体液免疫
和细胞免疫反应对于预防偶蹄动物感染 FMDV有同
样重要的意义。因此 ECMS 作为佐剂能够诱导一个
平衡的Th1/Th2反应 ,应作进一步的研究 ,以发挥其
在FMD免疫中的免疫增强作用 。
参考文献:
[ 1] 　Domingo E , Escarmis C ,Martinez M A , et al.Foot-and-mouth
disease virus populations are quasispecies[ J] .Curr Top Mi-
crobiol Immunol , 1992 , 176:33-47.
[ 2] 　郝大丽 ,罗　荣 , 徐宜芳 ,等.猪口蹄疫免疫抗体效价的
测定及结果分析[ J] .畜牧兽医杂志 , 2005 , 24(2):42.
[ 3] 　薛志成.奶牛接种 O 型口蹄疫疫苗的免疫效果检测初
报[ J] .当代畜牧 , 2005(4):17.
[ 4] 　Tien P G , Kayama F , Konishi F , et al.Inhibition of tumor
growth and angiogenesis by water extract of Gac fruit(Mo-
mordica cochichinensis Spreng)[ J] .Int J Oncol , 2005 , 26:
881-889.
[ 5] 　Tsoi A Y ,Wong R C , Ng T B , et al.First report on a potato I
family chymotrypsin inhibitor from the seeds of a Cucurbita-
ceous plant , Momordica cochinchinensis [ J] .Biol Chem ,
2004 , 2:185-189.
[ 6] 　Wong R C , Fong W P , Ng T B.Multiple trypsin inhibitors
from Momordica cochinchinensis seeds[ J] .Chin drug Mubiezi
Peptides , 2004 , 25:163-169.
[ 7] 　Tsoi A Y , Ng T B , Fong W P.Antioxidative effect of a chy-
motrypsin inhibitor from Momordica cochinchinensis(Cucur-
bitaceae) seeds in a primary rat hepatocyte culture[ J] .J
Peptide Sci , 2005 , 11:665-668.
[ 8] 　Iwamoto M , Okabe H , Yamauchi T , et al.Studies on the con-
stituents of Momordica cochinchinensis Spreng Ⅱ.Isolation
and characterization of the root saponins ,Momordins Ⅰ , Ⅱ
and Ⅲ[ J] .Chem Pharm Bull , 1985 , 33:1-7.
[ 9] 　Rivera E ,Hu S , Concha C.Ginseng and aluminium hydroxide
act synergistically as vaccine adjuvants[ J] .Vaccine , 2003 ,
21:1149-1157.
[ 10] 　Hu S , Concha C , Lin F , et al.Adjuvant effect of ginseng ex-
tracts on the immune responses to immunization against
Staphylococcus aureus in dairy cattle[ J] .Vet Immunol Im-
munopathol , 2003 , 91:29-37.
[ 11] 　McCullough K C , Crowther J R , Butcher R N.Alteration in
antibody reactivity with foot-and-mouth disease virus 146 s
antigen before and after binding to a solid phase or complex-
ing with specific antibody[ J] .Immunol Meth , 1985:82-91.
[ 12] 　林锋强 , 胡松华 ,胡奇林 ,等.皂甙 QuiA及其单体成分
的免疫佐剂作用[ J] .动物医学进展 , 2004 , 25(4):43-
45.
[ 13] 　Kitson J D ,McCahon D , Belsham G J.Sequence analy sis of
monoclonal antibody resistant mutants of type O foot and
mouth disease virus;evidence for the involvement of the
three surface exposed capsid proteins in four antigen sites
[ J] .Virology , 1990 , 179(1):26-34.
[ 14] 　Ratish G , Viswanathan S , Suryananrayana V V.Cterminal re-
gion of VP1 of selected foot-mouth disease virus serotypes:
expression in E.coli and affinity purification[ J] .Acta Vi-
rol , 1999 , 43:205-211.
[ 15] 　孙　琳 , 张培因 , 庄乾宇 , 等.口蹄疫病毒特异性抗体
间接 ELISA 检测方法的建立 [ J] .中国兽医学报 ,
2006 , 26(1):9-10.
[ 16] 　Finkelman F D ,Holmes J , Katona I M.Lymphokine control
of in vivo immunoglobiun isotype selection[ J] .Annu Rev
Immunol , 1990 , 8:303-333.
54 中 国 兽 医 学 报　2008年 1 月　第 28卷　第 1 期　Chin J Vet Sci　Jan.2008　Vol.28　No.1