全 文 ：禽流感血凝素犎犃超表达载体的构建及
高表达百脉根的获得
张伟伟１，２，袁蓓２，张占路３，赵杨敏３，徐秉良１，吴燕民２
（１．甘肃农业大学草业学院，甘肃 兰州７３００７０；２．中国农业科学院生物技术研究所，
北京１０００８１；３．深圳市农科集团有限公司，广东 深圳５１８０４０）
摘要：为提高外源抗原蛋白的表达水平，根据已得到的 ＨＡＬＴＢ融合基因，通过添加双增强子ＣａＭＶ３５Ｓ启动子、
增强子Ω序列、内质网滞留信号ＫＤＥＬ序列及加长ｐｏｌｙ（Ａ）序列等表达调控元件，构建 ＨＡＬＴＢ高效融合植物表
达载体。利用农杆菌介导方法转化百脉根，获得转基因阳性植株２１株，经ＰＣＲ和ＲＴＰＣＲ检测表明 ＨＡＬＴＢ融
合基因已整合到百脉根基因组中。利用ＥＬＩＳＡ检测转基因植株，结果表明ＬＴＢ免疫佐剂与 ＨＡ抗原蛋白均具有
免疫原性，ＬＴＢ最高表达量达到０．０８６μｇ／ｍｇ（蛋白粗提液），ＨＡ最高表达量达到０．２５μｇ／ｍｇ（蛋白粗提液）。通
过植物表达载体的设计和构建，使禽流感血凝素在百脉根中的表达量得到了显著提高，为禽流感可饲疫苗的研制
奠定了基础。
关键词：百脉根；载体构建；ＨＡ抗原蛋白；ＬＴＢ免疫佐剂；高表达
中图分类号：Ｓ８５１．３　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００４５７５９（２０１４）０４０１３８０８
犇犗犐：１０．１１６８６／ｃｙｘｂ２０１４０４１７　　
　　自２００３年到２０１３年，高致病性禽流感 Ｈ５Ｎ１共引起人患病６３０例，致死３７５人，大规模捕杀家禽及候鸟数
量更是数以亿计，给世界各地造成严重的经济损失和巨大的生命安全威胁。早在１９９２年，Ｍａｓｏｎ等［１］提出了
“植物可食疫苗”的概念，成功利用烟草（犖犻犮狅狋犻犪狀犪狋犪犫犪犮狌犿）表达了乙肝表面抗原（ＨＢｓＡｇ）基因。近十年已有大
量的抗原被植物表达，包括抵御ＨＩＶ的２Ｇ１２抗体［２］、乙肝表面抗原［３５］、霍乱毒素Ｂ亚基［６］、大肠杆菌热敏毒素
Ｂ亚基［７８］、狂犬病毒Ｇ蛋白［９］等，但是目前禽流感植物疫苗的报道还是较少且抗原蛋白表达量低限制了植物疫
苗进一步的发展［１０］。
大量研究表明，影响重组药用蛋白在植物中表达量的因素包括很多方面。一是转录水平，启动子的选择是提
高外源基因表达水平的关键。常用的启动子分为组成型启动子、组织特异性启动子、诱导型启动子和人工合成启
动子。前３种启动子都可以实现外源基因的表达与调控，但人工合成启动子能够进一步提高外源基因的表达水
平。如重复ＣａＭＶ３５启动子的增强子序列，构建双３５Ｓ启动子，可显著提高外源基因的表达水平［１１１２］。终止子
通过终止转录和对ｍＲＮＡ３′端的加工调节转录水平，进而影响外源基因在植物中的表达水平。Ｎａｇａｙａ等［１３］分
别比较了不同终止子，发现热击蛋白１８．２终止子能有效提高外源基因表达水平。二是翻译水平，研究表明通过
增强ｍＲＮＡ的稳定性［１４１５］，按照植物偏爱密码子进行密码子优化可有效提高重组蛋白的表达水平［１６］。三是翻
译后水平，重组蛋白合成后，利用不同定位信号可以定位于不同的亚细胞结构中，亚细胞结构的生理生化环境、存
储空间等多种因素都影响着蛋白的积累水平。为外源蛋白选择合适的分拣部位，有助于其高浓度富集。例如在
重组蛋白Ｃ添加内质网滞留信号序列ＫＤＥＬ，可以增加外源蛋白在内质网中的积累水平［１７］。郑琳琳等［１８］证明
可通过构建超表达载体有效提高外源基因的表达水平。
本研究选择豆科全价饲料牧草百脉根（犔狅狋狌狊犮狅狉狀犻犮狌犾犪狋狌狊）［１９］作为受体植物，在已建立的，以磷酸甘露糖异
构酶基因（ＰＭＩ）为筛选标记的，安全高效的百脉根遗传转化体系的基础上，利用已获得的禽流感血凝素（ＨＡ）和
１３８－１４５
２０１４年８月
　　　草　业　学　报　　　
　　　ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ　　　
第２３卷　第４期
Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．４
收稿日期：２０１４０１１５；改回日期：２０１４０２２５
基金项目：国家重点基础研究发展计划“９７３”项目（２０１４ＣＢ１３８７０１）和国家自然科学基金资助项目（３１３７２３６１）资助。
作者简介：张伟伟（１９８８），女，山东潍坊人，在读硕士。Ｅｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｗｅｉｗｅｉ１００２１３２＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：Ｗｕｙｍ６５＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ，ｘｕｂｌ＠ｇｓａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
大肠杆菌不耐热毒素Ｂ亚基（ＬＴＢ）融合基因，通过添加强启动子，增强子Ω序列、ＫＤＥＬ序列及加长ｐｏｌｙ（Ａ）序
列等多种调控元件，构建ＨＡＬＴＢ高效融合植物表达载体，以期提高ＨＡ抗原蛋白表达量，建立外源融合抗原蛋
白高水平表达平台，为禽流感可饲疫苗的研制奠定基础。
１　材料与方法
１．１　材料
１．１．１　植物材料　百脉根：栽培品种里奥（犔．犮狅狉狀犻犮狌犾犪狋狌狊ｃｖ．Ｌｅｏ）由中国农业科学院生物技术研究所作物与
分子实验室提供。
１．１．２　菌种及载体　大肠杆菌ＤＨ５α、根癌农杆菌ＬＢＡ４４０４由本实验室保存，ｐＣＡＭＢＩＡ２３０１、ｐＭＤ１９Ｔ商业
载体购于Ｔａｋａｒａ生物公司，ｐＭＤ２Ｅ＋３５Ｓ、ｐＭＤΩ由本实验室保存，ｐＭＤＮｏｓｐｏｌｙ（Ａ）由本实验室设计经金为
智生物公司合成，ｐＣＡＭＢＩＡ２３０１ＰＭＩＨＡＬＴＢＭＡＲｓ植物融合表达载体由本实验室保存。
１．１．３　工具酶和主要生物学试剂　犈犮狅犚Ⅰ、犎犻狀ｄⅢ、犕犾狌Ⅰ等限制性内切酶、Ｔ４ＤＮＡ连接酶、ＥｘＴａｑＰｏｌｙ
ｍｅｒａｓｅ、ＬＡＴａｑＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ购自Ｔａｋａｒａ生物公司；ＤＮＡＭａｒｋｅｒ购自北京全式金生物技术有限公司（ＴｒａｎｓＧｅｎ
Ｂｉｏｔｅｃｈ）；高纯质粒小量制备试剂盒、通用植物总ＲＮＡ提取试剂盒购自百泰克生物公司（Ｂｉｏｔｅｋｅ）；反转录试剂
盒购于Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；Ｇｅｌ／ＰＣＲＥｘｔｒａｃｔｉｏｎｋｉｔ购自Ｂｉｏｍｉｇａ生物公司；大肠杆菌热敏毒素Ｂ亚基酶联免疫分
析试剂盒购自Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍ。
１．１．４　培养基　Ｂ５培养基（ｐｈｙｔｏｔｅｃｈＢ５ｍｅｄｉａ）、ＭＳ培养基（ＭｕｒａｓｈｉｇｅＳｋｏｏｇｍｅｄｉｕｍ）购自美国Ｐｈｙｔｏ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ生物技术公司，ＹＥＢ培养基（ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｈｉｚｏｇｅｎｅｍｅｄｉｕｍ）、ＬＢ培养基（ＬｕｒｉａＢｅｒｔａｎｉｂａｃｔｅｒｉａｌ
ｍｅｄｉｕｍ）、植物凝胶（ｐｈｙｔａｇｅｌ）、甘露糖购自北京拜尔迪生物公司（Ｂｉｏｄｅｅ），１ｍｇ／ｍＬ的ＢＳＡ标准品（ＢｏｖｉｎｅＳｅ
ｒｕｍＡｌｂｕｍｉｎＳｔａｎｄａｒｄＡｍｐｕｌｅｓ）购自ＧｅｎｅＳｔａｒ公司，其他试剂均为国产分析纯。
１．１．５　引物与测序　利用Ｐｒｉｍｅｒ５．０引物设计软件，根据相关基因序列及需要添加酶切位点序列、基因片段序
列设计、载体构建过程中所有测序工作，由北京奥科生物技术有限公司完成，引物序列见表１。
表１　目的基因的引物序列
犜犪犫犾犲１　犘狉犻犿犲狉狊犲狇狌犲狀犮犲狅犳狋犪狉犵犲狋犵犲狀犲狊
目的基因Ｔａｒｇｅｔｇｅｎｅｓ 引物序列Ｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅ
ＭＨＡ－犅犪犿ＨⅠ ５′ＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＡＧＡＧＧＡＴＴＧＴＧＣＴＴＣＴＣＴＴＧ３′
ＭＬＴＢＫＤＥＬ犛犪犾Ⅰ／犘狊狋Ⅰ ５′ＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＴＡＧＡＧＣＴＣＡＴＣＣＴＴＧＴＴＣＴＣＣＡＴＡＧＡＧＡＴＡＧＣＡＧＣＧ３′
２Ｅ＋３５Ｓ ５′ＴＣＡＴＡＣＡＧＡＧＣＴＣＡＡＴＧＡＣＡＡＧＡＡＧＡＡＡＡＴ３′
５′ＧＧＴＧＡＴＴＴＣＡＧＣＧＴＧＴＣＣＴＣＴＣＣＡＡ３′
Ω ５′ＴＣＣＣＡＣＴＡＴＣＣＴＴＣＧＣＡＡＧＡＣＣＣ３′
５′ＡＴＣＡＧＡＣＴＴＣＡＣＡＡＧＴＧＡＣＡＣＡＡＴＧＧ３′
ｐｏｌｙ（Ａ）Ｎｏｓ ５′ＴＧＴＧＧＡＡＣＡＡＣＡＡＧＡＣＣＣＣＡＡＡＣＴＣ３′
５′ＴＡＣＴＣＡＡＴＡＣＣＡＡＡＣＴＡＡＡＴＴＡＧＡＣＣＡＡ３′
ＨＡ ５′ＧＧＣＡＡＣＣＣＡＡＴＧＴＧＣＧＡＴＧＡ３′
５′ＴＴＣＣＴＣＡＧＡＧＴＡＴＴＧＴＧＧＧＴＡＡＴＣＧＴＡＡＧ３′
ＬＴＢ ５′ＣＴＴＧＴＧＧＡＴＧＴＧＣＴＣＴＡＡＣＧＧＣ３′
５′ＧＡＴＡＧＣＡＧＣＧＡＴＡＧＡＧＴＴＴＧＧＧＧ３′
１．２　试验方法
１．２．１　高效植物表达载体的设计和构建　在已有载体ｐＣＡＭＢＩＡ２３０１ＰＭＩＭＡＲｓ和 ＨＡＬＴＢ融合基因的基
础上，首先通过引物设计在ＬＴＢ后添加ＫＤＥＬ序列，并利用 ＨＡ－犅犪犿ＨⅠ引物和ＬＴＢＫＤＥＬ犛犪犾Ⅰ／犘狊狋Ⅰ引
物进行ＰＣＲ扩增，回收产物及载体，经犅犪犿ＨⅠ和犘狊狋Ⅰ酶切后通过Ｔ４ 连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌，经
９３１第２３卷第４期 草业学报２０１４年
ＰＣＲ及酶切验证；将载体中的ＣａＭＶ３５Ｓ启动子置换为２Ｅ＋３５Ｓ启动子，载体和ｐＭＤ２Ｅ＋３５Ｓ都经犡犫犪Ｉ和
犎犻狀ｄⅢ双酶切，Ｔ４ 连接酶连接后转化大肠杆菌，经ＰＣＲ及酶切验证；然后添加Ω增强子序列，载体和ｐＭＤΩ经
犅犪犿ＨⅠ和犎犻狀ｄⅢ双酶切，Ｔ４ 连接酶连接后转化大肠杆菌，经ＰＣＲ验证；最后添加长度为１００ｂｐ的ｐｏｌｙ（Ａ）与
ＮＯＳ串联序列。载体和ｐＭＤＮｏｓｐｏｌｙ（Ａ）经犓狆狀Ⅰ和犛狆犺Ⅰ双酶切，分别回收载体大片段和Ｎｏｓｐｏｌｙ（Ａ）片
段，Ｔ４ 连接酶连接后转化大肠杆菌，经ＰＣＲ及酶切验证。对验证结果正确的质粒进行测序，获得 ＨＡＬＴＢ融合
植物表达载体如图１。
图１　融合植物表达载体犎犃犔犜犅结构示意图
犉犻犵．１　犉犾狅狑犮犺犪狉狋狅犳狋犺犲犮狅狀狊狋狉狌犮狋犻狅狀狅犳犎犃犔犜犅狏犲犮狋狅狉
　
１．２．２　百脉根的遗传转化　将携带目的载体的农杆菌ＬＢＡ４４０４涂板，挑取单菌落，２８℃摇床振荡培养以活化菌
体，使细菌达到对数生长期（ＯＤ６００为０．５～０．６）。８０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，菌体用 ＭＳ液体培养基重悬，使
ＯＤ６００为０．５～０．６［２０］。
取播种后约８ｄ的百脉根幼苗，以百脉根子叶作为外植体在子叶柄部位剪切，放入培养皿中。将混均匀的菌
液倒入放有子叶的培养皿中，浸泡３０ｍｉｎ。然后将其中的子叶转入有滤纸的 ＭＳ培养基上，２５℃暗培养３～４ｄ，
将暗培养后的愈伤组织转接到加抗生素的筛选培养基中培养约１周。转移到 ＭＳ＋Ｃｅｆ１００ｍｇ／Ｌ的生根培养基
上。每两周换一次新的培养基，快速生根，直至成苗［２１］。
１．２．３　转基因百脉根的分子检测　再生植株ＰＣＲ分子检测，根据 ＨＡ和ＬＴＢ基因全长序列设计特异引物（表
１），以再生百脉根植株基因组为模板，按以下体系进行ＰＣＲ反应：在２０μＬＰＣＲ反应体系中加入１２．７５μＬ
ｄｄＨ２Ｏ，２μＬ１０×ｂｕｆｆｅｒ，２μＬｄＮＴＰ，基因上下游引物各１μＬ，ＥｘＴａｑ酶０．２５μＬ，１μＬ模板；反应程序为：
９４℃预变性５ｍｉｎ，然后９４℃变性４５ｓ，５８℃退火４５ｓ，７２℃延伸１ｍｉｎ，３０个循环，最后７２℃延伸１０ｍｉｎ。
转基因植株的ＲＴＰＣＲ检测，参照“通用植物总ＲＮＡ提取试剂盒”说明进行百脉根ＲＮＡ的提取：按照Ｉｎ
ｖｉｔｒｏｇｅｎ公司反转录试剂盒说明书进行反转录及ＰＣＲ反应。
转基因植株的ＥＬＩＳＡ检测，百脉根总可溶性蛋白的提取：超净台内取１００ｍｇ转基因百脉根叶片放入２．０
ｍＬＥｐ管中，迅速置于液氮内，打样机上破碎，加入５００μＬ蛋白提取液，室温１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清，
即为百脉根总可溶性蛋白粗提液，用于考马斯亮蓝蛋白定量；ＬＴＢ蛋白的定量依照大肠杆菌热敏毒素Ｂ亚基酶
联免疫试剂盒说明书操作。
２　结果与分析
２．１　高效植物表达载体的构建
２．１．１　添加ＫＤＥＬ序列　在已有载体ｐＣＡＭＢＩＡ２３０１ＰＭＩＭＡＲｓ和 ＨＡＬＴＢ融合基因的基础上，通过引物
设计在ＬＴＢ后添加ＫＤＥＬ序列。利用 ＨＡ－犅犪犿ＨⅠ引物和ＬＴＢＫＤＥＬ犛犪犾Ⅰ／犘狊狋Ⅰ引物（表１）以构建载体
质粒为模板进行ＰＣＲ验证，得到１条长约２０００ｂｐ的条带，采用犅犪犿ＨⅠ和犘狊狋Ⅰ对构建好的植物表达载体进行
双酶切鉴定，琼脂糖凝胶电泳得到１条约２０００ｂｐ的条带。ＰＣＲ及酶切验证表明插入基因片段与 ＨＡＬＴＢ
ＫＤＥＬ序列２０６２ｂｐ大小相符，且测序结果与ＨＡＬＴＢＫＤＥＬ序列也完全匹配，载体已正确插入ＫＤＥＬ序列。
２．１．２　置换启动子　将载体ｐＣＡＭＢＩＡ２３０１中的ＣａＭＶ３５Ｓ启动子置换为２Ｅ＋３５Ｓ启动子。已构建载体经
犡犫犪Ｉ和犎犻狀ｄⅢ双酶切，经ＰＣＲ及酶切验证，结果表明ＰＣＲ及酶切获得１条长约７００ｂｐ的条带，与７８５ｂｐ的
２Ｅ＋３５Ｓ启动子大小相符，将验证结果正确的质粒进行测序，且测序结果与２Ｅ＋３５Ｓ启动子序列也完全匹配，载
体已正确插入２Ｅ＋３５Ｓ启动子序列。
０４１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１４） Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．４
２．１．３　添加Ω增强子序列　在已有载体ｐＣＡＭＢＩＡ２３０１ＰＭＩＭＡＲｓ基础上添加Ω增强子序列，经ＰＣＲ及酶
切验证，结果表明ＰＣＲ获得１条长约１００ｂｐ的条带与７５ｂｐ的Ω增强子序列大小相符，将验证结果正确的质粒
进行测序，且测序结果与Ω增强子序列也完全匹配，载体已正确添加Ω增强子序列。
２．１．４　添加多聚ｐｏｌｙ（Ａ）序列　已构建载体经犓狆狀Ⅰ和犛狆犺Ⅰ双酶切，经ＰＣＲ及酶切验证，结果表明ＰＣＲ及
酶切获得１条长约５００ｂｐ的条带与ｐｏｌｙ（Ａ）Ｎｏｓ大小相符，将验证结果正确的质粒进行测序，且测序结果与ｐｏ
ｌｙ（Ａ）Ｎｏｓ序列也完全匹配，载体已正确插入ｐｏｌｙ（Ａ）Ｎｏｓ序列。
通过对已构建载体进行ＰＣＲ、双酶切鉴定及测序验证，结果表明载体已正确插入ＭＨＡＭＬＴＢＫＤＥＬ序列、
２Ｅ＋３５Ｓ启动子、Ω增强子序列、ｐｏｌｙ（Ａ）Ｎｏｓ序列，证明ＨＡＬＴＢ融合表达载体构建成功。
２．２　百脉根的遗传转化
参照实验室已建立的以磷酸甘露糖为筛选标记的百脉根安全高效遗传转化体系，以百脉根七日龄苗子叶（含
下胚轴）为外植体，农杆菌介导法转化百脉根，经暗培养，分化培养和选择培养，最终获得抗性植株９１株（图２）。
２．３　转基因百脉根的分子检测
２．３．１　ＰＣＲ检测　获得百脉根抗性植株后，提取其基因组ＤＮＡ，分别进行 ＨＡ及ＬＴＢ基因ＰＣＲ检测，结果显
示共获得２１株转基因阳性百脉根植株，转化率达到２３．１％，检测结果分别如图３１和图３２。
图２　百脉根的遗传转化
犉犻犵．２　犌犲狀犲狋犻犮狋狉犪狀狊犳狅狉犿犪狋犻狅狀狅犳犔．犮狅狉狀犻犮狌犾犪狋狌狊
　１：种子Ｓｅｅｄｓ；２：七日龄子叶７ｄａｙｓ’ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ；３：侵染Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ；４：选择培养Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｃｕｌｔｕｒｅ；５：分化培养Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅ；６：抗性植株
Ｒｅｓｉｓｔａｎｔｐｌａｎｔ．
图３　转基因百脉根犘犆犚检测
犉犻犵．３　犘犆犚犪狊狊犪狔狅犳狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮犔．犮狅狉狀犻犮狌犾犪狋狌狊
　３－１：ＨＡ基因ＰＣＲ鉴定ＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｐｒｏｆｉｌｅｏｆｔｈｅＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆＨＡ；３－２：ＬＴＢ基因ＰＣＲ鉴定ＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｐｒｏｆｉｌｅｏｆｔｈｅＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓ
ｏｆＬＴＢ．
１４１第２３卷第４期 草业学报２０１４年
２．３．２　ＲＴＰＣＲ检测　为验证ＰＣＲ阳性百脉根植株中ＨＡ及ＬＴＢ基因在转录水平的表达，提取转基因植株总
ＲＮＡ，按照Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司反转录试剂盒说明书进行反转录，并对ｃＤＮＡ进行ＰＣＲ检测，结果如图４和５，说明
ＨＡ及ＬＴＢ基因在ｍＲＮＡ水平成功表达。
图４　犎犃基因犚犜犘犆犚检测
犉犻犵．４　犚犜犘犆犚狅犳犎犃犵犲狀犲
　
图５　犔犜犅基因犚犜犘犆犚检测
犉犻犵．５　犚犜犘犆犚狅犳犔犜犅犵犲狀犲
　
２．３．３　ＥＬＩＳＡ检测　将浓度分别为０．１ｍｇ／ｍＬ的牛血清白蛋白标准品（ＢＳＡ）进行倍比稀释，在５９５ｎｍ吸光
值下绘制ＢＳＡ蛋白标准曲线。利用蛋白提取液提取转基因百脉根植株的总可溶性蛋白，经考马斯亮蓝染色后，
测定其在５９５ｎｍ下的吸光值，并带入ＢＳＡ蛋白标准曲线，计算转基因百脉根中总可溶性蛋白浓度。采用蛋白定
量中同样的方法，将ＬＴＢ标准品进行倍比稀释，进行ＬＴＢ酶联免疫反应，绘制ＬＴＢ标准曲线（图６），计算ＬＴＢ
抗原蛋白浓度。最终计算出２１株阳性百脉根总可溶性蛋白中ＬＴＢ抗原蛋白的含量（图７），其中１２号百脉根
ＬＴＢ表达量最高，达到０．０８６μｇ／ｍｇ（蛋白粗提液），结果表明ＬＴＢ与 ＨＡ蛋白融合不影响各自蛋白的免疫活
性，ＬＴＢ表达量最高达到０．０８６μｇ／ｍｇ（蛋白粗提液），ＨＡ抗原蛋白的分子量是ＬＴＢ的３倍，由此可以推算出
ＨＡ在百脉根中的最高表达量约为０．２５μｇ／ｍｇ（蛋白粗提液）。
图６　犔犜犅蛋白标准曲线
犉犻犵．６　犛狋犪狀犱犪狉犱犮狌狉狏犲狅犳犔犜犅狆狉狅狋犲犻狀　
图７　转基因百脉根中犔犜犅蛋白含量
犉犻犵．７　犔犜犅犮狅狀狋犲狀狋犻狀狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮犔．犮狅狉狀犻犮狌犾犪狋狌狊　
３　讨论
选择一个最佳启动子高表达整合到植物中的外源基因是构建高效植物表达载体的一项重要工作。
ＣａＭＶ３５Ｓ启动子因其强表达和组织特异性表达特点而被广泛应用于双子叶转基因植物。在ＣａＭＶ３５Ｓ启动子
的－４６至－１０５序列中含有增强子序列，将ＣａＭＶ３５Ｓ启动子的－４６至－１０５序列中含有增强子元件重复串联，
构建双３５Ｓ启动子，可显著提高外源基因的表达水平［１１１２］。Ｗａｌｙ等［２２］研究结果表明 Ｄ３５ｓ启动子的表达量相
比于ＣａＭＶ３５Ｓ启动子平均提高了３～１０倍，进一步表明添加双３５Ｓ启动子有助于提高外源基因及外源蛋白表
达量。
真核基因的５′３′非翻译序列（ＵＴＲ）对保持ｍＲＮＡ的稳定性和翻译水平有重要的作用。Ｇａｌｉｅ等［２３］研究
２４１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１４） Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．４
结果表明在５′端添加Ω元件能提高基因的翻译效率。朱祯［２４］报道烟草花叶病毒（ＴＭＶ）的１２６ｋｕ蛋白基因的
Ω因子（６３ｂｐ）的存在可以使ＧｕｓＲＮＡ的转译活性提高数十倍。毛立群和郭三堆［２５］将ｐＢＩ１２１ＧＵＳ基因的３′端
插入了长度分别为２５，５０及１００个ｄＡ残基的ｐｏｌｙ（Ａ）序列并转入烟草中，发现ＧＵＳ基因的活性分别提高了
２７，３７和４７倍，表明ｐｏｌｙ（Ａ）序列的长短与翻译水平呈相关。Ｓｈａｐｉｒｏ等［２６］和Ｇａｌｉｅ等［２３］分别报道称ｐｏｌｙ（Ａ）
尾巴对转录后翻译起增强作用，且增强的程度与ｐｏｌｙ（Ａ）尾巴的长度正相关。因此，添加５′３′非翻译序列在一
定程度解决外源基因在植物体内表达量低和稳定性差的问题。
引导肽可以利用分泌途径将外源蛋白引向特定的部位，从而提高重组蛋白的积累水平。外源基因的表达产
物会受细胞内的蛋白酶的降解，而在接入引导肽序列则会及时对蛋白进行定位，还可以提高蛋白的含量。Ｗａｎ
ｄｅｌｔ等［２７］将编码豌豆（犘犻狊狌犿狊犪狋犻狏狌犿）种子ＶＩＣＩＬＩＮ蛋白的基因和内质网定位信号ＫＤＥＬ的编码序列连接转
化植物，发现在转基因烟草和紫花苜蓿（犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪）中带有ＫＤＥＬ序列的蛋白含量分别是对照的２０和１００
倍。Ｓｏｊｉｋｕｌ等［２８］及Ｔｈａｎａｖａｌａ等［２９］均证明在重组蛋白Ｃ添加内质网滞留信号序列ＫＤＥＬ，可以增加外源蛋白
在内质网中的积累水平，从而提高外源蛋白在转基因植株中的表达量。因此构建含ＫＤＥＬ序列的表达载体可能
对提高外源蛋白的稳定性和积累水平有一定作用。
为提高禽流感血凝素表达量，本研究利用已有的ＨＡＬＴＢ融合基因，通过设计和添加多种调控元件，即双增
强子ＣａＭＶ３５Ｓ启动子、Ω序列、加长ｐｏｌｙ（Ａ）序列、内质网滞留信号ＫＤＥＬ序列等，经ＰＣＲ、双酶切及测序鉴定，
证明ＨＡＬＴＢ融合基因高效植物表达载体构建成功。利用农杆菌介导方法转化百脉根，获得抗性植株９１株，经
ＰＣＲ，ＲＴＰＣＲ检测，得到转基因阳性植株２１株。通过夹心ＥＬＩＳＡ检测，结果表明ＬＴＢ最高表达量达到０．０８６
μｇ／ｍｇ（蛋白粗提液），ＨＡ最高表达量达到０．２５μｇ／ｍｇ（蛋白粗提液），即占总可溶性蛋白的０．０２５％，显著高于
Ｇｕｏ等［３０］于２０１２年报道的ＨＡ抗原蛋白表达量为总可溶性蛋白的０．００７８６％，已接近国际先进水平。本研究通
过载体的设计和构建大幅度提高了禽流感血凝素在百脉根中的表达量，实现了外源抗原蛋白在豆科牧草百脉根
中的高水平表达，为动物实验及禽流感可饲用疫苗的研究奠定了基础。
参考文献：
［１］　ＭａｓｏｎＨＳ，ＬａｍＤＭ，ＡｒｎｔｚｅｎＣＪ．ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｈｅｐａｔｉｔｉｓＢｓｕｒｆａｃｅａｎｔｉｇｅｎｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａ
ｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，１９９２，８９（２４）：１１７４５１１７４９．
［２］　ＨｏｌａｎｄＴ，ＳａｃｋＭ，ＲａｄｅｍａｃｈｅｒＴ，犲狋犪犾．Ｏｐｔｉｍａｌｎｉｔｒｏｇｅｎｓｕｐｐｌｙａｓａｋｅｙｔｏｉｎｃｒｅａｓｅｄａｎｄｓｕｓｔａｉｎｅｄｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆａｍｏｎｏ
ｃｌｏｎａｌｆｕｌｓｉｚｅａｎｔｉｂｏｄｙｉｎＢＹ２ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅ［Ｊ］．ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２０１０，１０７（２）：２７８２８９．
［３］　ＵｎｎｉＳＣ，ＳｏｎｉｙａＥＶ．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ犆狌犮狌犿犻狊狊犪狋犻狏狌狊ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｔｈｅｈｅｐａｔｉｔｉｓＢｓｕｒｆａｃｅａｎｔｉｇｅｎ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＲｅ
ｐｏｒｔｅｒ，２０１０，２８（４）：６２７６３４．
［４］　ＨｅＺＭ，ＪｉａｎｇＸＬ，ＱｉＹ，犲狋犪犾．ＡｓｓｅｓｓｍｅｎｔｏｆｔｈｅｕｔｉｌｉｔｙｏｆｔｈｅｔｏｍａｔｏｆｒｕｉｔｓｐｅｃｉｆｉｃＥ８ｐｒｏｍｏｔｅｒｆｏｒｄｒｉｖｉｎｇｖａｃｃｉｎｅａｎｔｉｇｅｎ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ［Ｊ］．Ｇｅｎｅｔｉｃａ，２００８，１３３（２）：２０７２１４．
［５］　ＳｕｎｉｌＫｕｍａｒＧＢ，ＧａｎａｐａｔｈｉＴＲ，ＳｒｉｎｉｖａｓＬ，犲狋犪犾．ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｈｅｐａｔｉｔｉｓＢｓｕｒｆａｃｅａｎｔｉｇｅｎｉｎｐｏｔａｔｏｈａｉｒｙｒｏｏｔｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ
Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００６，１７０（５）：９１８９２５．
［６］　ＪａｎｉＤ，ＭｅｅｎａＬＳ，ＲｉｚｗａｎｕｌＨａｑＱＭ，犲狋犪犾．ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃｈｏｌｅｒａｔｏｘｉｎＢｓｕｂｕｎｉｔｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｏｍａｔｏｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．Ｔｒａｎｓ
ｇｅｎｉｃＲｅｓｅａｒｃｈ，２００２，１１（５）：４４７４５４．
［７］　ＭｏｒａｖｅｃＴ，ＳｃｈｍｉｄｔＭＡ，ＨｅｒｍａｎＥＭ，犲狋犪犾．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆ犈狊犮犺犲狉犻犮犺犻犪犮狅犾犻ｈｅａｔｌａｂｉｌｅｔｏｘｉｎ（ＬＴ）Ｂｓｕｂｕｎｉｔｉｎｓｏｙｂｅａｎ
ｓｅｅｄａｎｄａｎａｌｙｓｉｓｏｆｉｔｓｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙａｓａｎｏｒａｌｖａｃｃｉｎｅ［Ｊ］．Ｖａｃｃｉｎｅ，２００７，２５（９）：１６４７１６５７．
［８］　ＲｏｓａｌｅｓＭｅｎｄｏｚａＳ，ＳｏｒｉａＧｕｅｒｒａＲＥ，ＬóｐｅｚＲｅｖｉｌａＲ，犲狋犪犾．Ｉｎｇｅｓｔｉｏｎｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｃａｒｒｏｔｓｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｔｈｅ犈狊犮犺犲狉犻犮犺犻犪犮狅犾犻
ｈｅａｔｌａｂｉｌｅｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎＢｓｕｂｕｎｉｔｐｒｏｔｅｃｔｓｍｉｃｅａｇａｉｎｓｔｃｈｏｌｅｒａｔｏｘｉｎｃｈａｌｅｎｇｅ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＣｅｌＲｅｐｏｒｔｓ，２００８，２７（１）：７９８４．
［９］　ＡｓｈｒａｆＳ，ＳｉｎｇｈＰＫ，ＹａｄａｖＤＫ，犲狋犪犾．Ｈｉｇｈｌｅｖｅｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｓｕｒｆａｃｅｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｏｆｒａｂｉｅｓｖｉｒｕｓｉｎｔｏｂａｃｃｏｌｅａｖｅｓａｎｄｉｔｓ
ｉｍｍｕｎｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｍｉｃｅ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００５，１１９（１）：１１４．
［１０］　袁蓓，李京生，吴燕民．利用植物生产药用蛋白的进展、局限及应对策略［Ｊ］．草业学报，２０１３，２２（４）：２８３２９９．
［１１］　ＨｕｌＡＫ，ＣｒｉｓｃｕｏｌｏＣＪ，ＭｅｔｔＶ，犲狋犪犾．Ｈｕｍａｎｄｅｒｉｖｅｄ，ｐｌａｎｔｐｒｏｄｕｃｅｄｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｆｏｒｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆａｎｔｈｒａｘ［Ｊ］．Ｖａｃ
３４１第２３卷第４期 草业学报２０１４年
ｃｉｎｅ，２００５，２３（１７）：２０８２２０８６．
［１２］　ＲｕｇｇｉｅｒｏＦ，ＥｘｐｏｓｉｔｏＪＹ，ＢｏｕｒｎａｔＰ，犲狋犪犾．Ｔｒｉｐｌｅｈｅｌｉｘａｓｓｅｍｂｌｙａｎｄｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇｏｆｈｕｍａｎｃｏｌａｇｅｎｐｒｏｄｕｃｅｄｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
ｔｏｂａｃｃｏｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．ＦｅｂｓＬｅｔｔｅｒｓ，２０００，４６９：１３２１３６．
［１３］　ＮａｇａｙａＳ，ＫａｗａｍｕｒａＫ，ＳｈｉｎｍｙｏＡ，犲狋犪犾．ＴｈｅＨＳＰｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｏｆ犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪ｉｎｃｒｅａｓｅｓｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｐｌａｎｔ
ｃｅｌｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔａｎｄＣｅｌＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２０１０，５１：３２８３３２．
［１４］　ＡｎｔｈｏｎｉｓｅｎＩＬ，ＳａｌｖａｄｏｒＭＬ，ＫｌｅｉｎＵ．Ｓｐｅｃｉｆｉｃｓｅｑｕｅｎｃｅｅｌｅｍｅｎｔｓｉｎｔｈｅ５′ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄｒｅｇｉｏｎｓｏｆｒｂｃＬａｎｄａｔｐＢｇｅｎｅｍＲ
Ｎａｓｓｔａｂｉｌｉｚｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓｉｎｔｈｅｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｏｆ犆犺犾犪犿狔犱狅犿狅狀犪狊狉犲犻狀犺犪狉犱狋犻犻［Ｊ］．ＲＮＡ，２００１，７（７）：１０２４１０３３．
［１５］　ＨｕａｎｇＬＦ，ＬｉｕＹＫ，ＬｕＣＡ，犲狋犪犾．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｓｅｒｕｍａｌｂｕｍｉｎｂｙｓｕｇａｒｓｔａｒｖａｔｉｏｎｉｎｄｕｃｅｄｐｒｏｍｏｔｅｒａｎｄｒｉｃｅｃｅｌ
ｃｕｌｔｕｒｅ［Ｊ］．ＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＲｅｓｅａｒｃｈ，２００５，１４：５６９５８１．
［１６］　ＫａｎｇＴＪ，ＫｉｍＢＧ，ＹａｎｇＪＹ，犲狋犪犾．ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｓｙｎｔｈｅｔｉｃｃｈｏｌｅｒａｔｏｘｉｎＢｓｕｂｕｎｉｔｉｎｔｏｂａｃｃｏｕｓｉｎｇｕｂｉｑｕｉｔｉｎｐｒｏｍｏｔｅｒ
ａｎｄｂａｒｇｅｎｅａｓａｓｅｌｅｃｔａｂｌｅｍａｒｋｅｒ［Ｊ］．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００６，３２：９３１００．
［１７］　ＫｏＫ，ＴｅｋｏａｈＹ，ＲｕｄｄＰＭ，犲狋犪犾．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｏｆｐｌａｎｔｄｅｒｉｖｅｄａｎｔｉｖｉｒａｌｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙ［Ｊ］．Ｐｒｏｃｅｅｄ
ｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａ，２００３，１００：８０１３８０１８．
［１８］　郑琳琳，王佳，贺龙梅，等．唐古特白刺蛋白激酶基因犖狋犆犐犘犓２超表达载体构建及紫花苜蓿转化研究［Ｊ］．草业学报，２０１３，
２２（６）：２２３２２９．
［１９］　马江涛，王宗礼，黄东光，等．基因工程在牧草培育中的应用［Ｊ］．草业学报，２０１０，１９（６）：２４８２６２．
［２０］　陶飞，马江涛，唐益雄，等．抗逆转录因子在百脉根中的功能分析［Ｊ］．草业学报，２０１３，２２（３）：２５０２５８．
［２１］　刘建利，张占路，吴燕民，等．百脉根农杆菌快速高效遗传转化体系的建立［Ｊ］．草业学报，２００６，１５（３）：１２８１３１．
［２２］　ＷａｌｙＯ，ＪａｙａｒａｊＪ，ＰｕｎｊａＺＫ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆβｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅｗｉｔｈｆｉｖｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐｒｏｍｏｔｅｒｓｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｃａｒｒｏｔ
（犇犪狌犮狌狊犮犪狉狅狋犪Ｌ．）ｒｏｏｔａｎｄｌｅａｆｔｉｓｓｕｅｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＣｅｌＲｅｐｏｒｔｓ，２００８，２７（２）：２７９２８７．
［２３］　ＧａｌｉｅＤＲ，ＬｕｃａｓＷＪ，ＷａｌｂｏｔＶ．ＶｉｓｕａｌｉｚｉｎｇｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｐｌａｎｔｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ：ｆａｃｔｏｒｓｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇｅｆｆｉｃｉｅｎｔｍＲＮＡ
ｕｐｔａｋｅａｎｄｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＴｈｅＰｌａｎｔＣｅｌＯｎｌｉｎｅ，１９８９，１（３）：３０１３１１．
［２４］　朱祯．走向２１世纪的植物分子生物学［Ｍ］．北京：科学出版社，２０００：１２１．
［２５］　毛立群，郭三堆．Ω序列和３′ｐｏｌｙ（ｄＡ）长度与基因表达效率的关系［Ｊ］．植物学报，１９９８，４０（１２）：１１６６１１６８．
［２６］　ＳｈａｐｉｒｏＲＡ，ＨｅｒｒｉｃｋＤ，ＭａｎｒｏｗＲＥ，犲狋犪犾．ＤｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓｏｆｍＲＮＡｓｔａｂｉｌｉｔｙｉｎ犇犻犮狋狔狅狊狋犲犾犻狌犿犱犻狊犮狅犻犱犲狌犿ａｍｏｅｂａｅ：ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｉｎ
ｐｏｌｙ（Ａ）ｔａｉｌｌｅｎｇｔｈ，ｒｉｂｏｓｏｍｅｌｏａｄｉｎｇ，ａｎｄｍＲＮＡｓｉｚｅｃａｎｎｏｔａｃｃｏｕｎｔｆｏｒｔｈｅｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙｏｆｍＲＮＡｄｅｃａｙｒａｔｅｓ［Ｊ］．
ＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄＣｅｌｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，１９８８，８（５）：１９５７１９６９．
［２７］　ＷａｎｄｅｌｔＣＩ，ＫｈａｎＭＲＩ，ＣｒａｉｇＳ，犲狋犪犾．ＶｉｃｉｌｉｎｗｉｔｈｃａｒｂｏｘｙｔｅｒｍｉｎａｌＫＤＥＬｉｓｒｅｔａｉｎｅｄｉｎｔｈｅｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃｒｅｔｉｃｕｌｕｍａｎｄ
ａｃｃｕｍｕｌａｔｅｓｔｏｈｉｇｈｌｅｖｅｌｓｉｎｔｈｅｌｅａｖｅｓｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．ＴｈｅＰｌａｎｔＪｏｕｒｎａｌ，１９９２，２（２）：１８１１９２．
［２８］　ＳｏｊｉｋｕｌＰ，ＢｕｅｈｎｅｒＮ，ＭａｓｏｎＨＳ．ＡｐｌａｎｔｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄｅｈｅｐａｔｉｔｉｓＢｓｕｒｆａｃｅａｎｔｉｇｅｎｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｗｉｔｈｅｎｈａｎｃｅｄｓｔａｂｉｌｉｔｙ
ａｎｄｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｐｌａｎｔｃｅｌｓ［Ｊ］．ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，２００３，１００（５）：２２０９
２２１４．
［２９］　ＴｈａｎａｖａｌａＹ，ＭａｈｏｎｅｙＭ，ＰａｌＳ，犲狋犪犾．ＩｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙｉｎｈｕｍａｎｓｏｆａｎｅｄｉｂｌｅｖａｃｃｉｎｅｆｏｒｈｅｐａｔｉｔｉｓＢ［Ｊ］．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆ
ｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａ，２００５，１０２（９）：３３７８３３８２．
［３０］　ＧｕｏＱＱ，ＺｈａｎｇＺＬ，ＪｉａｎｇＳＪ，犲狋犪犾．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｎａｖｉａｎｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ（Ｈ５Ｎ１）ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎｇｅｎｅｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ犔狅狋狌狊
犮狅狉狀犻犮狌犾犪狋狌狊［Ｊ］．ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＲｅｐｏｒｔｅｒ，２０１２，３０（５）：１１１７１１２４．
４４１ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１４） Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．４
犞犲犮狋狅狉犮狅狀狊狋狉狌犮狋犻狅狀犪狀犱狅狏犲狉犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀狅犳犪狀犪狏犻犪狀犻狀犳犾狌犲狀狕犪狏犻狉狌狊
犺犲犿犪犵犵犾狌狋犻狀犻狀（犎犃）犻狀狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮犔狅狋狌狊犮狅狉狀犻犮狌犾犪狋狌狊
ＺＨＡＮＧＷｅｉｗｅｉ１，２，ＹＵＡＮＢｅｉ２，ＺＨＡＮＧＺｈａｎｌｕ３，ＺＨＡＯＹａｎｇｍｉｎ３，
ＸＵＢｉｎｇｌｉａｎｇ１，ＷＵＹａｎｍｉｎ２
（１．ＣｏｌｅｇｅｏｆＧｒａｓｓｌａｎｄＳｃｉｅｎｃｅ，ＧａｎｓｕＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００７０，Ｃｈｉｎａ；
２．ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，
Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００８１，Ｃｈｉｎａ；３．ＳｈｅｎｚｈｅｎＮｏｎｇｋｅＧｒｏｕｐＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，
Ｓｈｅｎｚｈｅｎ５１８０４０，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ａｓａｆｅａｎｄｅｆｆｉｃｉｅｎｔｐｌａｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒ，ＨＡ－ＬＴＢ，ｗｈｉｃｈａｄｄｅｄｄｏｕｂｌｅ３５Ｓｐｒｏｍｏｔｅｒ，Ωｅｎｈａｎ
ｃｅｒ，ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃｒｅｔｉｃｕｌｕｍｒｅｔｅｎｔｉｏｎｓｉｇｎａｌＫＤＥＬｓｅｑｕｅｎｃｅａｎｄｅｘｔｅｎｄｅｄｐｏｌｙ（Ａ）ｓｅｑｕｅｎｃｅｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ．
Ｔｗｅｎｔｙｏｎｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ犔狅狋狌狊犮狅狉狀犻犮狌犾犪狋狌狊ｐｌａｎｔｓｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｂｙｔｈｅ犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿ｍｅｄｉａｔｅｄｍｅｔｈｏｄａｎｄｔｈｅ
ｒｅｓｕｌｔｓｏｆＰＣＲａｎｄＲＴ－ＰＣＲｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅＨＡ－ＬＴＢｇｅｎｅｈａｄｂｅｅｎｏｂｔａｉｎｅｄｆｒｏｍｔｈｅｐｌａｎｔｇｅｎｏｍｅ．
ＥＬＩＳＡｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｈｅＢｓｕｂｕｎｉｔｏｆ犈狊犮犺犲狉犻犮犺犻犪犮狅犾犻ｈｅａｔｌａｂｉｌｅｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ（ＬＴＢ）ｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＬＴＢｃｏｕｌｄｂｅｅｘ
ｐｒｅｓｓｅｄｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ犔．犮狅狉狀犻犮狌犾犪狋狌狊ａｎｄｈａｄｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ．Ｉｔｗａｓｃｏｎｃｌｕｄｅｄｔｈａｔｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＨＡ）
ｗｈｉｃｈｗａｓｆｕｓｅｄｗｉｔｈＬＴＢｈａｄｉｍｍｕｎｅａｃｔｉｖｉｔｙ．ＴｈｅｈｉｇｈｅｓｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆＬＴＢａｎｄＨＡｗｅｒｅ０．０８６μｇ／ｍｇ
（ｃｒｕｄｅｐｒｏｔｅｉｎｅｘｔｒａｃｔｓ）ａｎｄ０．２５μｇ／ｍｇ（ｃｒｕｄｅｐｒｏｔｅｉｎｅｘｔｒａｃｔｓ）ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙｗｈｉｃｈｈａｓａｐｐｒｏａｃｈｅｄａｄｖａｎｃｅｄ
ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｓｔａｎｄａｒｄｓ．Ａｈｉｇｈｌｅｖｅｌｅｘｏｇｅｎｏｕｓａｎｔｉｇｅｎｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｌａｔｆｏｒｍｗｈｉｃｈｗａｓａｂａｓｉｓｆｏｒｒｅ
ｓｅａｒｃｈｏｎｔｈｅＨ５Ｎ１ａｖｉａｎｉｎｆｌｕｅｎｚａｖａｃｃｉｎｅｗａｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｂｙｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：犔狅狋狌狊犮狅狉狀犻犮狌犾犪狋狌狊；ｖｅｃｔｏｒｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ；ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＨＡ）；ＬＴＢ；ａｈｉｇｈｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌ
５４１第２３卷第４期 草业学报２０１４年