全 文 ：木鳖子不同皂甙组分免疫佐剂作用的研究
罗江华 ,胡松华 ,肖琛闻
(浙江大学动物科学学院 ,浙江杭州　 310029)
[收稿日期] 2007 03 -23　[文献标识码 ] A　[文章编号 ] 1002 1280(2008)03 0004 04　[中图分类号 ] R285.5
[摘　要 ] 　本实验用 OVA作为抗原 ,木鳖子粗皂甙及其经硅胶 G分离得到的 5个组分(A、B、C、
D和 E)作为佐剂 ,免疫 ICR雌性小鼠 ,测定各试验组小鼠抗体效价及抗体亚类 。结果表明各组分
均有佐剂作用 ,其活性随流出顺序(A※B※C※D※E)呈递增趋势 。
[关键词 ] 　木鳖子;皂甙;免疫佐剂
基金项目:浙江省科技厅科研项目(编号 2004C32047)
作者简介:罗江华(1981年-),男 , 临床兽医学硕士研究生 ,研究方向为中草药防治动物疾病。
通讯作者:胡松华 , 教授 ,博士生导师。 E-mail:Songhua@zju.edu.cn
AdjuvantActivityofDiferentFractionsofMomordicacochinchinensisSaponins
LUOJiang-hua, HUSong-hua, XIAOChen-wen
(DepartmentofVeterinaryMedicine, ColegeofAnimalSciences, ZhejiangUniversity, Hangzhou, Zhejiang310029;China)
Abstract:FivefractionsofMomordicacochinchinensissaponins(A, B, C, DandE)wereacquiredfromcrude
Momordicacochinchinensissaponinsbysilica-Gcolumnchromatography.Theirhaemolyticactivitiesandadjuvant
potentialsonimmuneresponsestoovalbumininICRmicewereevaluated.Theresultssuggestthatalfivefrac-
tionssignificantlyenhancedIgGandIgGsubclasesresponsesinducedbyovalbumininmice.Theadjuvantactivi-
tytendedtoincreasewiththesequenceofA※B※C※D※Efractionselutedfromthecolumn.
Keywords:Momordicacochinchinensis;saponins;adjuvant
　　木鳖子为葫芦科植物木鳖 (Momordicaco-
chinchinensis(Lour.)Spreng)的成熟种子 ,味苦 ,微
甘 ,性温 ,有毒 ,入肝 、脾 、胃经 ,具有消肿散结 ,攻毒
疗疮功能[ 1] 。最近的一项研究证明一种从木鳖子
获得的提取物(ECMS)具有免疫佐剂活性 [ 2] 。 EC-
MS具有广泛的佐剂作用 ,例如 ,把 ECMS和模式抗
原卵清白蛋白(OVA)混合或者和 O型口蹄疫灭活
疫苗 、AsiaI-O型口蹄疫双价灭活苗混合后免疫
动物 ,可以诱导出更强的免疫反应 ,提高疫苗的免
疫合格率。初步分析表明 , ECMS是一种含多种化
学成分的混合物 ,主要成分是三萜皂甙类。为了明
确 ECMS发挥佐剂作用的有效部位 ,为进一步分离
纯化 ECMS中具有佐剂作用的有效成分奠定基础 ,
本研究采用硅胶 G柱层析方法分离得到 ECMS的
5个组分 ,并研究各组分的免疫佐剂作用。
1　材料和方法
1.1　材料仪器　木鳖子 ,购自安徽省亳州中药材市
场;6周龄 ICR雌性小鼠 ,购于上海实验动物中心;卵
清白蛋白(OVA, gradeV),美国 sigma公司产品;硅
胶 G200 ～ 300目 ,青岛海洋化工有限公司;D101中
性大孔树脂 ,天津市海光化工有限公司产品。
1.2　木鳖子提取物 ECMS及其组分的制备　木鳖
子 3 000 g,粉碎 ,用石油醚脱脂 3次 ,每次 10.5 L,
共去掉脂质 601.5 g。残渣用 70%乙醇 60℃回流
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提取 5次 ,每次 12 L,合并提取液。减压浓缩 ,挥干
溶剂得 175 g褐色固体 ,用 1.8 L水溶解 ,溶液离心
沉淀(1 600 g)。取上清液过 D101吸附大孔树脂
柱 ,首先分别用水和 30%乙醇洗脱 ,然后用 60%和
90%乙醇洗脱 ,每次洗脱剂用量为 2倍柱体积 。收
集 60%乙醇洗脱剂 ,挥干溶剂得 26 g淡黄色的粗
皂甙(ECMS)。 ECMS用硅胶 G柱色谱分离 ,依次
用不同比例氯仿∶甲醇(8∶1、6∶1、4∶1、2∶1、1∶1、甲
醇)洗脱 ,每 50 mL作 1流分 ,用 TLC法检测流出组
分 , 25%磷钨酸乙醇显色 ,从 100 ～ 156流分都有皂
甙被检出。合并流分 101 ～ 109,流分 110 ～ 116,流
分 117 ～ 125,流分 126 ～ 144和流分 145 ～ 156, 挥
干溶剂 , 得组分 A(0.42 g)、B(0.90 g)、C(1.90
g)、D(2.05 g)和 E(1.3 g)。
1.3　ECMS和各组分的鉴定
1.3.1　Molish反应[ 3] 　将组分配制成 0.05%的水
溶液 ,取 2 mL,加入几滴 10%α-甲萘酚乙醇溶液 ,
然后加入 1 mL浓硫酸 ,有紫色环出现者为阳性。
1.3.2　Libermann-burchard反应 [ 3] 　取组分 10
mg溶于 20 mL正丁醇中 ,取 2 mL, 加 1 mL冰乙
酸 ,不振摇 ,加 1 mL浓硫酸 ,试管底部变为棕黄色 ,
放置 3 ～ 4 h后 ,变为棕红色者为阳性。
1.3.3　泡沫反应 [ 3] 　将组分配制成 0.05%的水溶
液 ,取 2 mL,用力振摇试管 1 min出现泡沫 ,静置 15
min后仍有大量泡沫存在者为阳性 。
1.3.4　溶血性试验[ 4] 　将 ECMS各组分用生理盐
水配成 1 000 μg/mL样品溶液。用二倍稀释法将
各组分的溶液在 1 mL的塑料离心管中稀释成
2 ～ 500 μg/mL的溶液。各管加入等量的 0.5%绵
羊红细胞 ,置 37℃孵育 30 min, 离心 ,取上清液 ,在
405 nm波长测定 OD值。对照 1为加入 0.5 mL生
理盐水 ,对照 2为加入 1 mg/mLQuilA皂甙使其完
全溶血 。
1.4　粗皂甙含量测定
1.4.1　标准曲线的绘制[ 5] 　以人参皂甙 Rb1为标准
品绘制标准曲线 ,将人参皂甙 Rb1配制成 1 mg/mL水
溶液 ,人参皂甙 Rb1溶液分别取 30、60、90、120、
150、180 μL, 50℃减压挥去溶剂 ,加入 0.2 mL新配
制的 5%香草醛 -冰乙酸溶液和 0.8 mL高氯酸 ,
60℃水浴 15 min后 ,流水冷却 ,加入 5 mL冰乙酸静
置 10 min,于 548 nm测 OD值 ,得回归方程:C=
4.4185OD+0.0842 , R2 =0.9997。
1.4.2　样品皂甙浓度测定 　将 ECMS配制成 1
mg/mL水溶液 ,取 ECMS溶液 200 μL,按照 1.4.1绘
制标准曲线的方法操作 ,在波长 548 nm测定 OD值 ,
将测得的 OD值代入回归方程计算粗皂甙的含量。
1.5　免疫佐剂试验
1.5.1　实验动物及其免疫　ICR小鼠 35只随机
分成 7组 ,每组 5只 。每只小鼠颈部皮下注射含
OVA(10 μg)和组分 A、B、C、D、E或者 ECMS(50
μg)的生理盐水溶液 ,对照组小鼠注射含 OVA的生
理盐水溶液。 2周后进行二免 ,二免后 3周采血 ,制
备血清。
1.5.2　IgG效价的测定[ 6] 　在 96孔酶标板(浙江
拱东医用塑料厂)每孔加入 100 μL包被液(含 5 μg
OVA/mL的 0.05 mol/L碳酸盐缓冲液),置 4℃孵
育 18 h后 ,洗涤液(pH7.4磷酸盐缓冲液 PBS)洗
涤 3次 ,每次 3 min。每孔加入 300 μL含 1%小牛
血清的 PBS封闭液(0.01 mol/L, pH7.4),于 37℃
孵育 1 h后 ,再用洗涤液洗涤 3次 ,每次 3 min。用
稀释液将待测血清在酶标板上作二倍稀释 ,使血清
稀释度为 1∶50 ～ 1∶3 200。于 37℃孵育 2 h后 ,用
洗涤液洗涤 3次 ,每次 3 min。加入经 1∶500稀释
的羊抗小鼠 IgG抗体 (CHEMICONInternational
Inc), 100 μL/孔 , 37℃孵育 2 h,再用洗涤液洗涤 3
次 ,每次 3 min。加入 TMB(四甲基联苯二胺 , SIG-
MA-ALDRICH公司)底物溶液显色 , 100 μL/孔 ,
37℃孵育 15 min,加 1 mol/LH2SO4 50 μL/孔终止
反应 。用酶标仪在 450 nm波长测定 OD值。
1.5.3　IgG亚类测定 [ 6] 　在已包被抗原 OVA的
96孔酶标板上加入 1∶800倍稀释的待检血清(100
μL/孔), 37℃孵育 1 h,用洗涤液洗涤 3次 ,每次 3
min。加入经 1∶600稀释的生物素标记的山羊抗小
鼠 IgG1或 IgG2a(SantaCruzBiotechnologyInc), 100
μL/孔 , 37℃孵育 1 h, 用洗涤液洗涤 3次 ,每次 3
min。加入 1∶4 000稀释的辣根过氧化物酶标记的
抗生物素(BDBiosciencesPharmingen)100 μL/孔 ,
37℃孵育 1 h,用洗涤液洗涤 3次 ,每次 3 min。加
入 TMB底物溶液显色 , 100 μL/孔 , 37℃孵育 15
min,加 1 mol/LH2SO4 50 μL/孔终止反应 。用酶标
仪在 450 nm波长测定 OD值。
1.5.4　统计学分析　采用 SPSS12.0单因素方差分
析方法比较组间均数差异 ,显著性水平设 P<0.05。
2　结 果
2.1　木鳖子提取物得率和各组分的性质　木鳖子
用乙醇回流提取后 ,提取液直接过 D101吸附大孔
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树脂柱 ,用 30%乙醇洗脱杂质 ,收集 60%乙醇洗脱
部分 ,挥干溶剂 ,获得木鳖子总皂甙(ECMS),得率
为 8 g/kg,皂甙含量为 55%左右(以人参皂甙 Rb1
为标准)。
各组分的 Molish反应和 Libermann-burchard
反应都为阳性 ,说明所分离到的各组分中都含有三
萜皂甙成分 。各组分均有泡沫反应 ,但 40 min后泡
沫的高度以及持续时间各异 ,说明各组分的性质有
所差异(表 1)。
表 1　各组分物理性质
组分 粗皂甙 组分A 组分B 组分 C 组分 D 组分 E
颜色
形态
淡黄色
粉末
黄褐色
晶体
黄色
晶体
黄色
晶体
淡黄色
晶体
白色
晶体
40 min后
泡沫高度 4 cm 2.5 cm 5 cm 4 cm 3 cm 0.2 cm
2.2　各组分的溶血作用　从图 1中可见:总皂甙
及组分 C、QuilA的半数溶血指数 HD50依次为 90、
25、12 μg/mL,组分 A、B、D、EHD50都在 48 μg/mL
左右。
图 1　ECMS及其各组分的溶血作用
2.3　IgG抗体效价　实验对 7组总共 35只小鼠进
行总 IgG抗体效价检测 ,结果显示各组分作用后抗
体效价与对照组相比 ,最低组分 A提高近 3倍 ,最
高的组分 E抗体效价提高了 6倍多(图 2)。
图 2 ECMS各组分对 IgG效价的影响
(无相同字母者 ,表示组间的 IgG效价有显著性差异(P<0.05))
2.4　IgG亚类　与对照组相比 ,各组分都能显著促
进 OVA特异性抗体 IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3的产
生。但各组分只有在刺激 IgG3的分泌时 ,组分 A和
D与组分 B有显著差异 ,其他无显著差异(图 3)。
图 3　ECMS各组分对 IgG亚类水平的影响
(无相同字母者 ,表示组间的抗体效价有显著性差异(P<0.05))
3　讨 论
本实验在木鳖子皂甙的提取过程中参考了姚
毅[ 7] 、许舒雯等 [ 8]提出的方法 ,即直接用 D101大孔
树脂柱分离纯化植物皂甙 , 采用 30%乙醇洗脱杂
质 ,收集 60%乙醇洗脱组分 ,挥干溶剂 ,得到木鳖子
粗皂甙产率为 8 g/kg,皂甙含量为 55%左右 ,取得
了比较好的提取效果。
本研究用硅胶柱从木鳖子粗皂甙中分离得到
A、B、C、D和 E5个组分。图 2结果表明 , 5个组分
都有免疫增强作用 ,而且从 A到 E,其免疫增强作
用呈现逐步增加的趋势 ,组分 E比总皂甙和组分 A
有显著增强作用(P<0.05)。由于 5个组分是先
后从硅胶 G柱中流出来的 ,各组分的极性从组分 A
到组分 E依次逐渐增强 ,因此 ,木鳖子皂甙的免疫
佐剂活性随着极性的增加而增强。这一现象与
Odaa等[ 9]在研究大豆皂甙的佐剂活性与分子结构
的关系时所得结果相似 ,且他们还认为皂甙的佐剂
活性与其对机体免疫系统的调节作用有关。
　　免疫系统产生 IgG2和 IgG1两种亚类和 Th1
与 Th2两种免疫应答有关 [ 10 -11] 。 Th1类反应主要
促进 IgG2亚类的产生 , Th2类反应主要促进 IgG1
亚类的产生。由图 3可见 , 5个组分以及粗皂甙都
能显著地刺激 IgG两种亚类的分泌(P<0.05),说
明它们能增强 Th1与 Th2两类免疫反应 。
组分 A, B和 E的溶血活性相似 ,但它们的佐
剂活性却不相同;组分 C在 5个组分中的溶血活性
最强 ,但其佐剂活性却低于组分 E。这说明皂甙的
佐剂活性与溶血活性不具有相关性。
本研究从木鳖子粗皂甙中分离得到的 5个组
分中 ,组分 E的佐剂作用最强 ,并且溶血作用不大。
为了进一步探讨木鳖子粗皂甙的佐剂活性成分 ,组
分 E值得进一步研究。
·6· 中国兽药杂志　　　　　　　　　　2008, 42(3):4 ～ 7/罗江华 ,等　
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全国重大动物疫控工作会议召开　尹成杰强调狠抓落实做好春季防控工作
　　2月 27日 , 农业部召开全国重大动物疫病防控工作会
议 , 贯彻落实国务院关于加强灾后重建促进畜牧业生产恢
复 、加强重大动物疫病防控工作的有关部署 , 分析当前禽流
感 、高致病性猪蓝耳病等重大动物疫病防控形势 ,进一步加
大动物疫病防控工作力度。农业部副部长尹成杰强调 , 各
级畜牧兽医部门一定要认清动物疫病防控形势 , 狠抓以免
疫为主综合防控措施的落实 , 强化组织 , 强化指导 , 强化督
查 , 切实做好春季禽流感 、高致病性猪蓝耳病等重大动物疫
病防控工作。
尹成杰说 , 近些年来 , 各地各有关部门认真贯彻落实
“加强领导 、密切配合 , 依靠科学 、依法防治 , 群防群控 、果断
处置” 24字防控方针 , 加大防控力度 , 有力有序有效地开展
禽流感 、高致病性猪蓝耳病等重大动物疫病防控工作 , 取得
重要阶段性成效。全国疫情形势总体平稳 , 对保证畜牧业
健康发展和畜产品安全发挥了重要作用。但还应该看到 ,
当前防控形势依然严峻 , 低温雨雪冰冻灾害对重大动物疫
情防控工作造成一定影响 ,加之周边国家疫情频发 , 我国局
部地区发生疫情风险可能性增大。一是灾害发生时正值春
防开始 , 由于气候恶劣 、交通受阻等情况 , 部分灾区春季免
疫推迟或应免未及时补免 , 且受灾地区正是水禽饲养密集
区 , 散养比例大 ,发生疫情风险较大 。二是灾害导致停水停
电 ,造成家禽饲养条件和营养状况差 ,抗病能力下降 ,雨雪冰
冻和寒冷潮湿条件又使禽流感病毒更加活跃 , 增加了发病几
率。三是灾害造成不少禽只死亡 ,若一些病死禽只流入市场 ,
将会带来疫病传播风险。四是随着春季转暖 ,大量候鸟迁徙 ,
带毒候鸟向家禽传播疫情风险加大。五是随着灾后恢复生
产陆续展开, 大量种禽调运加大了疫情跨区域传播风险。因
此 ,各级畜牧兽医部门一定要站在全局和战略高度 ,准确把握
当前疫情形势 ,对禽流感等重大动物疫病发生要有充分的估
计 ,对防控工作要有充分的准备, 要不断加大防控力度 ,切实
打好防控高致病性禽流感、蓝耳病的攻坚战。
尹成杰强调 , 各级畜牧兽医部门要把防控高致病性禽
流感 、蓝耳病作为当前防控工作的重要任务 , 狠抓以免疫为
主综合防控措施的落实 , 切实抓出成效。要把免疫作为关
键措施 , 精心组织 ,周密部署 , 确保 “应免尽免 , 不留空当 ”。
特别是受灾严重地区 ,要克服灾害带来的困难 , 落实疫苗经
费 、加快疫苗招标采购 ,全力做好免疫工作。要按照农业部
免疫方案要求 , 结合各地实际 , 抓好高致病性禽流感 、口蹄
疫 、高致病性猪蓝耳病 、猪瘟等强制免疫。 禽流感免疫重点
加强饲养周期短的肉鸡 、肉鸭 , 以及淘汰上市的蛋鸡免疫工
作;高致病性猪蓝耳病的免疫要坚持 “免母 、免小 、免早 ”的
原则 , 首先要抓好母猪免疫 , 仔猪免疫 , 同时要及早免疫;对
新补栏的畜禽也要及时进行补免。 要加强对免疫环节监督
管理 , 切实按照免疫技术程序和规范进行免疫。
尹成杰强调 ,在做好免疫工作的同时 , 各地要进一步强
化疫情监测等其他防控措施的落实。要着力强化疫情监测
和报告。在做好日常监测和紧急疫情监测的基础 , 要加大
水禽 、活畜禽交易市场 、候鸟栖息地 、野鸟活动频繁地区 、散
养畜禽 、畜禽养殖集中地区监测力度。各地要进一步健全
疫情监测体系 , 完善村级防疫员和疫情报告观察员制度。
要着力强化疫苗监管。当前灾后防疫和春季集中免疫需要
大量疫苗 , 中国兽医药品监察所和各级兽医部门要采取一
切措施 , 力保疫苗供应 ,力保疫苗质量。要继续强化飞行检
查 、驻厂监督 、督查督导 、批签发以及质量监督抽检等监管
措施。要着力强化执法监督。组织做好动物卫生监督执法
规范年活动 , 重点推进依法行政 , 深化体制改革 , 完善执法
手段 , 强化依法监管 , 严打违法行为。加强活禽市场监管 ,
对重点活禽市场实行每周定点检测制度 , 严格执行定期休
市和闭市后彻底消毒制度 , 有效防止疫源传播和扩散。要
着力强化应急处置。各级畜牧兽医部门要针对当前灾害特
点 , 进一步完善应急预案 , 确保一旦发生疫情 , 能及时控制
和扑灭。要着力强化技术培训。加强免疫 、监测 、无害化处
理 、消毒等防疫技术培训工作 , 要培训到县乡 , 提高基层防
疫人员素质 , 保证各项防控工作顺利开展。
摘自 htp://www.agri.gov.cn/xxlb/t20080228 980578.htm
·7·　2008, 42(3):4 ～ 7/罗江华 ,等　　　　　　　　　　中国兽药杂志