全 文 ：Basic Research 基础研究
珠子参体外诱导人肝癌细胞凋亡效应及机制研究
陈　涛1 ,陈龙飞2 ,金国琴2 ,李　丹1*
(1.三峡大学医学院中医药免疫研究室 , 宜昌　443002;2.上海中医药大学生化教研室 , 上海　200032)
[ 摘要] 　目的:观察珠子参体外诱导人肝癌细胞凋亡效应并初探其分子机制。方法:体外细胞培养采用人肝癌细胞株
SM MC-7721 , 分为对照(BL)组 、珠子参(PJ)组 、二甲基亚砜(DMSO)组及 5-FU 组 , 采用电镜观察作用后肝癌细胞超微结构改
变;流式细胞仪检测肝癌细胞周期和凋亡率;RT-PCR法检测癌基因 c-myc、c-fos 和抑癌基因 p53 、p21 表达的变化。结果:与
对照组比较 ,电镜下珠子参组 SMMC-7721 细胞染色质浓缩 , 分解成大小不一有膜包绕团块 , 内含有新月形 DNA 物质及细胞
器 ,形成凋亡小体;周期分析可见 G 0 /G1 期细胞阻滞 , 阻止了细胞向 S 期的转换 , 并引起细胞凋亡 , 凋亡率达 38. 34%;RT-
PCR半定量分析珠子参能降低癌基因 c-myc表达( P <0. 05), 增高抑癌基因 p53 和 p21 表达( P <0. 05)。结论:珠子参能
诱导人肝癌细胞 SMMC-7721 凋亡 ,部分作用机制可能与阻滞细胞停留在 G 0 /G 1 , 降低癌基因 c-myc 和 c-fos 表达 , 增高抑癌
基因 p53 和 p21 表达有关。
[ 关键词] 　肝肿瘤;珠子参;细胞凋亡;癌基因;基因 ,肿瘤抑制;SMMC-7721 细胞
[ 中图分类号] 　R735. 7　　[ 文献标识码] 　A　　[ 文章编号] 　1000-7431(2006)02-0144-04
Panax japlcus var induced apoptosis of human hepatocarcinoma cells in vitro
CHEN T ao1 ,CHEN Long-Fei2 , JIN Guo-Q in2 , LI Dan1*　(1. Department of Immunology of T raditional Chinese M edi-
cine , Th ree Gorges University , Yichang 443002 ,China;2. Department of Biochemist ry , Shanghai University of T radition-
al Chinese M edicine ,Shanghai 200032 ,China)
[ ABSTRACT] 　Objective:To observe the effect of Panax japlcus var(PJ)on apoptosis of human hepatocarcinoma cell
line SMMC-7721 in vitro and the molecular mechanism . Methods:Human hepatocarcinoma cell line SMMC-7721 were di-
vided into 4 groups:cont rol group , PJ group , DMSO group , and 5-F U group. T he apop totic morphologic changes of hu-
man hepatocarcinoma cells were observed by t ransmission electron microscope. Cell cycle and t he apoptotic rate were de-
tected by flow cytomet ry. T he expression s of oncogenes c-myc and c-f os and anti-oncogenes p53 and p21 were determined
by RT-PCR. Results:Compared w ith cont rol group , PJ elicited typical apoptotic morphological changes identified by ap-
optotic body f ormation , chromatin condensation , mitochond ria degeneration , and microvillus disappearance. Human hep-
atocarcinoma cells were accumulated at G0 /G1 period while S period ratio fell (P<0. 05). The apoptotic rate of PJ group
w as 38. 34%. The exp ressions of oncogenes c-myc and c-fos were reduced and the expressions of anti-oncogenes p53 and
p21 were increased. Conclusions:PJ induced the apoptosis of human hepatocarcinoma cells SMMC-7721 which was partly
due to G0 /G1 arrest , down-regulation of c-myc and c-f os expressions , and up-regulation of p53 and p21 expression.
[KEY WORDS] 　Liver neoplasms;Codonopsis convolvulacea ;Apop tosis;O ncogenes;Genes , tumor suppressor;
SMMC-7721 cells
[ Tumor , 2006 , 26(2):144-147]
[基金项目] 　湖北省教育厅科研基金资助项目(编号:D200513006)
[作者简介] 　陈　涛(1962-),男(汉族),博士 ,教授
*Corresponding author. Tel:13872466273
E-mail:li_dan579@yahoo. com. cn
　　细胞凋亡是在一定的生理和病理条件下 ,由基
因控制循自身程序的细胞自主性死亡。肝癌细胞的
凋亡在肝癌的发生发展 、转归及治疗等方面均有重
要的意义 。珠子参(Pana x japlcus va r , major)又名
扣子七 ,属五加科人参属植物 , 其根茎为药材珠子
参 ,具活血散瘀 、补血止血 、消肿止痛之功效 ,主要分
布于东喜马拉雅至我国西部山区 。前期工作中 ,作
者对珠子参抗肝癌作用进行了系统研究 ,效果显著。
为了进一步探讨珠子参抗癌作用机制 ,本课题组从
体外培养的人肝癌细胞经药物作用后发生的凋亡改
变及与凋亡相关的基因的表达等方面揭示该药可能
诱导肝癌细胞凋亡的机制。结果报道如下 。
1　材料与方法
1. 1　材料
1. 1. 1　细胞株　SMMC-7721(人肝癌细胞株):购
144 肿瘤 2006年 2月第 26卷第 2期　Tum or Vol. 26 , No. 2 , Feb. 2006
自上海中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库 。
1. 1. 2　主要药品与试剂　珠子参:购自湖北宜昌久
康药房 ,经宜昌市药检局鉴定;产地:神农架;批号:
200201。5-氟尿嘧啶(5-FU):天津氨基酸公司人民
制药厂产品。二甲基亚砜(DMSO):AMRESCO 公
司产品 。RPM I 1640 培养基:Gibco 公司产品 。胰
酶(TRYPSIN):AMRESCO 公司产品 。胎牛血清:
上海实生细胞生物技术有限公司产品。Trizol 试剂
盒:Gibco Brc公司产品 。焦碳酸二乙酯(DEPC):博
彩生物技术公司产品。Trizol 、M-MLV(200 U /μL)、
Taq polymerase(5 U /μL):均为 Gibco 公司产品。
RNAsin (40 U /μL) :购自 Promaga 公司。 dN TP
(each 10 mmol /L)和随机引物(100μmol/L):博彩生
物技术公司产品 。
1. 1. 3　检测用主要仪器　CM-120 型透射电子显
微镜:PHILIPS公司产品。COIC 倒置相差显微镜:
重庆光学仪器厂产品。BVPM-8 型光学投影显微
镜:American Biolo gics公司产品。流式细胞仪:美
国 Coul ter 公司产品 , 型号 Coulter EPICS-XL。
9600型 PCR基因扩增仪:购自 PE公司。KS400型
计算机图像分析系统:购自ZEISS 公司 。
1. 2　方法
1. 2. 1　珠子参药液制备　珠子参根茎烘干称重 ,研
磨成粗粉 ,装入圆底烧瓶内加 10倍体积蒸馏水浸泡
2 h ,然后将圆底烧瓶置于电子恒温水浴锅中 , 80℃
加热 8 h ,待水溶性成分充分溶出后停止加热 ,中性
滤纸过滤后弃掉药渣 ,将所得的药液进一步在电炉
上浓缩 , 使其终浓度为含生药 0. 33 g /mL。经
0. 22 μm微孔滤膜过滤除菌 ,4℃保存。
1. 2. 2　实验分组　分 4 组:①空白对照组(BL):
RPM I 1640培养液(含 10%胎牛血清)。 ②珠子参
组(PJ):将经过滤除菌的珠子参煎液加入 RPMI 1640
培养液(含 10%胎牛血清),配制成终浓度为 100μg /
mL药液[ 1, 2] 。 ③5-FU组:5-FU 经0. 22μm滤膜过滤
除菌 ,加入 RPM I 1640培养液(含 10%胎牛血清),
配制成终浓度为 50 μg /mL 药液[ 1] 。 ④DMSO组:
避光保存的DMSO经 0. 22μm 滤膜过滤除菌 ,加入
RPM I 1640培养液(含 10%胎牛血清),配制成终浓
度为 1. 25%药液[ 1] 。以上各组培养液均调整 pH 值
为 7. 2。
1. 2. 3　细胞培养 　细胞培养方法参照文献[ 3] 。
SMMC-7721细胞复苏后在含 10%胎牛血清的
RPM I 1640培养液 , 5%CO 2 、37℃条件下传代培养 ,
至对数生长期后 ,分组 ,加入相应药物后 ,调整细胞
至 2×106 个 /mL。
1. 2. 4　流式细胞术检测 SMMC-7721细胞周期及
凋亡率变化　药物作用 72 h ,调整各组细胞浓度为
1×106 个 /mL ,常规消化离心 ,沉淀溶于 0. 1 mo l /L
PBS液中并加 400 μg PI(碘化丙啶),4℃,避光染色
30 min 。以(300±40)个细胞 / s的速度 ,检测(1. 9
～ 2. 2)×104 个细胞 ,经计算机系统分析 ,打印结
果 。
1. 2. 5 　RT-PCR 检测 SMMC-7721 细胞癌基因
c-myc、c-fos及抑癌基因 p53 、p21表达的变化　目的
基因引物与内参 β-actin引物查阅 GENBANK原序
列 ,用 PRIMER 3. 0软件设计 ,由申能博彩公司合成。
β-actin上游 5′-CTGACTGACTACCTCA TGAA
GATC-3′, 下游 5 p′-GGAAGGAAGGCTGGAA
GAGTG-3′(248bp)。c-myc上游5′-AACTCAAGCA
AAAGGGAGCA-3′,下游5′-GGG TTGCAAGCCT
GT TGTA T-3′(227bp)。c-fos上游5′-TGCTGGCT T
CAGAAAATCCT-3′,下游5′-T TG TGGACCCT T
TTAG TGCC-3′(109bp)。p53上游5′-ACA TGGAG
GCCAACAAGAAC-3′,下游5′-CT TCTCCAGG T
TTGCTCTGG-3′(115bp)。p21上游5′-TGCA TCC
A TTCA TTCCT TCA-3′,下游5′-ACCAAGA TCA
AGCCA T TTGC-3′(283 bp)。总 RNA 按 TrizolTM
试剂操作程序提取。D260 nm /D280 nm为 1. 7 ～ 2. 1 ,
RNA储存于 - 70℃。取 2 μg 总 RNA 反转录合成
cDNA 。取 cDNA 4μL 进行 PCR反应:dNT P(each
0. 5 mmo l /L)2 μL , 10 ×buf fer 4 μL , MgCl2(25
mmol /L)4 μL ,上游引物(4 μmol /L)2 μL ,下游引
物(4μmol /L) 2μL ,逆转录产物 4μL , Taq DN A聚
合酶(5 U /μL)0. 4 μL ,加水至 40 μL , 石蜡油 25
μL ,PCR反应条件为 94℃3 min;94℃ 40 s , 60℃1
min ,68℃2 min ,30个循环;68℃5 min。PCR产物
20 μL 与上样缓冲液5 μL混匀后 ,上样于 1. 6%的琼
脂糖凝胶中 , 80 V ,电泳1 h。凝胶分析系统观察拍
照 、分析 。
1. 2. 6　数据处理　图像采用 KS400型分析系统进
行光密度扫描 ,以目的基因光密度值与 β-actin 光密
度值的比值作为该样品中目的基因的相对表达量。
以目的基因的相对表达量为参数进行统计分析 。图
像分析的方法是:在同一块凝胶内 ,选取任一条带
(通常选 marker中的一条条带)作为参照条带 ,设定
其浓度为一数值(如为 20),然后再选取目的条带 ,
计算机系统会以参照条带为基准 ,自动测算其浓度。
1. 3　统计方法　数据采用单因素方差分析 ,应用
145 第 2期. 陈　涛 ,等. 珠子参体外诱导人肝癌细胞凋亡效应及机制研究
S PSS 10. 0在 PC 上进行统计学处理 ,以 P <0. 05
为差异有显著性 。
2　结　果
2. 1　SMMC-7721 细胞超微结构的变化　透射电
镜下可观察到:空白对照(BL)组细胞核膜核仁完
整 ,线粒体 、高尔基体 、内质网等细胞器完整清晰;珠
子参(PJ)组出现细胞凋亡特征性的结构变化:染色
质浓缩 ,分解成大小不一有膜包绕团块 ,内含有新月
形 DNA 物质及细胞器 ,凋亡小体形成(完整的细胞
膜包绕着一部分细胞器);DMSO 组细胞可见核碎
裂;5-FU 组细胞可见凋亡早期染色质深染积聚 ,有
分解趋势(图 1)。
图 1　透射电镜下观察 SMMC-7721 细胞超微结构变化
Fig. 1　Ultrastructure of SMMC-7721 cells under
transmission electron microscope(×5 000)
A:cont rol cel ls:nu clear envelope , nucleolus and cell organelles w ere
complete and clear;B:t reated w ith 100 μg /mL PJ for 72 h(×
5 000):nucleolu s was disappeared , th e nuclear chromatin w as con-
densed and agg regated under th e nuclear membrane , then formed ap-
optot ic bodies;C:t reated w ith 1. 25%DMSO for 72 h:nu clear f rag-
m entation;D:t reated w ith 50μg /m L 5-F U for 72 h:hyperchromat ic
chromatin had the t rend of disinteg rat ion
2. 2　SMMC-7721细胞周期和凋亡率变化　由表 1
可见 ,对照组细胞增殖旺盛 ,细胞主要停留在S /G 2 ～
M 期;与对照组比较 ,珠子参组 G 0 /G 1 期细胞增多
(P <0. 05),表明珠子参可使细胞出现 G 0 /G 1 期阻
滞 ,阻止细胞向 S 期的转换;5-FU 也可使细胞阻滞
在G 0 /G 1 期 ,与空白组比较 P <0. 05;二甲基亚砜
组与对照组比较差别无统计学意义(P >0. 05)。
与对照组比较 , 珠子参组凋亡率显著升高达
38. 34%,二甲基亚砜和 5-FU 也可使细胞凋亡率升
高(P<0. 05),但作用不如珠子参明显。表明 3 组
均能诱导 SMMC-7721 细胞凋亡 ,其中珠子参组凋
亡率与对照组比较 ,差异非常显著(P<0. 01)。
表 1　实验各组 SMMC-7721 细胞周期分布和凋亡率(%)
Table 1　Cell cycle distribution and apoptotic rate of
SMMC-7721 cells in experimental groups(%, x±s)
Group n G 0 /G 1 S G2 /M
Apoptosis
rate
Cont rol 6 12. 01±2. 76 39. 01±2. 63 48. 91±2. 75 14. 26±2. 56
PJ (100
　μg /m L) 6 24. 50±2. 23*26. 32±2. 74 49. 04±4. 51 38. 34±2. 39**
DMSO
(1. 25%) 6 12. 93±3. 12#27. 32±3. 28 49. 92±4. 91 22. 40±3. 23*
5-FU(50
　μg /m L) 6 19. 10±3. 84*27. 02±2. 85 53. 68±4. 83 18. 20±2. 89*
*P<0. 05 , **P <0. 01 , #P >0. 05 , vs cont rol g rou p
2. 3　癌基因 c-myc、c-fos及抑癌基因 p53、p21表达变
化　与对照组比较 ,珠子参使原癌基因 c-myc表达显
著降低(P <0. 01),二甲基亚砜和 5-FU 均能使原癌
基因 c-myc表达降低(P <0. 05);珠子参使 c-fos表
达有下降趋势 ,差别无统计学意义(P >0. 05),二甲
基亚砜和 5-FU 对 c-fos 表达影响与对照组比较差
别无统计学意义 。与对照组比较 ,珠子参能上调抑
癌基因 p53和 p21表达(P <0. 05),二甲基亚砜和
5-FU也能使 p53 表达明显升高(P <0. 05);而对
p21二甲基亚砜和 5-FU 作用不明显(表 2 ,图 2)。
表 2　实验各组 SMMC-7721 细胞癌基因和抑癌基因的表达
Table 2　The expression of oncogene and anti-oncogene of
SMMC-7721 cells in experimental groups( x±s)
Group n c-myc/β-actin
c-f os /
β-act in
p53 /
β-act in
p21 /
β-actin
Cont rol 6 0. 41±0. 05 0. 14±0. 03 0. 11±0. 01 0. 16±0. 02
PJ(100
　μg /m L) 6 0. 20±0. 01**0. 12±0. 02 0. 59±0. 03* 0. 33±0. 03*
DMSO
(1. 25%) 6 0. 35±0. 03* 0. 13±0. 01 0. 52±0. 01* 0. 15±0. 02
5-FU(50
　μg /m L) 6 0. 33±0. 04* 0. 10±0. 01 0. 47±0. 04* 0. 17±0. 01
* P <0. 05 , **P <0. 01, vs con trol group
图 2　c-fos、p53 表达 RT-PCR电泳图
Fig. 2　Expression of c-fos and p53(RT-PCR)
Lane A:Con trol group;Lane B:PJ group;Lane C:DMSO g rou p;
Lane D:5-FU group;Lane E:DNA marker
146 肿瘤　2006年 2月 ,第 26卷
3　讨　论
　　在细胞凋亡与肿瘤的研究基础上 ,现代医学研
究证实:许多天然药物可以通过干扰肿瘤细胞生长 、
代谢增殖等过程最终诱导肿瘤细胞发生凋亡 。大量
的临床实践表明 ,单独应用中药或中西医结合治疗
肿瘤疗效确切 ,而诱导肿瘤细胞发生凋亡是其主要
途径之一 。
目前认为某些原癌基因的激活和抑癌基因的失
活 ,可扰乱细胞正常的凋亡调控 ,导致凋亡的异常 ,
从而有助于肿瘤的形成 ,几种癌基因与抑癌基因产
物 ,如 bcl-2 , c-myc , c-fo s , p53 , H-ras 等已证实参
与细胞凋亡的调控。
在本次实验中作者选择临床化疗常用药物 ,即
近年报道较多 、具有诱导肿瘤细胞凋亡的 5-FU 和
在 1. 25%浓度下可诱导白血病细胞分化的 DMSO
作阳性对照 ,通过电镜和流式细胞术 ,从形态和功能
两方面说明珠子参具有诱导人肝癌细胞凋亡的作
用 ,采用 RT-PCR半定量技术 ,分析在人肝癌细胞
中高表达并和细胞凋亡密切相关的 4种基因 c-fo s 、
c-myc 、p53 、p21[ 4 ～ 6] 。实验结果显示:①珠子参能
诱发人肝癌细胞株 SMMC-7721产生典型的凋亡形
态与超微结构变化;②珠子参可使 SMMC-7721 细
胞阻滞在 G 0 /G1 期 ,从而阻止细胞向 S 期转换 ,干
扰细胞周期进程 ,并显著引起细胞凋亡 ,凋亡率达
38. 34%;③珠子参能降低癌基因 c-myc和 c-fo s表
达 ,增高抑癌基因 p53 和 p21 表达;④二甲基亚砜
和 5-FU 对上述各项指标也有部分调整作用 ,但总
体来说不如珠子参明显 。由此看出珠子参能诱导人
肝癌细胞凋亡 ,其部分作用机制可能与使癌细胞出
现 G 0 /G 1 期阻滞 ,降低癌基因 c-myc 和 c-fos表达 ,
增高抑癌基因 p53和 p21表达有关 。
[参 考 文 献]
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[ 收稿日期] 　2004-11-22 [ 修回日期] 　2005-01-25
[ 本文编辑] 　瞿永华
(上接第 143 页)
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[ 收稿日期] 　2005-01-25 [ 修回日期] 　2005-04-25
[ 本文编辑] 　张俊彦
147 第 2期. 陈　涛 ,等. 珠子参体外诱导人肝癌细胞凋亡效应及机制研究