全 文 ：第 21卷　第 6期 　　　　　　　　　　　　　　云南农业大学学报　　　　　　　 Vo l. 21　No.6
2006年　12月 　　　　　　　　　　 Jou rnal o f Yunnan Ag ricu ltural Unive rsity　　　　　 Dec. 2006
　收稿日期:2006 - 03 - 01　
*基金项目:云南省自然科学基金(2003C0062M) 。 　　　　**通讯作者
　作者简介:栾珊珊(1980 -)女 , 山东青岛人 ,在读硕士研究生 , 主要从事保护遗传学研究工作。
栌菊木遗传多样性研究*
栾珊珊 1 ,范眸天2 ,龚　洵 1**
(1. 中国科学院昆明植物研究所 , 云南 昆明 650204;2. 云南农业大学园林园艺学院 , 云南 昆明 650201)
摘要:利用分子标记 ISSR方法 , 从 100个随机引物中选取了 11个对栌菊木 13个自然居群(220个个体)和一个
迁地保护居群(17个个体)的遗传多样性进行了研究 , 结果表明 , 栌菊木的遗传多样性水平并不低 , 其濒危状况
可能主要是由生态因素引起的 ,该研究为对栌菊木制定有效的保护措施提供了科学依据。
关键词:栌菊木;遗传多样性; ISSR
中图分类号:Q 949. 783.5　　文献标识码:A　　文章编号:1004 - 390X(2006)06 - 0703 - 04
Genetic D iversity ofNouelia insingis
LUAN Shan-shan1 , FANM ou-tian2 , GONG Xun1
(1. Kunm ing Institu te o f Bo tany, Ch inese Academ y o f Sc iences, Kunm ing 650204, China;
2. Faculty o f Ho rticulture and Landscape, Y A U, Kunm ing 650201, China)
Abstract:In this study, genetic diversity ofNouelia insign is was detected using ISSR. 13 prime rsw as
selected from 100 random ISSR primers. Based on the results o f this expe riment, itw as eco logical fac-
to rs but no t low gene tic dive rsity that led to the endangered status of th is spec ies. The results of this
study supplied va luable info rmation for the conse rvation o fNouelia insignis.
Key words:Nouelia insingis;genetic diversity;ISSR
　　栌菊木 (Nouelia insign is F ranch)是菊科(A ste r-
aceae)管状花亚科帚菊族 (Mutisieae)的单型属 ,为
国家二级保护植物 ,它是中国特有的珍稀濒危植物
和我国稀有的菊科木本植物 , 分布于北纬 24°～
30°和东经 99°40′～ 103°50′的康滇地区 。栌菊木
是我国滇北和川西海拔 1 000 ～ 2 800m干旱谷地
的特有种[ 1] ,多生长于干热地区的裸露山地 ,耐贫
瘠且生长速度快 ,根系发达 ,在向阳 、湿润的岩石缝
和悬岩峭壁处生长较好 [ 2] ,在干热河谷植物区系
研究以及植物对特殊环境的适应性等研究方面有
极其重要价值。对栌菊木的遗传多样性研究仅见
于彭玉兰[ 3]对其云南地区 10居群进行进等位酶研
究 。等位酶技术因为只能检测到编码蛋白的基因
而导致对遗传多样性水平的低估 ,而且其取样未能
覆盖栌菊木现有的分布范围 ,特别是缺乏其分布区
边缘的居群 ,具有一定程度的不合理性。
近几十年来 ,由于生境片段化和人为的直接破
坏 ,栌菊木的个体数量急剧减少 ,濒危状况日益严
重。根据野外实地考察 ,目前栌菊木的大多数居群
个体数量都不超过 50,而所有现在居群个体总量
也不过 5 000,鉴于栌菊木受到严重威胁的现状及
其作为特有的单型属植物而具有的独特性 ,对其实
行切实有效的保护已经刻不容缓。
本文利用分子标记 ISSR方法选取了 13个具
有代表性的居群进行了遗传多样性研究 。
1　材料与方法
1. 1　材料
本研究所选用的 13个居群中 10个来自云南 ,
其余 3个取自四川 (攀枝花 、米易 、德昌 ),具体位
DOI牶牨牥牣牨牰牪牨牨牤j牣issn牣牨牥牥牬牠牫牴牥x牗n牘牣牪牥牥牰牣牥牰牣牥牥牨
置及每个居群的取样数见表 1。这 13个居群在地
理位置上明显地分为两个区域 ,即金沙江流域和南
盘江流域(包括华宁 、弥勒 、江川 3个居群)。从所
采用的 220个个体植株上分别选取 2 ～ 3个新鲜叶
片 ,用硅胶干燥后保存于 4℃直至提取 DNA。另有
昆明植物园迁地保护居群一个 ,处理方法同上 。
1. 2　DNA提取和 PCR扩增
将干燥叶片在液氮中研磨成粉末后 , 利用
CTAB法 [ 4] 提取总 DNA。 PCR扩增条件:(1)20
μL反应体系中包括 , 20 ng模板 DNA , 2.0 μL 10
×PCR buffer, 2. 2mmo lM gC l2 , 0. 12mmo l dNTPs,
3%甲酰胺 , 400 nmol的 ISSR引物 (来自哥伦比亚
大学设计的 100个引物 ), 0.5单位的 Taq酶
(Takara),其余部分为双蒸水 。 (2) PCR扩增程序
为:首先 94℃ 5m in, 然后按如下条件进行 38个循
环:94℃变性 30 s, 53℃退火 1.5m in, 72℃延伸 1
m in,最后在 72℃延伸 7 m in。 (3)电泳条件:取
PCR产物 8μL在 1.5%的琼脂糖凝胶上点样 ,在 1
×TBE缓冲液及 4 V /cm 电压条件下电泳后于
0.5%EB中浸泡 30m in,照像 。
1. 3　数据分析
居群遗传变异以利用 Popgene v. 1. 31[ 5]软件
得出的以下参数来衡量 , 即 PPB(多态位点百分
数 ), A(等位基因平均数 ), A e(有效等位基因数)
及 He(期望杂合度 )等 。居群间的遗传分化采用
N ei基因分化系数 G st来度量 。
2　结果
从哥伦比亚大学提供的 100个 ISSR引物中筛
选出 11个(表 2)能产生清晰 、可重复性条带者 ,扩
增得 103条带 。用 popgene软件分析结果为在物
种水平上栌菊木的多态位点为 65.05%,总的种群
遗传变异度 Ht=0.198 4(0.039 5),种群内的平均
杂合度 Hs=0.147(0.023 5)遗传多样性水平不是
很低 ,即遗传多样性水平不是造成其濒危的原因。
遗传分化系数 Gst为 0.257 1 基因流 Nm 值为
0.722 2。用 AMOVA 分析得 Фst值为 0.223, 与
Popgene分析结果的 Gst值非常接近。
对金沙江和南盘江两个流域分别进行分析得:
金沙江流域遗传多样性明显高于南盘江流域。两
个流域的多态位点百分数分别为 62.14%和
46.60%, 有效等位基因数 Ne 分别为 1.393 7
(0.382 8)和 1.322 8(0.389 7),但两个流域之间的
遗传分化系数 Gst值仅为 0. 071 2,且基因流值较
大(3. 313 0)。
3　讨论
3. 1　遗传多样性和遗传分化
HAMR IK
[ 6] ,肖龙骞 [ 7]等总结了 662种植物的
遗传多样性和遗传分化所得平均值为:PPB =
71. 1%, A =2. 38, He=0. 169 , Gst=0. 228。本研究
所得的以上参数分别为 PPB =65. 05 , A =1. 65, He
=0. 224 8, Gst =0. 257 1,二者差别不是很大 。这
表明 ,栌菊木的濒危并不因其过低的遗传多样性造
成的 ,生境的破碎和片段化以及人为的直接干扰可
能才是导致其濒危的直接原因 。
金沙江和南盘江两个流域之间的遗传分化系
数 Gst为 0. 071 2,基因流值 Nm 为 3. 313 0。鉴于
两个流域较远的地理距离及山脉河流等形成的天
然屏障 ,二者的居群之间在现代要发生大的基因流
是不太可能的 。WR IGHT[ 8]认为群体间的基因流
值若小于 1,有限的基因流是促使群体发生遗传分
化的主要原因。如果选择压力(生态气候 、生长环
境等 )很大 ,即使 Nm 值大于 1也不能代表群体间
发生了基因流 。Nm 值大于 1可能代表过去的基
因流而不能反映现在的实际基因交换情况 [ 9] 。由
此 ,金沙江和南盘江两个流域的遗传分化不明显很
可能是由于栌菊木在冰期过后由一个其避难所向
另一个流域扩散时 ,建立者个体数目足够多 ,携带
了足够多的遗传异质性 ,而扩散后隔离时间又不够
长 ,以至于两个流域间没有产生明显的遗传分化。
3. 2　对制定保护策略的建议
栌菊木目前十多个自然居群的个体数大都少于
50。 FRANKEL[ 10]等指出 ,有效居群个体达到 500个
时才能中以维持居群内数量性状的遗传变异和居群
对未来环境变化的适应能力。对植物园迁地保护居
群用同样方法检测得其多态性带有 38条 ,多态位点
百分数为 36. 89%,未能覆盖足够多的遗传多样性 ,
且个体数太少 ,不能满足有效种群大小。另外 ,该迁
地保护居群的生活力用生长势明显降低 ,不能满足
保护该物种长期生存和演化的要求。
因此 ,考虑到对栌菊木的保护策略 ,应当优先
704 云南农业大学学报 　　　　　　　　　　　　　　第 21卷
采取就地保护的办法来保存现存的居群 ,根据本研
究所得出的结果 ,金沙江流域总体的遗传多样性比
南盘江流域高 ,如多态位点百分数前者为 62. 14%,
后者仅 46. 60%, 前者的有效等位基因数 N e为
1. 393 7(0. 382 8)而后者为 1. 322 8(0. 389 7)。并
且二者遗传多样性的差异仅表现多态带的频率 ,而
不是特征带的有无 ,因此 ,金沙江流域的居群可以
完全覆盖南盘江流域各居群的遗传多样性 。
实行就地保护 ,首先要解除该物种所面临的确
定性威胁 ,如生境片段化和人为直接破坏等。选取
合适的地点对加强对特定居群的保护 ,尤其是个体
数较多且更新能力较强的居群 ,例如现存的永胜居
群 ,是目前仅有的一个个体数量超过 1 000的居
群 ,且有大量幼苗 ,是实行就地保护最理想的居群。 表 1　栌菊木各居群来源
Tab. 1　Popu la tions ofNouelia insignis
exam ined in the ISSR ana ly sis
code popula tion samp le size latitude (N) long itude (E)
LS L iangshan 17 25°46′ 101°50′
DY Dayao 17 25°51′ 101°06′
PZH Panzhihua 17 26°24′ 101°46′
HP Huaping 17 26°35′ 101°21′
YS Yong sheng 17 26°34′ 100°48′
HTX Hu tiaoxia 17 27°19′ 100°08′
NL N ing lang 17 27°21′ 100°51′
BC Bingchuan 17 25°50′ 100°36′
MY M iy i 17 26°54′ 102°13′
DC Dechang 17 27°38′ 102°17′
JC Jiangchuan 16 24°21′ 102°43′
ML M ile 17 24°41′ 103°40′
HN Huaning 17 24°17′ 102°51′
表 2　引物及其序列
Tab. 2　L ist o f ISSR prim e rs andthe ir sequences used in th is study
p rim er code nu cleotide sequen ce 5′to 3′ No. of analyzed bands No. of po lym orph ic bands
807 AGAGAGAGAGAGAGT 11 7
811 GAGAGAGAGAGAGAGAC 9 7
822 TCTCTCTCTCTCTCTCA 6 3
827 ACACACACACACACACG 13 10
840 GAGAGAGAGAGAGAGA(CT)T 11 8
855 ACACACACACACACAC(CT)T 9 7
856 ACACACACACACACAC(CT)A 10 6
857 ACACACACACACACAC(CT)G 9 6
881 GGGTGGGGTGGGAGA 10 8
889 (AGT)(CGT)(AGT)ACACACACACACAC 7 3
890 (ACG)(ACT)(ACG)GTGTGTGTGTGGT 8 2
total 103 67
705第 6期　　　　　　　　　　　　栾珊珊 ,等:栌菊木的遗传多样性研究
表 3　栌菊木遗传一致性与遗传距离分析
Tab. 3　Nei′s[ 10] pairw ise gene tic identity (above diagona l) and
gene tic distance (be low diagona l) be tw eenNouelia in signis popula tions
pop ID　YM DY PZH HP YS HTX NL BC MY DC JC ML HN
YM **** 0. 952 4 0. 945 8 0. 943 7 0. 935 6 0. 924 6 0. 9357 0. 936 7 0. 9514 0. 930 3 0. 9327 0. 924 5 0. 912 5
DY 0. 048 8 **** 0. 954 0 0. 945 8 0. 936 3 0. 940 2 0. 9519 0. 952 4 0. 9554 0. 941 8 0. 9415 0. 944 3 0. 923 3
PZH 0. 055 7 0. 047 1 **** 0. 970 3 0. 960 8 0. 959 2 0. 9487 0. 946 7 0. 9586 0. 948 2 0. 9467 0. 920 0 0. 911 8
HP 0. 057 9 0. 055 8 0. 030 2 **** 0. 962 4 0. 968 4 0. 9459 0. 943 0 0. 9469 0. 935 2 0. 9474 0. 919 7 0. 896 2
YS 0. 066 6 0. 065 8 0. 040 0 0. 038 3 **** 0. 961 1 0. 9576 0. 935 8 0. 9447 0. 936 1 0. 944 0. 901 3 0. 900 7
HTX 0. 078 4 0. 061 6 0. 041 7 0. 032 1 0. 039 7 **** 0. 9444 0. 945 7 0. 9363 0. 942 0 0. 9287 0. 899 5 0. 891 8
NL 0. 066 5 0. 049 3 0. 052 7 0. 055 7 0. 043 3 0. 057 2 **** 0. 947 9 0. 9563 0. 962 7 0. 9603 0. 939 7 0. 942 8
BC 0. 065 4 0. 048 8 0. 054 8 0. 058 6 0. 066 4 0. 055 8 0. 0535 **** 0. 9746 0. 959 8 0. 9449 0. 922 5 0. 930 1
MY 0. 049 8 0. 045 6 0. 042 3 0. 054 6 0. 056 9 0. 065 9 0. 0447 0. 025 7 **** 0. 974 0 0. 9612 0. 929 1 0. 933 6
DC 0. 072 3 0. 060 0 0. 053 2 0. 067 0 0. 066 1 0. 059 7 0. 0380 0. 041 0 0. 0264 **** 0. 9398 0. 911 0 0. 922 7
JC 0. 069 7 0. 060 3 0. 054 8 0. 054 1 0. 057 3 0. 073 9 0. 0406 0. 056 6 0. 0395 0. 062 1 **** 0. 958 7 0. 953 1
M L 0. 078 5 0. 057 3 0. 083 4 0. 083 7 0. 103 9 0. 105 9 0. 0622 0. 080 7 0. 0736 0. 093 2 0. 0422 **** 0. 948 3
HN 0. 091 6 0. 079 8 0. 092 4 0. 109 6 0. 104 5 0. 114 5 0. 0589 0. 072 4 0. 0687 0. 080 4 0. 0480 0. 053 1 ****
表 4　栌菊木各个居群的 ISSR分析结果
Tab. 4　Genetic va riab ility w ithin popu lations o f
Nouelia insignis revea led by ISSR ana ly sis
population P He Ho
LS 41. 75 0. 182 0(0. 219 5) 0. 261 4(0. 313 0)
DY 32. 04 0. 126 5(0. 197 5) 0. 184 2(0. 282 4)
PZH 39. 81 0. 165 9(0. 212 4) 0. 240 2(0. 303 6)
HP 41. 75 0. 177 1(0. 217 4) 0. 255 4(0. 309 6)
YS 34. 95 0. 141 9(0. 204 5) 0. 206 2(0. 292 0)
HTX 39. 81 0. 165 8(0. 220 0) 0. 237 7(0. 310 2)
NL 31. 07 0. 135 2(0. 206 5) 0. 194 0(0. 293 8)
BC 34. 95 0. 148 8(0. 208 3) 0. 214 8(0. 298 0)
MY 33. 01 0. 140 5(0. 205 0) 0. 202 9(0. 293 7)
DC 32. 04 0. 131 1(0. 201 5) 0. 189 9(0. 285 7)
JC 37. 86 0. 165 0(0. 217 4) 0. 236 7(0. 308 9)
M L 34. 95 0. 132 8(0. 194 8) 0. 195 7(0. 280 8)
HN 33. 01 0. 126 0(0. 191 2) 0. 185 7(0. 276 7)
mean
( s. d. )
35. 92
(8. 74) 0. 149 1(0. 056 0) 0. 215 8(0. 185 7)
　　N = the sam ple size;P = the percen tage of polym o rghic
loci;
He=the expected hete rozygosity;Ho=the Shannon’ s d i-
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