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云南鬼灯檠属植物中岩白菜素含量比较



全 文 :云南鬼灯檠属植物中岩白菜素含量比较
陈 雯1,孟珍贵1,杨生超1* ,陈建斌2,李龙根1,李萍萍1,李晓波1 ( 1.云南农业大学农学与生物技术学院云南省中药材
规范化种植技术指导中心,云南昆明 650201; 2.国家农科专业基础实验教学示范中心,云南昆明 650201)
摘要 [目的]比较云南鬼灯檠属植物不同种及产地样本的岩白菜素含量。[方法]采用 HPLC测定云南鬼灯檠属植物不同种及产地样
本的岩白菜素含量。色谱柱为 Agilent Zorbax XDB-C18柱( 4. 6 mm ×150 mm,5 μm) ,流动相为乙腈( A) -0. 2%磷酸水溶液( B)梯度洗脱
( 0 ~10 min,0% ~20%A,100% ~80%B) ,流速为 1. 0 ml /min,柱温为 30 ℃,进样量为 10 μl,检测波长 275 nm。[结果]岩白菜素在 3 ~
48 μg /ml之间与吸光度值呈良好的线性关系,相关系数为 0. 999 6。4个种及变种的鬼灯檠属植物样本岩白菜素含量以西南鬼灯檠平均
含量最高为 5. 59%,七叶鬼灯檠平均含量最低为 3. 45%。[结论]鬼灯檠属植物不同种之间岩白菜素含量不同,同种不同居群之间的岩
白菜素含量变化也明显。
关键词 鬼灯檠属( Rodgersia) ; HPLC;岩白菜素;西南鬼灯檠( Rodgersia sambucifolia Hemsl. ) ;羽叶鬼灯檠( Rodgersia pinnata Franch. ) ;
七叶鬼灯檠( Rodgersia aesculifolia Batalin) ;光腹鬼灯檠( Rodgersia sambucifolia Hemsl. var. estrigosa J. T. Pan)
中图分类号 S567. 23 文献标识码 A 文章编号 0517 -6611( 2011) 10 -05767 -03
Content Comparison of Bergenin in Yunnan Genus Rodgersia
CHEN Wen et al ( Yunnan Provincial Center of Chinese Medicinal Materials GAP Technology,College of Agronomy and Biotechnology,Yun-
nan Agricultural University,Kunming,Yunan 650201)
Abstract [Objective]To compare the content of bergenin in the Yunnan genus Rodgersia with different species and growing areas. [Method]
The content of bergenin in the Yunnan genus Rodgersia with different species and growing areas was determined by HPIC. The chromatographic
conditions were as follows: column of Agilent Zorbax XDB - C18 ( 4. 6 mm ×150 mm,5 μm) ,mobile phase of acetonitrile( A) and 0. 02% phos-
phoric acid solution( B) ,gradient elution( 0 -10 min,0% -20%A,100% -80%B) ,flow rate of 1ml /min,column temperature of 30 ℃,sam-
pling volume of 10 μl and detection wavelength of 275 nm. [Result]Bergenin showed a good linear relationship with absorbance in the range of
3 to 48 μg /ml ( r =0. 999 6) . Bergenin content was the highest in Rodgersia sambucifolia Hemsl. with 5. 59%,and the lowest in Rodgersia aes-
culifolia Batalin with 3. 45% . [Conclusion]Bergenin content in the genus Rodgersia was various in different species,and there were obvious
differences among different populations from the same species.
Key words Rodgersia; HPLC; Bergenin; Rodgersia sambucifolia Hemsl. ; Rodgersia pinnata Franch. ; Rodgersia aesculifolia Batalin; Rodger-
sia sambucifolia Hemsl. var. estrigosa J. T. Pan
基金项目 云南省科技厅重点产业创新工程( 2008IF004) 。
作者简介 陈雯( 1984 - ) ,女,山东东营人,在读硕士,研究方向:植物
资源利用及评价,E-mail: chenwende1984@ 163. com。* 通讯
作者,教授,博士,硕士生导师,从事药用植物资源及规范化
种植要求,E-mail: shengchaoyang @ 163. com。
收稿日期 2011-01-17
鬼灯檠属( Rodgersia) 包括鬼灯檠( Rodgersia podophylla
A. Gray) 、七叶鬼灯檠( Rodgersia aesculifolia Batalin) 及其变
种滇西鬼灯檠 ( Rodgersia aesculifolia Batalin var. henricii
( Franch. ) C. Y. Wu) 、西南鬼灯檠 ( Rodgersia sambucifolia
Hemsl. ) 及其变种光腹鬼灯檠( Rodgersia sambucifolia Hemsl.
var. estrigosa J. T. Pan ) 、羽叶鬼灯檠 ( Rodgersia pinnata
Franch. ) 及其变种伏毛鬼灯檠 ( Rodgersia pinnata Franch.
var. strigosa J. T. Pan ) 、尼泊尔鬼灯檠 ( Rodgersia nepalen-
sis) [1],为虎耳草科( Saxifragaceae) 多年生草本植物,我国原
产 4种 3变种[1],主要分布于云南、贵州、四川、陕西、东北等
地。基源为西南鬼灯檠和羽叶鬼灯檠的药材被称为岩陀,具
有解热、祛风和收敛等功效,可用于治疗感冒头痛、肠炎、菌
痢和外伤出血[2]。鬼灯檠属是岩白菜素药源植物属中岩白
菜素含量较高的属之一[3],因此可作为提取岩白菜素的原
料,仅云南省采收量就超过 3 000 t /a。在现有研究鬼灯檠属
植物中,不同种的岩白菜素含量也不同。在七叶鬼灯檠植株
中,岩白菜素含量最高的部位是根状茎,其次是叶片,在茎枝
中的含量是最低的。不同的采收期岩白菜素含量的变化规
律是从 5月份到 11月份从高到低再度升高的规律 [4]。羽叶
鬼灯檠、西南鬼灯檠的岩白菜素含量相近,七叶鬼灯檠含量
最低[5]。目前没有对所研究的鬼灯檠的种进行准确的划分,
笔者对鬼灯檠属在云南省境内的西南鬼灯檠、羽叶鬼灯檠、
七叶鬼灯檠、光腹鬼灯檠 4 个种及其变种进行了准确的鉴
定,并选取多个具代表产地的居群进行岩白菜素含量的研
究,评价不同种之间岩白菜素含量差异,并进一步比较了同
种不同产地岩白菜素含量的变化。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 研究对象。云南地区鬼灯檠属野生药用植物,分别
是西南鬼灯檠( 采自嵩明、禄劝、富民、会泽、罗平、玉龙、永
胜) ,羽叶鬼灯檠( 采自兰坪金顶、大理、鹤庆、洱源) ,光腹鬼
灯檠( 采自宁蒗、兰坪中排) ,七叶鬼灯檠( 采自富源、泸水)
共 15个居群 350株,经云南农业大学中药材与植物科学系
郭凤根教授鉴定,样本详细资料见表 1。
1. 1. 2 主要试剂。岩白菜素对照品 ( 批号: 477-90-7) 由中国
药品生物制品检定所提供;甲醇和乙腈为色谱纯,由德国默克
公司生产;磷酸和乙醇为市售分析纯;试验用水为超纯水。
1. 1. 3 主要仪器。Agilent1200型高效液相色谱仪,由美国 Ag-
ilent公司生产,配有在线脱气机、四元泵、柱温箱、VWD 检测
器; FW80高速万能粉碎机,由北京中兴伟业仪器有限公司生
产; SB-5200DTS超声波清洗机,由宁波新芝生物科技股份有限
公司生产; 超纯水器; AL104电子天平(精确至 0. 001 g) ,由梅
特勒 -托利多仪器(上海)有限责任公司生产; BSA124S电子天
平(精确至 0. 000 1 g) ,由赛多利斯科学仪器生产。
1. 2 方法
1. 2. 1 色谱条件选择。
1. 2. 1. 1 流动相。分别选择纯水、纯水 - 0. 2%磷酸水溶
液、甲醇 -0. 2%磷酸水溶液和乙腈 - 0. 2%磷酸水溶液作为
安徽农业科学,Journal of Anhui Agri. Sci. 2011,39( 10) : 5767 - 5769,5772 责任编辑 侯美灵 责任校对 况玲玲
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2011.10.119
流动相,用于分离岩白菜素,比较试验效果。
1. 2. 1. 2 洗脱条件。分别采用对比梯度洗脱和等度洗脱来
分离岩白菜素,比较试验效果。
1. 2. 2 标准溶液的配制。精密称取适量的岩白菜素对照
品,以 80%甲醇,分别配制成 48、24、12、6 和 3 μg /ml溶液。
1. 2. 3 样品溶液的配制。15个居群共 350株供试样品阴干
后,置于烘箱中,于 60 ℃烘干至恒重,然后用粉碎机粉碎,过
40 目筛。分别精密称取过0. 1 mg粉末置于25 ml容量瓶,加
入 25 ml 已配好的 80%甲醇溶液,超声波提取 50 min后,再
离心 10 min。取上清液,经 0. 45 μm微孔滤膜过滤,所得滤
液即为样品溶液。
1. 2. 4 提取工艺的优化。
1. 2. 4. 1 提取溶剂及浓度的选择。将同一样品称取 0. 1 g
分别溶于 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95% 和 100%的
甲醇溶液和乙醇溶液中,定容到 25 ml,用 HPLC法检测岩白
菜素的含量,从而确定适宜的提取溶剂及浓度。
表 1 采集的鬼灯檠属的种类及产地
Table 1 The species and growing areas of the collected genus Rodgersia
种及变种
Species and varietes
考察与采集地点
Collection site
居群代码
Population No.
北纬( N°)
Northren Latitude
东经( E°)
East longitude
海拔∥m
Elevation
西南鬼灯繁 会泽县金钟镇金钟山 HZ 27°21 34″ 104°4040″ 2 405
Rodgersia sambucifolia 禄劝县撒营盘镇一叫凹 SL 25°5926″ 103°3726″ 1 898
Hemsl. 罗平县九龙镇六白大山 LP 25°1806″ 104°2758″ 1 828
永胜县南华乡老巢山 YS 25°58 24″ 104°3804″ 2 323
玉龙县黄山镇文笔山 YL 27°14 24″ 100°3506″ 1 915
嵩明县嵩阳镇小团山 SM 25°5646″ 103°0600″ 2 405
富民县永定镇大风丫口 FM 26°0026″ 100°3128″ 3 030
大理苍山 LJ 25°4834″ 100°5419″ 3 152
羽叶鬼灯檠 鹤庆县草海镇马厂 MC 26°55 52″ 100°3232″ 3 231
Rodgersia pinnata Franch. 兰坪县金顶镇哑巴箐 JD 26°5528″ 100°3156″ 3 208
大理市观音堂感通山 DL 26°0014″ 100°3152″ 3 048
洱源三营乡东山 EY 26°2116″ 100°1048″ 2 830
七叶鬼灯檠 富源县大河镇圭山 FY 26°01 18″ 104°3810″ 2 328
Rodgersia aesculifolia Batalin 泸水县老窝乡自奔山 LW 25°0258″ 99°3144″ 2 884
光腹鬼灯檠 宁蒗县大兴镇观音庙 NL 26°54 22″ 101°2916″ 2 334
Rodgersia sambucifolia 兰坪县中排乡元宝山 ZP 27°3138″ 100°1410″ 2 828
Hemsl. var. estrigosa J. T. Pan
1. 2. 4. 2 提取时间的选择。将同一样品称取 0. 1 g置于 25
ml容量瓶,加入 25 ml 已配好的 80%甲醇溶液,配置成样品
溶液,之后超声波提取参照蔡正军的超声提取鬼灯檠中岩白
菜素的最佳工艺研究方法[5],设置 10、20、30、40、50 和 60
min,6个提取时间,用 HPLC法检测岩白菜素的含量,从而确
定适宜的提取时间。
1. 2. 5 方法学考察。
1. 2. 5. 1 线性关系考察。分别将已配置好的 3、6、12、24 和
48 μg /ml的对照品储备液按照注入高效液相色谱仪中,按
“2. 1”的色谱条件测定峰面积积分值。以进样溶液岩白菜素
浓度( x) 为横坐标,色谱峰面积( y) 为纵坐标,绘制标准曲
线,并进行回归分析。
1. 2. 5. 2 精密度试验。精密吸取 10 μl 岩白菜素对照品溶
液( 48 μg /ml) ,按“2. 1”的色谱条件连续进样 5次,计算峰面
积的相对标准偏差( RSD) ,以评价仪器的精密度。
1. 2. 5. 3 重复性试验。精密称取同一批样品粉末约 0. 1
mg,共 5份,按“1. 2. 3”的方法制备供试品溶液,按“2. 1”的色
谱条件进样 10 μl,计算峰面积的 RSD 值,以评价方法的重
现性。
1. 2. 5. 4 稳定性试验。精密称取同一批样品粉末约 0. 1 g,
按“1. 2. 3”的方法制备供试品溶液,按“2. 1”的色谱条件,分
别于 0、2、4、6、8 h进样 10 μl,计算峰面积的 RSD值,以评价
供试品溶液的稳定性。
1. 2. 5. 5 回收率试验。精密称取已知含量的同一批样品粉
末约 0. 1 g,制备后平行取 5份,分别添加 1 ml不同浓度的岩
白菜素对照品溶液[6 -8]( 48、24、12、6和 3 μg /ml) ,按“1. 2. 3”
的方法制备样品溶液,按“2. 1”的色谱条件进样,计算回收率
和 RSD值。
1. 2. 6 鬼灯檠属不同种和变种及其居群的岩白菜素含量比
较。准确吸取 10 μl供试样品,按“2. 1”的色谱条件进样,测
定峰面积,然后根据建立的线性回归方程,计算岩白菜素的
含量。在每个居群随机取 6个样,计算每个样中岩白菜素含
量,然后根据所得 6个样的值计算每个居群的岩白菜素的平
均含量,最后将相同种的居群的岩白菜素含量取平均值得出
每个种的岩白菜素的含量。
2 结果与分析
2. 1 色谱条件的确定 流动相选择试验结果发现以乙腈 -
0. 2%磷酸水溶液为流动相时,岩白菜素分离的最好,图中峰
形和对称度都比较好。因此采用乙腈 - 0. 2%磷酸水溶液作
为流动相。洗脱试验结果发现梯度洗脱时岩白菜素的峰分
离的彻底,没有出现拖峰现象。因此采用梯度洗脱用于分离
岩白菜素。故色谱条件定为: Agilent ZORBAXXDB-C18柱
( 150 mm ×4. 6 mm,5 μm) ;流动相为乙腈( A) - 0. 2%磷酸
水溶液( B) 梯度洗脱 ( 0 ~ 10 min,0% ~ 20%A,100% ~ 80%
B) ;流速为 1. 0 ml /min; 柱温为室温 ( 30 ℃ ) ,进样量为 10
μl;检测波长为 275 nm。
2. 2 对照品和供试品溶液的色谱分析结果 对照品和供试
品溶液的色谱图见图 1。由图 1可知,在设定的色谱条件下,
对照品和供试品溶液能达到基线分离,效果较好。
8675 安徽农业科学 2011 年
图 1 岩白菜素对照品溶液( A) 和样品溶液( B)色谱图
Fig. 1 Bergenin chromatograms of reference solution ( A) and sample solution ( B)
2. 3 提取工艺的优化
2. 3. 1 提取溶剂及浓度的选择。结果表明在溶剂为 80%的
甲醇时,测得相同样品中岩白菜素含量最高,确认提取溶剂
为 80%甲醇最适。
2. 3. 2 提取时间的选择。结果表明相同样品的岩白菜素溶
解度在提取时间为10 ~50 min为逐渐上升趋势,50 min到60
min呈下降趋势,因此选取 50 min为超声提取最佳时间。
2. 4 方法学考察结果
2. 4. 1 线性关系考察。由图 1可知,以色谱峰面积( y) 对进
样液岩白菜素浓度( x) 绘制标准曲线,经线性回归,得回归方
程为: y =7. 218 7x +16. 043 6,r =0. 999 6,表明岩白菜素在 3
~48 μg /ml呈良好线性关系。
2. 4. 2 精密度试验。测得峰面积积分植的 RSD 为 1. 27%
( n =5) ,表明仪器精密度良好。
2. 4. 3 重复性试验。测得岩白菜素的峰面积积分植的 RSD
值为 1. 13% ( n =5) ,表明方法的重现性好。
2. 4. 4 稳定性试验。测定岩白菜素的峰面积积分植的 RSD
值为 1. 83% ( n =5) ,表明样品溶液在 12 h内稳定。
2. 4. 5 回收率试验。由表 2 可知,岩白菜素的平均回收率
为 96. 16%,RSD值为 1. 64% ( n =5) 。
表 2 加样回收率试验结果( n =6)
Table 2 Results of recovery test( n =6)
试验号
Test No.
样品含量∥μg
Content of
sample
对照品含量∥μg
Content of refer-
ence solution
测得量∥μg
Measured
content
回收率∥%
Recovery
平均回收率∥%
Average
recovery
RSD∥%
1 53. 232 48 99. 326 0. 960
2 53. 232 24 76. 429 0. 966
3 53. 232 12 64. 546 0. 943 96. 16 1. 64
4 53. 232 6 58. 952 0. 953
5 53. 232 3 56. 187 0. 985
表 3 不同居群鬼灯檠属植物岩白菜素的含量比较
Table 3 Content comparison of bergenin in the genus Rodgersia with
different population
居群编号
Population
No.
种及变种
Species and
varietas
采集地点
Collection site
岩白菜素
平均含量∥%
Average content of
bergenin
HZ 西南鬼灯檠 会泽县金钟镇金钟山 5. 37 ±0. 31
SL 西南鬼灯檠 禄劝县撒营盘镇一叫凹 6. 22 ±0. 47
LP 西南鬼灯檠 罗平县九龙镇六白大山 4. 95 ±0. 22
YS 西南鬼灯檠 永胜县南华乡老巢山 5. 52 ±0. 28
YL 西南鬼灯檠 玉龙县黄山镇文笔山 4. 73 ±0. 28
SM 西南鬼灯檠 嵩明县嵩阳镇小团山 5. 63 ±0. 52
FM 西南鬼灯檠 富民县永定镇大风丫口 6. 61 ±0. 41
LJ 西南鬼灯檠 大理苍山 5. 62 ±0. 51
MC 羽叶鬼灯檠 鹤庆县草海镇马厂 5. 30 ±0. 14
JD 羽叶鬼灯檠 兰坪县金顶镇哑巴箐 3. 02 ±0. 28
DL 羽叶鬼灯檠 大理市观音堂感通山 3. 57 ±0. 27
EY 羽叶鬼灯檠 洱源三营乡东山 2. 97 ±0. 25
FY 七叶鬼灯檠 富源县大河镇圭山 5. 39 ±0. 22
LW 七叶鬼灯檠 泸水县老窝乡自奔山 1. 53 ±0. 06
NL 光腹鬼灯檠 宁蒗县大兴镇观音庙 4. 79 ±0. 31
ZP 光腹鬼灯檠 兰坪县中排乡元宝山 4. 22 ±0. 22
2. 5 鬼灯檠属不同种和变种及其居群的岩白菜素含量比
较 由表 3可知,不同种鬼灯檠属植物中岩白菜素含量变化
在 1. 31% ~ 7. 92%之间,平均值为 4. 71%,CV 值为40. 8%,
其中西南鬼灯檠岩白菜素平均含量 5. 59%,其变种光腹鬼灯
檠为 4. 51%,均高于羽叶鬼灯檠和七叶鬼灯檠岩白菜素的平
均含量。由表 3 可知,西南鬼灯檠的岩白菜素含量普遍较
高,差异较小。其中产于富民和禄劝的西南鬼灯檠中岩白菜
素含量最高,平均含量均高于 6%。而羽叶鬼灯檠和七叶鬼
灯檠中的岩白菜素平均含量分别为 3. 71% 和 3. 45%,泸水
的七叶鬼灯檠的岩白菜素平均含量最小。
3 结论与讨论
在该色谱条件优化试验中用超声波提取法提取时发现
岩白菜素的测定值随提取时间的延长呈现先上升后下降的
趋势,表明提取时间过长可能破环岩白菜素。而此前研究
中,对提取优化的条件设置的不全面,没有将甲醇浓度与提
取时间等进行正交试验,所筛选的提取条件欠准确。
云南地区西南鬼灯檠 8 个居群,羽叶鬼灯檠 4 个居群,
七叶鬼灯檠和光腹鬼灯檠各 2 个居群的样本岩白菜素含量
测定结果表明不同种鬼灯檠属植物中岩白菜素含量变化在
1. 31% ~7. 92%之间,平均值为 4. 71%,变异系数为14. 1% ;
西南鬼灯檠 8个居群的岩白菜素平均含量 5. 59%,其变种光
(下转第 5772页)
967539卷 10期 陈 雯等 云南鬼灯檠属植物中岩白菜素含量比较
从峰数目看,1年生 >3、5年生的药材,特别是皂苷成分中 80
min左右的峰显著大于其他年限,10 ~ 30 min的峰数明显多
于其他年限;从参比物峰面积来看,5年生 >3年生 > 1年生,
其他组分变化不大。
图 4 3年生金铁锁多组分指纹性 HPLC图
Fig. 4 HPLC finger-print of three-year RADIX PSAM-
MOSILENES
图 5 5年生金铁锁多组分指纹性 HPLC
Fig. 5 HPLC finger-print of five-year RADIX PSAM-
MOSILENES
3 结论与讨论
3. 1 结论 该研究建立了 3 个年限金铁锁药材 HPLC多组
分指纹性图谱,为金铁锁药材 3个年限的鉴别提供了可靠的
根据。从图谱中可以看出,金铁锁药材中的 3 组峰,随着生
长周期的不同有所不同,从峰数目看,1 年生大于 3、5 年生,
特别是皂苷成分中 80 min左右的峰显著大于其他年限,10 ~
30 min的峰数明显多于其他年限;从参比物峰面积来看,5年
生大于 3年生 >1年生,其他组分变化不大。
3. 2 讨论
( 1) 该研究建立了金铁锁的 HPLC 多组分图谱,通过对
峰数目保留时间和峰面积大小的直观比较来评价中药内在
质量,结果表明,通过中药材多组分图谱的分析,在有大类成
分的基础上,可以较全面地反映中药材的品质,而且多组分
共同控制内在质量,具有整体性,较为符合中药成分复杂的
特点。
( 2) 试验中,根据最佳色谱条件获得 3 个年限金铁锁药
材多组分指纹性图谱,建立了金铁锁药材的 3个年限的多组
分指纹性方法,方法简单、重现性好,为金铁锁的鉴别和质量
控制提供了全面、合理和科学的依据。
( 3) 该试验的方法中,供试品溶液制备及其参比物的分
离方法较为复杂,操作上应注意规范一致,特别是除杂步骤
应注意统一柱子规格( 20. 0 cm ×1. 5 cm) 。
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200 -203.
(上接第 5769 页)
腹鬼灯檠为 4. 51%,均高于羽叶鬼灯檠( 3. 71% ) 和七叶鬼灯
檠( 3. 45% ) 的岩白菜素含量。这与段新瑜等[5]研究结果相
近,可作为驯化栽培的主要基源植物。从单一的岩白菜素含
量看,羽叶鬼灯檠与非基源植物光腹鬼灯檠和七叶鬼灯檠相
比,岩白菜素含量并不突出。这些种均具有相当的岩白菜素
含量,这也是民间把这些种不加区分的作为岩陀药材使用和
销售的原因。
不同产地的同种鬼灯檠属植物岩白菜素含量差异较大,
云南地区西南鬼灯檠 8 个居群的岩白菜素含量变化在
4. 73% ~6. 61%间,变异系数为 33. 6%,居群间差异大,与产
地关系密切,这可能是由于地理差异导致居群遗传分化的原
因所致。富民、禄劝、嵩明、大理等地的居群岩白菜素含量较
高,这也是野生西南鬼灯檠采集较多的地区。鉴于西南鬼灯
檠野生资源日益减少的实际,在未来西南鬼灯檠驯化栽培过
程中,可把这些地区居群作为候选优质种源加以利用。羽叶
鬼灯檠和七叶鬼灯檠居群间的岩白菜素含量也存在较大差
异,光腹鬼灯檠则差异较小,但均因居群数量相对较少,尚有
待于进一步的研究证实。
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2775 安徽农业科学 2011 年