全 文 ：云 南 中 医 中 药 杂 志
* 基金项目:农业科技成果转化资金项目———濒危贵重中药材珠子参新品种良种繁育及种植示范(NO:2012 GB2F300415)
作者简介:徐怡(1984 －)，女，工程师，主要从事中药质量标准研究工作 . E － mail:china007xuyi@ 163. com。
△通信作者:游燕，E － mail:xy1221hh@ 163. com
·实验研究·
高效液相色谱法测定珠子参中人参皂苷 Ｒ0 的含量
*
徐 怡，游 燕△，杜春华，牛延菲，赵 仁
(云南省药物研究所，云南 昆明 650111)
摘要:目的 建立用高效液相色谱法测定珠子参中人参皂苷 Ｒ0 含量的方法。方法 SHISEIDO SPOLAＲ C18(5μm，4. 6 ×
250mm)色谱柱;流动相:乙腈 － 0. 1%磷酸溶液(34∶ 66);检测波长 203nm;柱温 30℃，流速1. 0mL /min，进样量 20μl。结果 对照
品线性范围为 0. 212μg － 5. 300μg，相关系数 0. 99998，平均回收率为 101. 4%，ＲSD = 2. 4%(n = 9)。结论 该方法简便可行，重复
性好，可为中药珠子参质量评价体系的建立提供科学依据。
关键词:珠子参;人参皂苷 Ｒ0;高效液相色谱法
中图分类号:Ｒ284 文献标志码:A 文章编号:1007 － 2349(2016)03 － 0055 － 03
Determination of Ginsenosides Ｒ0 Content in Beads Ginseng by HPLC
XU Yi，YOU Yan，DU Chun － hua，NIU Yan － fei，ZHAO Ｒen
(Yunnan Provincial Institute of Materia Medica，Kunming 650111，Yunnan)
【Abstract】Objective:To establish a method for the determination of ginsenoside Ｒ0 content in beads ginseng by HPLC. Methods:
Column was SHISEIDO SPOLAＲ C18 (5μm，4. 6 × 250mm)and mobile phase was acetonitrile － 0. 1% phosphoric acid (34:66)，203nm
of detection wavelength，at 30℃ of column temperature，1. 0mL /min of flow rate and 20μl of injection volume. Ｒesults:The reference
substance was at the linear range of 0. 212μg － 5. 300μg，the correlation coefficient 0. 99998，and the average recovery was 101. 4%，
ＲSD = 2. 4% (n = 9). Conclusion:The method is simple and feasible with good repeatability and can provide a scientific basis for the es-
tablishment of beads ginseng quality evaluation system.
【Key words】beads ginseng，ginsenosides Ｒ0，HPLC
珠子参主产于陕西、四川、云南、甘肃、贵州、西藏等地，为
五加科植物珠子参［Panax japonicus C. A. Mey. Var. major
(Burk. )C. Y. Wu et K. M. Feng］或羽叶三七［Panax japonicus
C. A. Mey. Var. bipinnatifidus(Seem)C. Y. Wu et K. M. Feng ］
的干燥根茎。其味苦，甘，性微寒，用于气阴两虚、烦热口
渴、虚劳咳嗽、跌扑损伤、关节痹痛、咳血、外伤出血等症［1］。
现代研究表明，珠子参化学成分为皂苷、多糖、氨基酸和多
种微量元素［2 － 6］，其主要成分皂苷具有镇痛镇静［7］、抗
炎［8］、改善心肌细胞活性［9］等药理活性。目前药典及多数
研究都以竹节参皂苷Ⅳa 来评价珠子参药材的质量［10 － 12］，
而对珠子参中另一主要成分人参皂苷 Ｒ0 的含量测定尚未
见报道。本文建立了高效液相色谱法测定珠子参中人参皂
苷 Ｒ0 的方法，具有一定创新性，为客观评价珠子参药材质
量提供了科学依据。
1 仪器与试药
1. 1 仪器 美国 Waters e2695 高效液相色谱仪，包含四元
泵，Waters2998 检测器，自动进样器，在线真空脱气机，智能化
柱温箱及 Waters Empower 化学工作站;SK3200LH 超声波处
理器。
1. 2 试药 十批珠子参药材，由云南省药物研究所提供，收
集于丽江珠子参基地，经云南省药物研究所赵仁鉴定为五加
科植物珠子参(Panax japonicus C. A. Mey. var. major(Burk. )
C. Y. Wu et K. M. Feng)。
人参皂苷 Ｒ0 对照品(批号:MUST － 12051501)，供含量测
定用(纯度≥98. 0%)，由北京中兴嘉仁生物技术有限公司
提供。
所用流动相乙腈、磷酸为色谱纯，水为超纯水，处理样品
的乙醇为分析纯。
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DOI:10.16254/j.cnki.53-1120/r.2016.03.028
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2 方法与结果
2. 1 色谱条件 色谱柱:SHISEIDO SPOLAＲ C18柱(5 μm，
4. 6 × 250 mm);流动相:乙腈 － 0. 1%磷酸溶液(34 ∶ 66);流
速:1. 0 mL /min;检测波长:203 nm;进样量:20 μL;柱温 30℃，
在该色谱条件下，供试品、对照品分离较好，与其他杂质峰均
能达到基线分离。
2. 2 溶液的制备
2. 2. 1 对照品溶液的制备 精密称取人参皂苷 Ｒ0 适量，加
甲醇制成每 1 mL中含 0. 1 mg 的溶液，用 0. 45 μm 微孔滤膜
滤过，即得。
2. 2. 2 供试品溶液的制备 取本品粉末(过二号筛)约
0. 1 g，精密称定，置 50 mL 具塞锥形瓶中，精密加 60%乙醇
25 mL，称重，超声处理(功率 135 W，频率 59KHz)40 min，放
冷，用 60%乙醇补重，摇匀，用 0. 45 μm微孔滤膜滤过，即得。
2. 3 测定法 精密吸取上述溶液 20 μL，注入高效液相色谱
仪，测定峰面积，以外标法计算，即得。
3 分析方法学考察
3. 1 系统适应性试验 按供试品溶液制备方法制备供试品
溶液，并按上述色谱条件分别进样对照品、供试品、空白溶液
各 20μl。结果见图 1。由图谱和表中数据可以看出供试品溶
液色谱中与对照品溶液色谱相应的位置上有相同的色谱峰出
现，而空白溶液无此峰出现，人参皂苷 Ｒ0 达到基线分离。
图 1 系统适应性图谱
(图 A －供试品溶液，图 B －空白溶液，图 C －对照品溶液)
3. 2 线性关系考察 精密称取人参皂苷 Ｒ0 对照品 10. 6 mg，
置 10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，得浓度
为 1. 06 mg /mL的标准品储备液，再精密吸取此贮备液 1 mL
置 10 mL 容 量 瓶 中，加 甲 醇 定 容 至 刻 度，摇 匀，得
0. 1060 mg /mL的对照品溶液。精密吸取此对照溶液 2、5、10、
20、30、40、50 μL，分别注入液相色谱仪中，以对照品含量为横
坐标(x)，峰面积为纵坐标(y)，绘制标准曲线。得回归方程
为:y = 357886x － 1859. 73，r = 0. 99998。结果表明，在上述色
谱条件下，人参皂苷 Ｒ0 在 0. 212μg － 5. 300μg 范围内呈良好
的线性关系。
3. 3 准确度试验
3. 3. 1 对照品溶液制备 精密称取人参皂苷 Ｒ0 对照品(纯
度≥98. 0%)20. 35 mg置 100 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并定
容至刻度，摇匀，得浓度为 0. 2035 mg /mL 的对照品溶液，
备用。
3. 3. 2 加样回收方法 精密称取 9 份样品(已测含量为
3. 38%，每份约 0. 05 g，对照品浓度 0. 2035 mg /mL)，分别加对
照品 7、7、7、8、8、8、10、10、10 mL，然后按供试品溶液处理方法
同法处理，将处理好的供试品溶液按含量测定方法同法测定，
计算:平均回收率 = 101. 4%，ＲSD = 2. 4%(n = 9)。
3. 4 精密度试验
3. 4. 1 仪器精密度 取“3. 2”项人参皂苷 Ｒ0 对照品溶液
(0. 1060 mg /mL)，按照“2. 1”项色谱条件，重复进样 6 次，进
样 20 μL，测得峰面积，ＲSD = 1. 2%(n = 6)，结果表明仪器精
密度较好。
3. 4. 2 重复性试验 取同一样品按“2. 2. 2”项制备供试品，
平行试验 6 份，按照“2. 1”项色谱条件，进样 20 μL，测定结果，
ＲSD = 0. 9%(n = 6)，表明本法具有良好的重复性。
3. 4. 3 中间精密度 取同一样品 6 份，按“2. 2. 2”项制备供
试品，由另一名试验人员在 Agilent1100 高效液相色谱仪器按
照“2. 1”项色谱条件进行测定，表明此方法的中间精密度
良好。
3. 5 稳定性试验 取同一份样品溶液，按“2. 1”项色谱条件，
分别于 0、1、2、4、8、12、24h进样，测定人参皂苷 Ｒ0 的峰面积，
ＲSD = 2. 0%(n = 7)，结果表明供试品溶液在 24 h内稳定。
3. 6 耐用性 在耐用性的考察中，对如下可能的变动因素作
了考察。
3. 6. 1 柱温变化:取同一样品，在不同柱温下检测，检测结果
表明温度变化在 ± 10℃的情况下，对检测结果没有影响。
3. 6. 2 色谱柱变化:取同一样品，考察三种不同品牌型号的
色谱柱测试比较，从峰面积结果(ＲSD = 0. 3%)来看，三种柱
的结果都很接近，柱的耐用性较好。
以上方法学考察结果证明，该方法稳定性，耐用性较好，
精密度、重现性以及准确度的 ＲSD 均在 3%以下，符合“中药
新药质量标准研究的技术要求”，方法准确、可靠。
3. 7 样品测定 取 10 批样品按上述供试品制备方法制备，
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各 20μl，注入高效液
相色谱仪，按上述“2. 1”项色谱条件测定，记录峰面积，以外标
法计算样品中人参皂苷 Ｒ0 的含量，结果见表 1。
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云 南 中 医 中 药 杂 志
表 1 10 批样品测定结果
序号 批号 人参皂苷 Ｒ0 含量(%)
1 20121027 4. 32
2 20121030 3. 63
3 20121118 4. 73
4 20130220 6. 55
5 20130325 5. 12
6 20130423 3. 86
7 20130720 5. 38
8 20130816 3. 95
9 20140306 5. 25
10 20140422 3. 89
4 讨论
4. 1 样品前处理方法的选择 本试验参考了有关文
献［10 － 12］，并对提取方法、溶剂的用量、超声时间分别作为单因
素考察，最后确定下来供试品溶液的制备方法。
4. 1. 1 提取溶剂和溶剂体积的选择 本文考察了甲醇，乙
醇，60%乙醇三种溶剂提取人参皂苷 Ｒ0，经试验，结果表明
60%乙醇提取人参皂苷 Ｒ0 效果好，且峰型较好。故确定以
60%乙醇作为提取溶剂。同时比较了定容至 10，25，50 mL 三
种不同体积溶剂对提取的影响，结果表明 25 mL 的溶剂已经
可以完全提取处样品中的人参皂苷 Ｒ0，为节省溶剂，我们确
定以 25 mL为提取溶剂体积。
4. 1. 2 提取方法的选择 比较了超声，回流二种方法，结果
表明都能将人参皂苷 Ｒ0 较完全的提取出来，但回流提取方法
操作较繁琐，超声提取法对仪器要求简单，操作简便，无需加
热。故在本试验中，选择了超声法来提取人参皂苷 Ｒ0。
4. 1. 3 提取时间的选择 取样品 0. 1 g，精密称定，置 50 mL
锥形瓶中，精密加 60%乙醇溶液 25 mL，称重，按 3 个不同时
间进行超声处理，放冷，用 60% 乙醇溶液补重，摇匀，用
0. 45 μm滤膜滤过，即得。分别取上述供试液 20 μL 进样，进
行含量测定，结果表明超声 40 min已提取较为完全，所以确定
提取时间为 40 min。
4. 2 最大吸收波长的选择 通过对人参皂苷 Ｒ0 的甲醇溶液
进行全波长扫描，结果人参皂苷 Ｒ0 在 203 nm、227 nm 处有最
大吸收，但在 203 nm处吸收值最大，故选择 203 nm 为检测波
长，实验表明该波长检测灵敏度高，杂质吸收峰少，干扰小，效
果理想。
4. 3 流动相的选择 本实验对不同流动相:甲醇 － 0. 1%磷
酸溶液(34:66)乙腈 －水(34:66)乙腈 － 0. 1%磷酸溶液(34:
66)进行了考察，结果表明，用乙腈 － 0. 1%磷酸溶液(34:66)
作为流动相测定样品中的人参皂苷 Ｒ0 含量较为适宜，所得峰
形佳，基线平稳，人参皂苷 Ｒ0 峰与其它峰达到很好的分离。
故本试验将珠子参中人参皂苷 Ｒ0 含量测定的前处理方
法及色谱条件定为:用 60%乙醇溶剂 25 mL，超声处理 40 分
钟;以乙腈 － 0. 1%磷酸溶液(34:66)为流动相;检测波长为
203 nm。该前处理方法与 2010 版药典中检测珠子参中竹节
参皂苷Ⅳa的方法相似，为同时考察珠子参皂苷成分，完善中
药珠子参质量评价体系提供了科学依据。
参考文献:
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(收稿日期:2016 － 01 － 13
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