全 文 ：收稿日期:2004 -04-28
基金项目:广东省自然科学基金资助项目(003062)
作者简介:陶均(1976-),男 ,四川宜宾人,华南师范大学 2001级硕士研究生;李玲(1958-),女 ,湖南桂阳人,华南师范大学教授.
＊通讯作者
文章编号:1000-5463(2004)04-0100-06
蓝猪耳组织培养和植株再生条件研究
陶　均 , 李　玲＊
(华南师范大学生命科学学院 ,广东省植物发育生物工程重点实验室 ,广东广州 510631)
摘要:以蓝猪耳(Torenia fournieri)叶片为外植体 ,研究了离体培养条件过程中多种物理化学因素对蓝
猪耳愈伤组织的形成和植株再生的影响 , 进而筛选出了离体培养的最优条件.
关键词:蓝猪耳(Torenia fournieri);组织培养;植株再生;生长素;糖源;NH4 +;温度
中图分类号:Q945　　　文献标识码:A
STUDY ON THE CONDITIONSOF TISSUE CULTURE AND PLANTLET
REGENERATION OF TORENIA FOURNIERI L.
TAO Jun , LI Ling
(Guangdong Key Laboratory of Biotechnology for Plant Development , College of Life S cience ,
South China Normal University , Guangzhou 510631, China)
Abstract:Using the leave explants of Torenia fournieri L., the effects of various factors(aux-
in , sugars , nitrogen type as well as temperature)on tissue culture and plantlet regeneration were
studied , and the favourite condition for torenia culture in vitro was established.
Key words:Torenia fournieri L.;regeneration;auxin;sugar;NH4+;temperature
　　蓝猪耳(Torenia fournieri)属玄参科植物 ,是一种优良草花和夏天重要的盆栽观赏花卉之
一.因生活周期短 ,日本 、香港 、澳大利亚 、新西兰 、美国等国家和地区的科学家通过传统育种
和分子育种等方法已获得了很多蓝猪耳变种 ,作为植物细胞器发生 、受精生理研究的材料及植
物转基因实验材料[ 1～ 3] ,在改变花色 、花型 、花期以及提高其对环境的适应性等方面已取得了
很多重大的成果.国内以蓝猪耳为实验材料进行研究还处于起始阶段 ,只对离体培养条件进
行了初步的研究[ 4 , 5] .本研究室已经建立了蓝猪耳的无性繁殖系统 ,并获得再生植株[ 4] .本文
进一步研究蓝猪耳通过组织培养获得再生苗的条件 ,旨在为其大规模无性繁殖建立最优离体
培养条件以及作为实验室模式植物提供了实验依据.
1　材料与方法
蓝猪耳种子采收于华南师范大学生物园 ,将其用无菌水浸泡 20 ～ 30 min ,再用 70%酒精消
2004年 11月
Nov.2004　 　　　　　　　　
华南师范大学学报(自然科学版)
JOURNAL OF SOUTH CHINA NORMAL UNIVERSITY
(NATURAL SCIENCE EDITION) 　　　　　　　　
2004 年第 4 期
　No.4 , 2004
毒30 s ,无菌水漂洗 3次 ,然后用 8%(w)NaClO消毒 8 ～ 10 min ,无菌水漂洗 4次 ,置于湿润的
滤纸上萌发.
取20 d龄的无菌苗叶做外植体 ,在用不同浓度的 2 ,4-D(2 ,4-Dichlorophenoxyacetic acid)
和2 mg/L NAA (α-Naphthaleneacetic acid)配成愈伤组织生成培养基 ,统计愈伤组织形成率(生
成愈伤组织的外植体数/外植体总数×100%).将培养 15 d龄的愈伤组织置于不同配比 6-
BA/NAA或 4-PU(N-phenyl-N -(4-pyridyl)-urea)/NAA培养基中 ,在不同的时间(d)段统
计愈伤组织出芽率(新生芽的愈伤组织数/愈伤组织数×100%).取 20 d龄的愈伤组织在不同
浓度的 6-BA和 NAA的 MS培养基 ,25℃,光暗 12/12 h培养 ,观察愈伤组织的维持和分化情
况 ,测量直径 ,计算平均直径(愈伤组织的维持指的是在观察的时间内无芽分化;愈伤组织的平
均直径指的是三组愈伤组织直径的平均值).将高2 ～ 3 cm 的再生苗移到 1/2MS培养基 ,添加
图 1　2 , 4-D和 NAA 对蓝猪耳愈伤组织形成的影响
注:2 , 4-D 0.1+NAA 0.2 表示 0.1 mg/ L 2 , 4-D和
0.2 mg/ L NAA ,其余类推;下同
图 2　6-BA和 NAA对蓝猪耳愈伤维持组织的影响
不同浓度的NAA ,在 25℃,光暗16/8 h下观
察生根的数目和形状.将生根的芽约 1 cm
长的组培苗分别在下列情况培养:(1)用MS
培养基置于人工培养箱内不同温度下生
长 ,室温 25℃做对照;(2)接种在 1/2MS(无
NH4
+),以含全 NH4+的 1/2MS 为对照:(3)
接种在不同糖源(蔗糖 、葡萄糖 、甘露糖 ,质
量分数为 3%)的 1/2MS(无NH4+)培养基 ,
光暗 16/8 h下培养.培养一个月观察分析
苗生长情况.以上每个处理重复 3次.
2　结果与分析
2.1　叶愈伤组织的诱导
实验结果表明 , 培养基中 2 , 4-D 与
NAA的比值大小对蓝猪耳诱导愈伤组织和
芽分化起着决定性的作用(图 1).0.1 mg/L
2 , 4-D和 0.2 mg/L NAA 8 d就能很有效诱
导叶外植体边缘产生愈伤组织 , 2 , 4 -D/
NAA高比例时 ,形成的愈伤组织质地坚硬 ,
不容易继代培养.以 1.0 mg/L 2 , 4-D与
0.2～ 0.5 mg/L NAA配比 , 诱导叶发生愈伤
组织的效果最好(图6A),与李玲等[ 4]的报道
结果相似.2 ,4-D/NAA比值变化诱导愈伤
组织形成不同 ,随着培养时间延长 ,愈伤组
织形成率逐渐提高 ,0.1 mg/L 2 ,4-D和 0.2
mg/L NAA培养28 d时形成率达90%(图1).
101　第 4期 陶　均等:蓝猪耳组织培养和植株再生条件研究 　　　
图 3　6-BA和 NAA对蓝猪耳愈伤组织诱芽的影响
图 4　高比例的 6-BA/NAA 对蓝猪耳愈伤组织的
增殖和诱芽的影响
图 5　4-PU和NAA 对蓝猪耳愈伤组织诱芽的影响
2.2　愈伤组织出芽
将愈伤组织转至含有不同浓度 6-
BA和NAA的MS培养基上 ,培养不同时
期后观察愈伤组织的大小.结果表明
2.0 ～ 2.5 mg/L 6-BA/和 0.5 mg/L NAA
有利于愈伤组织的增殖(图 2);低 6 -
BA/NAA(0 ～ 0.5 mg/L)下 ,愈伤组织基
本不生长 ,培养 21 d后愈伤组织出现褐
化 , 35 d 左右全部死亡.含 2.5 ～ 1.5
mg/L BA和 0.5 mg/L NAA培养基生长
的愈伤组织出芽率低(图 3),培养 28 d
时皆低于 50%,而在低 6-BA/NAA 比
例甚至无 NAA 培养基生长的愈伤组织
的诱芽率较高(图 6B).在 4 -PU 和
NAA对愈伤组织诱导芽的实验中 ,NAA
的浓度比 4-PU/NAA比值作用更为重
要 ,当 NAA 2.0 mg/L 时 , 4-PU 在 0.1
mg/L和 0.4 mg/L 时效果最好 ,在 NAA
1.0 mg/L时 ,4-PU浓度变化对诱芽率
基本不产生影响;但在无 NAA时 ,4-PU
0.1 mg/L能单独诱芽 ,且诱芽率能达到
NAA 1.0 mg/L 的水平.因此 ,在 NAA 存
在时 ,NAA浓度是芽分化的重要限制因
素;在NAA 不存在时 ,低浓度 4-PU 便
能诱导芽的分化(图 5).高比例 6-BA
(2.5 ～ 3.5 mg/L)/NAA(0.5 mg/L)时 ,4 w
之内愈伤组织保持增殖生长 ,但 5 w 以
后 ,芽呈暴发式分化 , 3 ～ 6 d内分化率高
达60 ～ 80%,6 w 分化率大于95%(图4).
2.3　试管苗生根
将丛生芽分离后单株置于 1/2 MS
+0 ～ 0.4 mg/L NAA 培养基上 ,5 d左右
可出根(图 6C),在各种培养基对试管苗
的生根率之间差异不显著 ,根长和根形态特征有明显不同(表1).
2.4　再生苗生长
结果表明 ,蓝猪耳丛生芽和完整植株在高温(30℃以上)培养 1个月蓝猪耳芽和完整植株枯
萎死亡;低温(20℃以下)抑制芽的分化和植株生长 ,部分表现出休眠特征.25℃是蓝猪耳芽分化
和植株正常生长的最佳温度(表2).
102　　 华 南 师 范 大 学 学 报(自 然 科 学 版) 2004 年　
蓝猪耳芽(约 1 cm)接种在 1/2MS(无 NH4+)培养基上 ,或在生长条件为光照 16 h ,温度
30℃,黑暗8 h ,温度16℃的条件下生长 , 以25℃、光暗 16/8 h的条件做对照 ,结果表明 ,昼夜温
度差对蓝猪耳生长影响不大 ,只是试管苗颜色较对照黄(表 3和图 7A).
图 6　蓝猪耳愈伤组织形成及植株再生(A)愈伤组织(18 d), (B)愈伤组织出芽(21 d), (C)芽生根(7 d)
图 7昼夜温差以及不同糖源对蓝猪耳生长的影响
(A)左:昼夜温差处理 ,右:为室温对照　(B)自左至右分别是蔗糖 、葡萄糖和甘露糖处理
表 1　NAA对蓝猪耳试管苗生根的影响
ρ(NAA)
/(mg·L-1) t 出根/d 生根率/ % l根/ cm 　　　根特点
0 7 82.5 0.3 ～ 1.0 　　成辐射状生长 , 无分支
0.1 6 75.3 0.4～ 0.6 　　从生根 , 根毛较少
0.2 5 92.5 0.3 ～ 0.6 　　从生根 , 数量较多 ,根毛较多
0.3 5 97.2 0.1 ～ 0.6 　　从生根 , 数量众多 ,有分支 , 根毛较长
0.4 5 87.5 0.1 ～ 0.4 　　从生根 , 数量众多 ,呈毛簇状 , 根毛长短
　　接近主根 , 呈多级分支
　注:生根率 、平均根长及根特点为出根后一周统计的结果
表 2　温度对蓝猪耳生长的影响
外植体 θ/ ℃ 成活率/ %　　特征
丛生芽 30 0 全部枯黄至死
25 92.5 不断分化出新芽 ,已成芽的明显增高
20 82.5 芽分化停止 ,增高不明显
完整植株 30 25.6 成活动均枯黄 ,只有顶端有绿色 , 没有出现再生长特征
25 91.6 均生长良好 ,增高明显
20 71.7 生长停止 , 呈现休眠特征
蓝猪耳芽(约 1 cm)接种在1/2MS
(无 NH4+或含 NH4+)的培养基培养一
个月 ,无NH4+的培养基有利于蓝猪耳试
管苗的生长.培养基含有 NH4+ , 试管
苗叶皱缩 ,植株矮小(表 4).
试管苗在不同糖源(蔗糖 、葡萄糖 、
甘露糖 , 质量分数为 3%的 1/2MS (无
NH4
+)培养基上培养 ,以蔗糖为最适糖
103　第 4期 陶　均等:蓝猪耳组织培养和植株再生条件研究 　　　
表 3　昼夜温差对蓝猪耳生长的影响
处理条件成活率/ % h最高/cm h最低/ cm h最低/ cm 叶颜色
昼夜温差 100 6.7 2.6 4.9 黄绿色
室温对照 100 5.4 2.3 5.1 嫩绿色
　培养 21 d
表 4　NH4+对蓝猪耳生长的影响
处理条件成活率/ % h最高/cm h最低/ cm h最低/ cm 叶型
不含 NH4+ 100 6.7 2.2 4.2 舒展
含NH4+ 100 6.3 2.0 3.6 较皱缩
表 5　糖源对蓝猪耳生长的影响
糖源 成活率/ % h最高/cm h最低/ cm h最低/ cm 叶型
蔗糖 100 6.7 2.2 4.9 舒展
葡萄糖 100 4.6 2.1 2.7 舒展
甘露糖 100 1.5 1.0 1.2 皱缩
源 ,在葡萄糖培养基上的生长较蔗糖
缓慢 ,基本上不利用甘露糖(表 5和
图7B).
3　讨论
在诱导叶愈伤组织形成方面 ,其
出愈率在培养基含有不同浓度细胞
分裂素和生长素组成配比呈现不同
的结果[ 5 ,6] ,微量的 2 ,4-D即可诱导
愈伤组织 ,但随着 2 ,4-D/NAA 比例
提高 ,愈伤组织由疏松变得坚硬 ,颜
色由淡黄色逐渐变绿 ,后期芽分化能
力逐渐降低.2 , 4-D等细胞分裂素
可能在浓度低时有助于细胞的快速
分裂 ,但高浓度时细胞分裂减慢 ,但加速胞内与细胞壁以及光合作用有关代谢 ,促进单个增长
而非分裂.高比例 6-BA/NAA在早期有利于愈伤组织的增殖和保持 ,但随培养时间的延长 ,
芽分化加剧 ,5 ～ 6周后分化达 95%以上.原因可能是随着时间推移 ,细胞分裂逐渐减弱 ,而胞
内与芽分化有关的代谢在高 6-BA/NAA诱导下逐渐加强 ,积累到一定时候芽原基同时发生.
蓝猪耳作为亚热带植物 ,喜温和喜光 ,实验结果表明 30℃以上不利于丛生芽和完整植株
的生长 ,大部分在培养 4周以后死亡;本实验中低于低温 20℃培养抑制丛生芽和完整植株的
生长 ,但成活率达 100%,明显呈现休眠状态.这与田间种植有很大不同 ,一般亚热带植物在
30℃以上 ,35℃以下生长都较旺盛 ,可能原因是组培苗对外界环境适应性较差所致.昼夜温差
(27.5/16.5℃)使蓝猪耳矮化和促进叶的生长 ,27.5℃有利于蓝猪耳的快速生长和叶形状的正
常化 ,温差有利于有机物积累和促进生长 , 适宜温度和光强会促进这一过程 ,因而(27.5/
16.5℃)温差和光照 16/8 h(3500 lx)下植株生长最旺盛.
NH4
+作为一种重要的氮源 ,在大多数组织培养过程中都是有效的 ,轻微抑制蓝猪耳的芽
生长 ,可能原因在于根系 NH4+转移困难或蓝猪耳对 NH4+较敏感 ,低浓度 NH4+产生毒害.不
同糖类具有不同的生理效应 ,糖的种类和用量不仅影响培养物生长速度和生长量 ,而且影响其
代谢水平 、次生代谢物合成 、以及细胞的形态和发生 ,是影响组织培养成功与否的关键之一[ 7] .
有研究表明 ,当培养植物细胞添加甘露糖时 ,它只被转化为 6-磷酸甘露糖 ,由于植物体内缺
乏磷酸甘露糖异构酶不能进一步参与代谢 ,而积累至毒性水平[ 8]影响植株生长.无NH4+的 1/
2MS培养基(3%蔗糖)是蓝猪耳芽分化和植株正常生长的最佳培养基.
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104　　 华 南 师 范 大 学 学 报(自 然 科 学 版) 2004 年　
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【责任编辑　黄玉萍】
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《华南师范大学学报》(自然科学版)
获全国高校优秀科技期刊二等奖
“2004年全国高校科技期刊优秀评比”于最近结束并在贵阳召开颁奖大会 , 《华
南师范大学学报》(自然科学版)获得全国高校优秀科技期刊二等奖 ,奖项由教育部科
学技术司署名颁发奖状.
“2004年全国高校科技期刊优秀评比”共有 180种高校主办的科技期刊获奖 ,包
括各高校学报和专业科技期刊.其中一等奖60名 ,二等奖 120名.自改革开放以来 ,
“全国高校科技期刊优秀评比”一共进行了 4次(1989年 、1995年 、1999年 、2004年)。
《华南师范大学学报》(自然科学版)在 1989年获得二等奖 ,1999年获得三等奖 ,2004
年获得二等奖.
105　第 4期 陶　均等:蓝猪耳组织培养和植株再生条件研究