全 文 ：表 8　不同增殖培养基对芽增殖的影响
Table 8　Comparison of various propagation mediums
培养基 激素(mg L) 芽的增殖情况
A(6-BA) B(IBA) 增殖系数
P1 0.1 0.2 1.33
P2 0.1 0.5 1.12
P3 0.1 1.0 1.38
P4 0.1 2.0 1.27
P5 0.2 0.2 1.18
P6 0.2 0.5 1.27
P7 0.2 1.0 1.38
P8 0.2 2.0 1.30
P9 0.5 0.2 1.40
P10 0.5 0.5 1.19
P11 0.5 1.0 1.18
P12 0.5 2.0 1.38
P13 1.0 0.2 1.43
P14 1.0 0.5 1.50
P15 1.0 1.0 1.27
P16 1.0 2.0 1.50
表 9　增殖培养的方差分析
Table 9　Variance analysi s of various propagation media
变异来源
D F
SS M S F
增殖系数 增殖系数 增殖系数
A 3 0.050 0.0250 2.632
B 3 0.065 0.0217 3.421
A×B 3 0.142 0.0473 7.474＊
误差 6 0.040 0.0067
表 10　不同生根培养基对生根的影响
Table 10　Comparison of various rooting mediums
培养基 生根率(%) 生根系数
M2 92.68 4.289
M3 96.30 5.308
M4 96.68 1.949
表 11　生根培养基的方差分析结果
Table 11　Variance analysis of various rooting mediums
培养基 生根率(%) 5% 1% 培养基 生根系数 5% 1%
M4 96.68 a a M3 5.308 a a
M3 96.30 ac ac M2 4.289 ac ac
M2 92.68 b B M4 1.949 b b
3　讨论
3.1　适宜盐桦离体培养的最适外植体和培养基
适宜盐桦离体培养的最适外植体为带芽嫩茎 , 增殖的最
佳培养基为:MS+6-BA 1.0mg L+IBA 0.5mg L;生根培养基:
1 2MS+IBA 0.5mg L+蔗糖 30g L+琼脂 7%+暗光处理 3d。
3.2　Konar 等[ 9](1972)认为:在组织培养中 , 通过器官发生途
径产生再生植株的基本方式有三种 ,一是先分化芽 , 待芽伸长
后在其幼茎基部长根 , 形成完整植株。这种方式在母本植物
组织培养中较为普遍;二是先分化根 , 再在根上产生芽而形成
完整植株;三是愈伤组织的不同部位分别形成根和芽 , 然后二
者的维管组织互相连接形成完整植株。本实验的结果符合第
一种情况 , 即在盐桦芽增殖分化培养基中先分化芽 , 待芽伸长
后在其幼茎基部长根 , 形成完整植株。 本研究发现:在盐桦的
增殖培养中 , 产生愈伤组织很少 , 盐桦是以腋芽形成丛生芽的
方式进行增殖的。这一增殖途径对保证盐桦组培苗遗传性状
稳定较为有利[ 9] 。 盐桦离体培养过程中 , 芽增殖系数高达
1.773 ,芽平均生物量可达 3.49g , 试管苗生长健壮 ,生根率高达
96%, 能较好地满足离体快繁的需要。
参考文献:
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盐桦无菌材料的成功获得及其试管苗移栽定植成活的方法
梅新娣 ,张富春＊(新疆大学生命科学与技术学院分子生物学重点实验室 , 新疆生物资源基因工程重点实验室 , 新疆 乌鲁木齐 830046)
摘要:目的:探讨获得盐桦无菌材料的最适灭菌方法和提高移栽定植成活率的关键性技术要点 。方法:以新疆濒危植物盐桦
当年生休眠枝条为材料 ,在适宜的培养基上筛选最适灭菌方法 , 继而以生长 85～ 90d 左右的组培试管苗为材料 ,探讨移植时期 、
温度 、光照 、水分 、营养对成活率的影响。结果:采用半无菌水表面灭菌+75%酒精 30s+0.1%升汞 7～ 10min 处理效果最好 ,污染
率为13.3%。盐桦组培试管苗移栽定植中 ,以 4 月中旬～ 5月中旬成活率较高 , 平均成活率在 95%以上。结论:研究筛选获得了
盐桦的最适灭菌方法和盐桦组培试管苗移栽定植成活的适宜方法 , 为工厂化扩繁盐桦苗木创造了条件。
关键词:盐桦;灭菌;移栽定植
中图分类号:Q813.11　　文献标识码:A　　文章编号:1004-311X(2006)03-0081-03
Study on Acquiring Sterilized Explants and Transplant for Betula halophila
第 16卷第 3 期:81
2006 年 6 月 　　　　　　　　　　　　　　　　
生　物　技　术
BIOTECHNOLOGY
　　　　　　　　　　　　　　　　　Vol.16 , No.3:81
Jun.2006
DOI :10.16519/j.cnki.1004-311x.2006.03.032
MEI Xin-di ,ZHANG Fu-chun＊
(Key Laboratory of Molecular Biology , College of Life Science and Technology , Xinjiang University ,
Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering , Urumqi 830046)
Abstract:Objectives:To acquire sterilization material for rare endangered plant Betula halophila in Xinjiang and enhance the rate of survival after
transplant.Methods:In this experiment , dormancy shoot of Betula halophila were taken as explants and cultured in vitro to search the optimal ster-
ilizing method.subsequently , The tissue culture seedling , which have grown for 85-90 days , was transplanted , to explore the influence of trans-
plant period , temperature , illumination , humidity and nourishment upon transplant.Results:The method of half-sterilized+75% alcohol 30s
+0.1% HgCl2 7 ～ 10min has a good sterilizing effect on explants.The rate of pollution is 13.3%.The survival rate is more than 95% from the
middle of April to the middle of May.Conclusion:The research obtained the optimal sterilizing method and transplanting method for Betula halo-
phila , and provided conditions for producing tissue culture seedling in large quantity.
Key words:Betula halophila;sterilization;transplant
收稿日期:2006-01-13;修回日期:2006-03-02
基金项目:国家科技攻关西部科技行动项目(No.2001BA901A32);国家
“863”项目(No.2004AA227110-2)
作者简介:梅新娣(1970-)女 ,讲师 ,硕士 ,从事植物生物技术研究和
教学;＊通讯作者:张富春(1962-),男 ,教授 ,博士导师 , 研究方向:生
物技术 , Tel:991-8583517 , Fax:991-8583517 , E-mail:zfc @xju.edu.
cn。
　　盐桦 , 拉丁学名 Betula halophila Ching , 桦木科桦木属植
物[ 1] , 由我国著名的植物学家秦仁昌教授发现定名[2] ,是原生
地已濒临灭绝的小乔木树种 , 目前仅存于我国新疆阿勒泰地
区 ,属一级保护植物[ 2-4] 。
盐桦树皮和小枝为灰褐色 , 小枝有短而密的白色柔毛及
黄色的树脂腺体;叶长 2.5～ 4.5cm , 卵形或菱形;果序为下垂
的圆柱形 , 长 2～ 3cm , 直径约 1cm;小坚果呈卵形 , 长 2mm , 宽
1.5mm;膜质果翅宽阔 ,宽度为果的 1.5 倍 ,翅的两面均有疏而
短的柔毛[ 1 , 5] 。由于盐桦当年生枝条上密布许多短而密的白
色柔毛及黄色的树脂腺体 , 常规消毒灭菌方法很难获得无菌
材料。为此 , 本研究探讨了获得盐桦无菌材料的最适灭菌方
法。并针对组培试管苗移栽定植成活率较低的现象 ,探讨了
提高盐桦移栽定植成活率的关键性技术要点。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　实验材料
供试材料[ 6]分别为 2003年 9 月中旬从阿尔泰地区阿拉哈
克盐湖边采摘的盐桦休眠实生苗上的落叶枝条及生长 85 ～
90d后的组培试管苗。
1.1.2　试剂
实验所用试剂均为分析纯 , 植物激素(6-苄氨基嘌呤 , 6
-BA);α-萘乙酸(NAA);赤霉酸(GA3);4-吲哚丁酸(IBA);
吲哚乙酸(IAA);激动素(KT);赛苯隆(TDZ);聚乙烯吡咯烷酮
(PVP40))均购于北京欣经科生物技术公司。
1.2　方法
1.2.1　消毒方法
将盐桦的落叶枝条 ,用流水冲洗以去除枝条表面污物 , 剪
取盐桦茎段 ,先用毛刷蘸洗涤剂溶液轻轻地刷洗 , 将刷洗后的
茎段置于烧杯中 ,用纱布封口后流水冲洗 2～ 3h。设计 6 个梯
度(见表 1),每个梯度接种 10 ～ 20 个枝条材料 , 10d 后统计污
染率和成活率。
1.2.2　培养基
初始培养基[ 6] :MS+BA 1.0 mg L+琼脂 7%+蔗糖浓度
20g L。
分化培养基[ 7] :LS+ BA0.5+NAA 0.2+琼脂 7%+蔗糖
浓度 20g L。
LS+BA0.5+NAA0.02+琼脂 7%+蔗糖浓度 20g L
增殖 、壮苗培养基[ 7] :MS+6-BA 1.0mg L+IBA0.5mg L+
琼脂 7%+蔗糖浓度 20g L
生根培养基[ 8] :1 2MS+IBA0.5mg L+蔗糖 30g L+琼脂
7%+暗光处理 3d。
MS+IAA 0.2mg L+蔗糖 30g L+琼脂 7%。
MS+NAA 0.2mg L+蔗糖 10g L+琼脂 7%。
1.2.3　培养条件
实验所采用的基本培养基是 MS 、LS 培养基 , 附加各种激
素 , 上述培养基均用 1mol L NaOH 或HCl调至 pH 为 5.8～ 6.0 ,
接种后放入培养室内光照培养 , 培养室温度保持在 22℃～
25℃, 光照16h d , 光照度为1 000～ 1 500lx , 湿度为60%～ 70%。
1.2.4　盐桦组培试管苗的移栽
盐桦组培试管苗分别于 2004 年 2月 27 日 、4月 10 日 、5 月
21日 、5月 30 日 、6 月 22日分五批移栽 , 经炼苗 、洗苗 、移植 、拱
棚保湿及栽后管理后 , 统计各批次移栽的成活率。
2　结果与分析
2.1　几种消毒方法对外植体的影响
6种消毒方法处理的盐桦外植体接种后情况如下。
表 1　不同消毒方法的污染率和成活率
Table 1　Data of pollution rate and survival rate
编号 接种数(个)
污染数
(个)
成活数
(个)
污染率
(%)
成活率
(%)
A:对照 70%酒精 15s , +0.1%升汞3～ 5min 10 10 0 100.0 0.0
B1:对照 70%酒精 20s , +0.1%升汞 5～ 7min 10 7 1 70.0 10.0
C:对照 75%酒精 30s , +0.1%升汞 7～ 10min 10 6 3 60.0 20.0
A1:半无菌水表面灭菌+70%酒精 15s ,
+0.1%升汞3～ 5min 15 8 7 53.3 46.7
B1:半无菌水表面灭菌+70%酒精 20s ,
+0.1%升汞5～ 7min 15 6 9 40.0 60.0
C1:半无菌水表面灭菌+75%酒精 30s ,
+0.1%升汞7～ 10min 15 2 13 13.3 86.7
　　由表 1 可见 , 6 种处理中就成活率和污染率而言 , C1(半无
菌水表面灭菌+75%酒精 30s+0.1%升汞 7～ 10min)处理效果
最理想 , 成活率最高为 86.7%,污染率最低为 13.3%。
A1 、B1 、C1 三种梯度的成活率和污染率分别比对照 A、B、
C 好 ,进一步说明 , 先用半无菌水表面灭菌方法 ,使枝条组织充
分吸饱水后 , 再结合常规灭菌法的效果是非常明显的。
A1 、B1、C1三种梯度中 , 在一定的范围内 , 酒精和升汞处
理的时间越长 , 成活率逐渐呈递增趋势 , 而污染率呈递减趋
势。但必须掌握好时间度的问题 , 当时间过长时 , 会杀死外植
体的组织细胞 , 从而影响实验的效果。
2.2　在盐桦试管苗移栽和驯化过程中的几点注意事项
2.2.1　炼苗
移栽前逐步开启瓶盖 , 散射光下锻炼 2-3d , 同时滴加少
许纯净水 , 水层刚刚覆盖瓶中培养基的表面即可 , 纯净水中可
附加少许多菌灵或其他抗生素。 炼苗的主要目的是为了保证
幼苗从高湿到干燥状态 、从人工补光到自然光照状态 、从无菌
环境向有菌环境的慢慢过渡。
2.2.2　洗苗
移栽时 , 小心用镊子取出试管幼苗 , 流水下轻轻洗去幼苗
根部附着的培养基。切忌幼苗根系仍然带有培养基 , 这样会
导致根系的腐烂。
2.2.3　栽苗
最好采用座水栽法 , 将秧苗栽入营养钵的基质(蛭石∶珍
珠岩=3∶1)中 , 边栽边轻轻向上提苗 , 使根系与基质能充分接
触并且保证幼苗根系的舒展 , 栽后用清水清洗叶面上的基质。
82　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　生　物　技　术　　　　　　　　　　　　　　　　　　第 16 卷第 3期
2.2.4　拱棚保湿
用细竹竿拱一个离幼苗苗高约 15cm左右的小拱棚 。
2.2.5　栽后管理
栽后 7-10d 内 , 温度控制在白天 20℃～ 22℃, 晚上 15℃
～ 17℃,先进行 3d 左右的暗光或散射光处理 , 连续遇阴雨天 、
雾天 、风天时 , 需补充人工光照。 10d(见图 1)后 , 通风并及时
补充 1 8倍的营养液 , 保证盆中墒情。 15d 后 ,可延长通风时间
并提高温度(25℃～ 28℃), 补水时注意掌握见干见湿的原则。
21 ～ 28d后 , 待秧苗长出新生幼叶时 , 可移入花土中。
图 1　营养基质中的盐桦移栽苗
Fig.1　The transplant seedling of Betrla halophila in nourishment
表 2　不同时期的移栽成活率
Table 2　Data of survival rate of transplant
时期(年-月-日) 盆数(个) 成活数(个) 成活率(%)
2004-2-27 3 0 0.0
2004-4-10 31 28 90.3
2004-5-21 63 63 100.0
2004-5-30 6 5 83.3
2004-6-22 3 1 33.3
　　由表 2 可见 , 在不同时期的 5 次移栽中 , 以 4 月中旬～ 5
月中旬这一阶段的成活率较高 ,平均成活率在 95%以上 , 植株
生长状况良好(见图 2)。
3　讨论
3.1　由于盐桦枝条上密布许多短而密的白色柔毛及黄色的
树脂腺体 ,前期我们采用常规消毒灭菌方法很难获得无菌材
料。本研究利用半无菌水表面灭菌结合常规灭菌方法 , 处理
盐桦当年生的休眠枝条 ,成功获得了无菌材料 ,为后续的实验
打下坚实的基础。
3.2　组培试管苗移栽定植成活率较低 , 一般来说 , 早春外界
温度逐渐升高与幼苗对温度的需要相适应 , 移栽效果较好。
研究中将盐桦组培试管苗于 2004 年 2 月至 6 月间分五批移
栽 ,结果表明 , 4 月中旬至 5 月中旬间移栽定植成活率高达
95%, 是盐桦组培试管苗最佳的移栽时期 , 其原因在于该时期
的温度 、湿度及光照条件与移栽苗生长所需的条件较为吻合。
在研究中我们根据气候条件的变化实时调整温度 、湿度及光
照培养条件 , 并佐以适当的营养液浇灌 ,也有利于提高移栽定
植成活率。
图 2　室外移栽盐桦苗
Fig.2　The t ransplant seedling of Betula halophia outdoors
参考文献:
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专题综述
REVIEW ARTICLES
重组大肠杆菌高表达高密度发酵研究
杨炜 ,王伟刚 ,田海英 ,许伟 ,温传彬(江苏万邦生化医药股份有限公司 ,江苏 徐州 221004)
摘要:大肠杆菌高密度高表达发酵技术是现代发酵工程的重要研究课题 ,此项技术可以有效地提高大肠杆菌的产量和外源
重组蛋白的表达量 ,该文就影响大肠杆菌高密度发酵的主要因素如宿主菌类型 、培养基组成 、培养条件 、生长抑制物质 、补料调控
等进行了阐述和讨论。
关键词:重组;大肠杆菌;表达;发酵;高密度
中图分类号:Q815　　文献标识码:A　　文章编号:1004-311X(2006)03-0083-04
收稿日期:2005-11-01;修回日期:2006-04-25
作者简介:杨炜(1962-),男 ,江苏徐州人 ,学士 ,工程师。
　　基因工程技术在实践中最主要的应用是生产其它方法无
法获得的物质 ,如人体胰岛素 , 在基因工程技术出现之前无法
大量得到 ,而现在人们利用基因工程技术可以大量获得。目
前工业生产中使用最多的工程菌为大肠杆菌。利用大肠杆菌
生产蛋白质的基本过程是先将目的基因插入到合适的质粒
中 ,再将质粒转化至大肠杆菌中 , 培养大肠杆菌 ,将目的蛋白
从大肠杆菌中提取出来。其中大肠杆菌的培养暨工程菌的高
密度发酵至关重要 , 它直接决定获得目的蛋白的多少。因此 ,
重组大肠杆菌高表达高密度发酵一直是生物工程企业及科研
院所研究的热点[1] 。本文就影响重组大肠杆菌高表达高密度
发酵的主要因素进行阐述 , 包括宿主菌的类型 、发酵工艺中的
培养基组成 、培养条件 、生长抑制物质的产生以及发酵补料调
控等。过去 30 年来分子生物学的发展令人瞩目 , 已可以在分
第 16卷第 3 期:83
2006 年 6 月 　　　　　　　　　　　　　　　　
生　物　技　术
BIOTECHNOLOGY
　　　　　　　　　　　　　　　　　Vol.16 , No.3:83
Jun.2006