全 文 ：北方园艺２０１６（０５）：１１３～１１８ ·生物技术·
第一作者简介：崔彩云（１９９０－），女，河北沧州人，硕士研究生，研究
方向为资源植物工程学。Ｅ－ｍａｉｌ：ｃｃｙｄｙｗｅ＠ｓｏｈｕ．ｃｏｍ．
责任作者：姜山（１９６９－），男，贵州贵阳人，博士，教授，研究方向为
植物病理学。Ｅ－ｍａｉｌ：ｋｙｏｓａｎ２００３１２＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ．
基金项目：国家自然科学基金资助项目（３０８６０１５８）；贵州省自然科
学基金资助项目（３１２６０４２６）。
收稿日期：２０１５－０９－２４
ＤＯＩ：１０．１１９３７／ｂｆｙｙ．２０１６０５０３１
小立碗藓Ｃ３Ｈ基因敲除载体的构建及Ｃ３Ｈ１－ｎｐｔⅡ?Ｃ３Ｈ２
目的片段最佳ＰＣＲ条件筛选
崔 彩 云，晏 国 洪，姜 山
（贵州师范大学 生命科学学院，贵州 贵阳５５０００１）
摘 要：以小立碗藓作为试材，将总长为１ ９８１ｂｐ的小立碗藓Ｃ３Ｈ基因分为上游片段（１ ０００ｂｐ），
下游片段（９８１ｂｐ），并以此设计引物，得到上游臂（Ｃ３Ｈ１，７３５ｂｐ）、下游臂（Ｃ３Ｈ２，７００ｂｐ）。在
Ｃ３Ｈ１引物设计时引入ＸｈｏＩ、ＥｃｏＲＶ酶切位点到两端，Ｃ３Ｈ２设计时引入ＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩ酶切位点
到两端。以小立碗藓总ＤＮＡ为模板，通过ＰＣＲ扩增得到Ｃ３Ｈ１和Ｃ３Ｈ２片段。将Ｃ３Ｈ１和
Ｃ３Ｈ２插入到ｐＴＮ１８２载体中，获得敲除载体（Ｃ３Ｈ１－ｐＴＮ１８２－Ｃ３Ｈ２质粒），通过ＰＣＲ获得
Ｃ３Ｈ１－ｎｐｔⅡ?Ｃ３Ｈ２目的片段，并且采用单因素方法研究引物浓度与退火温度对ＰＣＲ产物浓度及
特异性的影响。结果表明：引物浓度为０．２０μｍｏｌ／Ｌ，退火温度为５８．７℃，ＰＣＲ产物特异性最高且
产物浓度较高。
关键词：小立碗藓Ｃ３ Ｈ基因；基因敲除；载体构建；退火温度
中图分类号：Ｓ ７８１．４２ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００１－０００９（２０１６）０５－０１１３－０６
小立碗藓（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）属葫芦藓目
（Ｆｕｎａｒｉａｌｅｓ）葫芦藓科（Ｆｕｎａｒｉａｃｅａｅ）小立碗藓属
（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｉｕｍ）［１］。小立碗藓具有较高的同源重组率，
已成为植物生物学和功能基因组学研究的一个模式系
统［２］。
课题组在前期工作中发现，小立碗藓能够被灰霉菌
感染，且出现细胞壁加厚及乳突状结构。在维管束植物
的诱导抗病性反应中，植物通过细胞壁加厚及乳突结构
抵御病原菌的入侵。研究结果还表明，木质素参与维管
束植物细胞壁加厚及乳突的形成［３］。虽然苔藓植物是
否能够合成木质素还存在一定的争议，但是经木质素特
异性染料ＫＭｎＯ４染色后在电子显微镜下观察发现，在
小立碗藓的细胞壁加厚和乳突结构处的颜色加深（未发
表），说明小立碗藓可能合成了木质素或类木质素。另
外，有文献报道，小立碗藓有除Ｆ５ Ｈ以外的合成木质素
的全套基因，具备合成木质素的生理基础［４］。还发现小
立碗藓被灰霉菌感染后与木质素合成相关的关键酶基
因上调表达（未发表）。以此为前提，课题组试图通过基
因敲除的方法探究小立碗藓与病原菌互作过程中这些
上调表达的酶是否参与合成木质素或类木质素。在木
质素苯丙烷合成途径中香豆酸－３－羟基化酶基因（Ｃ３ Ｈ）
催化苯环Ｃ３－位羟基化反应，最近有研究表明降低Ｃ３ Ｈ
活力一般会导致维管束植物木质素含量的降低以及木
质素组成发生变化［５］。该试验构建了Ｃ３ Ｈ基因的敲除
载体，并对影响ＰＣＲ产物特异性的引物浓度与退火温度
进行了优化。
１ 材料与方法
１．１ 试验材料
供试材料小立碗藓由首都师范大学何奕騉教授提
供。小立碗藓于ＰＰＮＨ４培养基上进行组织培养（２５℃，
光照期为１６ｈ光照／８ｈ黑暗，光照强度为８ ０００ｌｘ）。该
试验的材料为培养２５ｄ的小立碗藓。
Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α由贵阳医学院提供，用于制备感受态
大肠杆菌。
质粒ＰＴＮ１８２由首都师范大学何奕騉教授提供，作
为基因敲除的原始质粒，ＰＴＮ１８２质粒中含有ｎｐｔⅡ基因，
该基因在大肠杆菌中表现为抗卡那霉素。
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·生物技术· 北方园艺２０１６（０５）：１１３～１１８
Ｔａｑ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ ＤＬ １５ ０００、限制
性内切酶（ＸｈｏＩ、ＥｃｏＲＶ、ＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩ）、Ｔ４－ＤＮＡ连接酶均
购自宝生物工程（大连）有限公司；ＰＣＲ引物由宝生物工
程（大连）有限公司；质粒提取试剂盒（ＯＭＥＧＡｂｉｏｔｅｋ公
司）；其它试剂均为国产分析纯。
１．２ 试验方法
１．２．１ 设计引物 在ＧｅｎＢａｎｋ中找到维管植物Ｇｉｎｋｇｏ
ｂｉｌｏｂａ Ｃ３ Ｈ基因的蛋白序列，以蛋白序列比对出Ｃ３ Ｈ
基因的 ｍＲＮＡ序列，在ＢＬＡＳＴ－Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌａ ｐａｔｅｎｓ
１．１网站中找到小立碗藓Ｃ３ Ｈ 基因的ＤＮＡ全序列，全
长１ ９８１ｂｐ。然后，将小立碗藓Ｃ３ Ｈ 基因的ＤＮＡ序列
分成２个部分，前一部分１ ０００ｂｐ，后一部分９８１ｂｐ，并
分别以其为模板利用Ｐｒｉｍｅｒ５－Ｃｒａｃｋｅｄ软件设计引物，为
提高基因重组率，重组基因在１ ５００ｂｐ重组率较高，因
此最终设计得到：前一部分称为上游臂（Ｃ３Ｈ１，７３５ｂｐ）、
后一部分称为下游臂（Ｃ３Ｈ２，７００ｂｐ）。再利用ＤＮＡ－
ＭＡＮ软件列添加酶切位点、保护碱基［６］。最终合成的
引物序列见表１。
表１ 引物序列
名称 序列 酶切位点
上游臂
Ｃ３Ｈ１－Ｆ ５′－ＣＡＣＣＴＣＧＡＧＣＴＣＡＴＴＧＡＴＧＧＴＴＧＧＧＴＣＡ－３′ ＸｈｏＩ
Ｃ３Ｈ１－Ｒ ５′－ＧＣＧＧＡＴＡＴＣＧＣＴＴＣＡＴＴＣＣＴＴＧＣＧＡＴＡ－３′ ＥｃｏＲＶ
下游臂
Ｃ３Ｈ２－Ｆ ５′－ＴＣＴＣＡＴＡＴＧＡＧＡＧＣＴＧＧＡＴＣＡＧＧＴＧＡＧＧ－３′ ＮｄｅＩ
Ｃ３Ｈ２－Ｒ ５′－ＴＴＣＧＧＡＴＣＣＴＧＡＡＡＴＧＣＧＡＧＧＴＧＧＡＧＡ－３′ ＢａｍＨＩ
１．２．２ 上、下游臂基因片段的扩增 采用改良ＣＴＡＢ
法提取总ＤＮＡ［７］，并用琼脂糖凝胶检测ＤＮＡ条带是否
提取成功。以提取的小立碗藓基因组ＤＮＡ为模板，
Ｃ３Ｈ１－Ｆ、Ｃ３Ｈ１－Ｒ为引物进行ＰＣＲ扩增上游臂基因片
段［８］，反应体系见表２；以Ｃ３Ｈ２－Ｆ、Ｃ３Ｈ２－Ｒ为引物进行
ＰＣＲ扩增下游臂基因片段，ＰＣＲ反应体系见表２。上、
下游臂的ＰＣＲ反应条件均为：预变性９４℃５ｍｉｎ，变性
９４℃３０ｓ，退火５５℃３０ｓ，延伸７２℃１ｍｉｎ，３５个循环，再
延伸７２℃１０ｍｉｎ，保存于４℃。ＰＣＲ反应得到的目的基
因产物用琼脂糖凝胶电泳检测。检测后，加入４μＬ乙
酸钠、１２０μＬ无水乙醇，－２０℃，放置１～２ｈ，终止反应；
离心，１２ ０００ｒ／ｍｉｎ，１２ｍｉｎ，倒掉上清；加１２０μＬ ７０％乙
醇，离心，１２ ０００ｒ／ｍｉｎ，１２ｍｉｎ，重复２次，吹干。最终溶
于无菌去离子水中，放置于－２０℃冰箱备用。
表２ ＰＣＲ反应体系
上游臂 下游臂
药品 体积／μＬ总体积／μＬ 药品 体积／μＬ总体积／μＬ
Ｃ３Ｈ１－Ｆ １ Ｃ３Ｈ１－Ｆ １
Ｃ３Ｈ１－Ｒ １ Ｃ３Ｈ１－Ｒ １
小立碗藓基因组ＤＮＡ ３ ５０ 小立碗藓基因组ＤＮＡ １ ５０
Ｐｒｅｍｉｘ ＴａｑＴＭ ２５ Ｐｒｅｍｉｘ ＴａｑＴＭ ２５
无菌去离子水 ２０ 无菌去离子水 ２２
１．２．３ Ｃ３Ｈ１－ＰＴＮ１８２－Ｃ３Ｈ２敲除载体的构建 采用分
步酶切方法［９］，使用ＸｈｏＩ、ＥｃｏＲＶ ２种限制性内切酶，分
别酶切上游臂和ｐＴＮ１８２原始质粒，酶切体系见表３；酶
切后在管中加入４μＬ ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｅｒ，４４μＬ １０％乙酸钠，
１２０μＬ、无水乙醇，－２０℃，１～２ｈ终止反应；离心，１２ ０００ｇ，
１２ｍｉｎ，倒掉上清；加１２０μＬ ７０％乙醇，离心，１２ ０００ｇ，
１２ｍｉｎ，重复２次，吹干，最终溶于无菌去离子水中。取
目的基因片段９μＬ，质粒３μＬ，连接液１２μＬ混匀，１６℃
过夜连接。取０．５μＬ过夜连接产物，加入到５０μＬ大肠
杆菌ＤＨ５α感受态细胞中，轻旋，冰浴３０ｍｉｎ，放入４２℃
水浴锅热激９０ｓ，立即冰浴３ｍｉｎ，加入ＬＢ液体培养基
１ｍＬ，３７℃振荡培养１ｈ。取５００μＬ转化液涂布于含有
卡那霉素（０．０３ｇ／Ｌ）的ＬＢ固体平板培养基上，３７℃将
平板正置２０ｍｉｎ，待菌液完全被吸收后倒置过夜培养。
将长出的菌落转移到新的含有卡那霉素的ＬＢ固体培养
基并编号，待其长成单个菌落再进行验证。挑取再长出
来的菌落液体培养，提取质粒（质粒ＤＮＡ提取试剂盒），
采用琼脂糖凝胶电泳的方法，将提取出来的质粒与原始
质粒对比，选出比原始质粒条带高的菌落，将其质粒进
行酶切验证和质粒ＰＣＲ验证。以已经插入上游臂的质
粒（ｐＴＮ１８２－Ｃ３Ｈ１）为载体，使用ＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩ ２种限制
性内切酶，酶切体系见表３，采用与插入上游臂相同的方
法插入下游臂并进行验证。最终构建好Ｃ３Ｈ１－ＰＴＮ１８２－
Ｃ３Ｈ２敲除载体，见图１。为进一步验证载体构建是否
成功，以Ｃ３Ｈ１－ＰＴＮ１８２－Ｃ３Ｈ２质粒为模板，ＰＣＲ扩增
出Ｃ３Ｈ１－ｎｐｔⅡ?Ｃ３Ｈ２目的基因片段送到上海生工进行
测序。
表３ 酶切体系
药品 体积／μＬ 总体积／μＬ
酶（ＸｈｏＩ、ＥｃｏＲＶ、ＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩ） ２
ｂｕｆｅｒ ４
质粒（ＰＴＮ１８２、ｐＴＮ１８２－Ｃ３Ｈ１） １６
无菌去离子水 １８
４０
１．２．４ Ｃ３Ｈ１－ｎｐｔⅡ?Ｃ３Ｈ２基因ＰＣＲ条件设计 通
过ＰＣＲ方法获得Ｃ３Ｈ１－ｎｐｔⅡ?Ｃ３Ｈ２目的基因片段，
研究影响ＰＣＲ产物特异性的引物浓度和退火温度。
引物浓度分别选择０．０８、０．１０、０．１２、０．１４、０．１６、０．１８、
０．２０、０．２２μｍｏｌ／Ｌ；退火温度设置温度梯度为５６～
６０℃（表４）。ＰＣＲ反应后，取一定量的ＰＣＲ产物采用
琼脂糖凝胶检测。以上ＰＣＲ条件重复进行３次以确
认重现性。
表４ ＰＣＲ温度梯度
序号 １ ２ ３ ４ ５ ６
温度／℃ ５６．０ ５６．３ ５７．０ ５７．８ ５９．１ ６０．０
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北方园艺２０１６（０５）：１１３～１１８ ·生物技术·
图１ Ｃ３ Ｈ基因敲除载体构建策略图
注：Ｍ，ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ，１～４为提取小立碗藓总ＤＮＡ。
图２ 小立碗藓总ＤＮＡ电泳图
２ 结果与分析
２．１ 小立碗藓总ＤＮＡ与原始质粒检测
由图２可知，经过０．７％的琼脂糖凝胶电泳检测，小
立碗藓基因组ＤＮＡ条带清晰，可以看到点样孔有一定
的亮度，推测可能有少量蛋白质的残留。以此为模板进
行ＰＣＲ扩增，可以扩增出目的基因片段。因此，蛋白质
的少量残留对目的基因的扩增影响不大，可以用来做
ＰＣＲ反应的模板。
由图３可知，经过０．７％的琼脂糖凝胶电泳检测，用
质粒提取试剂盒提取的ｐＴＮ１８２原始质粒条带清晰，可
以用来做酶切。
注：Ｍ，ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ，１为ｐＴＮ１８２原始质粒，２～４为大肠杆菌扩增
得到的ｐＴＮ１８２原始质粒。
图３ 提取ｐＴＮ１８２原始质粒电泳图
２．２ Ｃ３ Ｈ基因上、下游臂ＰＣＲ扩增产物测定
由图４、５可知，ＰＣＲ产物经过０．７％的琼脂糖凝胶
电泳检测，分别获得１个特异性条带，图４条带大小与上
游臂７３５ｂｐ相符，图５条带大小与下游臂７００ｂｐ相符，
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·生物技术· 北方园艺２０１６（０５）：１１３～１１８
注：Ｍ，ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ，１～３为Ｃ３ Ｈ基因上游片段ＰＣＲ产物。
图４ Ｃ３ Ｈ基因上游片段ＰＣＲ产物电泳图
注：Ｍ，ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ，１～３为Ｃ３ Ｈ基因下游片段ＰＣＲ产物。
图５ Ｃ３ Ｈ基因下游片段ＰＣＲ产物电泳图
上、下游臂的ＰＣＲ产物电泳条带单一，没有引物二聚体。
因此，可以用此ＰＣＲ产物进行酶切反应。
２．３ Ｃ３ Ｈ基因上游臂插入结果鉴定
将第２次在含卡那霉素的ＬＢ培养基上长出的单个
的菌落，挑到含卡那霉素的液体ＬＢ培养基中进行过夜
培养，提取质粒验证结果如图６。１泳道的是ｐＴＮ１８２原
始质粒，２泳道是为提取的阳性菌落的质粒，２泳道的质
粒条带位置明显的高于１泳道的质粒条带，说明２泳道
的质粒的长度要大于１泳道的，上游臂可能插入到了原
始质粒中。
以ＸｈｏＩ、ＥｃｏＲＶ ２种限制性内切酶酶切图５中２泳
道的提取质粒并采用琼脂糖凝胶验证，图７表明，酶切
质粒可以切下２种长度的片段，较长的与ｐＴＮ１８２原始
质粒长度相当，短的与上游臂的长度相仿。以图６中２
泳道提取质粒为模板、Ｃ３Ｈ１－Ｆ、Ｃ３Ｈ１－Ｒ为引物进行
ＰＣＲ验证，图８显示，ＰＣＲ产物的长度也与上游臂长度
相当。通过上述验证，证明上游臂插入到了ｐＴＮ１８２原
始质粒中。
注：Ｍ，ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ，１为ｐＴＮ１８２原始质
粒，２为提取阳性菌落质粒。
图６ 质粒验证电泳图
注：Ｍ，ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ，１～４为ＰＣＲ产物。
图８ ＰＣＲ验证电泳图
注：Ｍ，ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ，１为ｐＴＮ１８２原始质
粒，２～５为酶切产物。
图７ 酶切验证电泳图
２．４ Ｃ３ Ｈ基因下游臂插入结果鉴定
将已经插入上游臂的质粒ｐＴＮ１８２－Ｃ３Ｈ１作为插
入下游臂的载体。将第２次在含卡那霉素的ＬＢ培养
基上长出的单个菌落，挑到含卡那霉素的液体ＬＢ培
养基中进行过夜培养，提取质粒验证结果如图９，１泳
道的是ｐＴＮ１８２原始质粒，２泳道是含有上游臂的
ｐＴＮ１８２－Ｃ３Ｈ１质粒，３泳道为提取的阳性菌落的质粒，３
泳道的条带位置明显高于２泳道的质粒。下游臂可能
插入到含有上游臂的ｐＴＮ１８２－Ｃ３Ｈ１质粒中。
以ＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩ ２种限制性内切酶酶切图９中３泳
道中提取的质粒进行验证，图１０表明，经过酶切在提取
的质粒中切下２种长度的片段，较长的与ｐＴＮ１８２－Ｃ３Ｈ１
质粒长度相当，短的与下游臂的长度相仿。以图９中３
泳道的提取质粒为模板、Ｃ３Ｈ２－Ｆ、Ｃ３Ｈ２－Ｒ为引物进行
ＰＣＲ验证，图１１表明，ＰＣＲ产物的长度与下游臂长度相
当。通过上述验证，证明下游臂插入到了ｐＴＮ１８２－Ｃ３Ｈ１
６１１
北方园艺２０１６（０５）：１１３～１１８ ·生物技术·
注：Ｍ，ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ，１为原始质粒，２为
ｐＴＮ１８２－Ｃ３Ｈ１质粒，３为提取阳性菌落质粒。
图９ 质粒验证电泳图
注：Ｍ，ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ，１～４为质粒ＰＣＲ
产物。
图１１ ＰＣＲ验证电泳图
注：Ｍ，ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ，１～２为酶切产物。
图１０ 酶切验证电泳图
质粒中，上、下游臂均插入到ｐＴＮ１８２载体中。
２．５ Ｃ３Ｈ１－ｐＴＮ１８２－Ｃ３Ｈ２目的基因最佳ＰＣＲ条件的
筛选
２．５．１ 引物浓度 由图１２可知，采用不同浓度的引物
进行ＰＣＲ仍出现非特异性的条带，说明改变引物的浓度
不能提高ＰＣＲ产物的特异性。
注：Ｍ，Ｍａｒｋｅｒ，１～８，引物浓度为０．０８、０．１０、０．１２、０．１４、０．１６、０．１８、
０．２０、０．２２μｍｏｌ／Ｌ。
图１２ 不同的引物浓度ＰＣＲ产物电泳图
２．５．２ 退火温度 不同的退火温度对ＰＣＲ反应的影响
结果见图１３。ＰＣＲ反应中退火温度决定反应的灵敏性
和特异性，试验中退火温度为５６～６０℃，在５７．８℃和
６０．０℃特异性最高，同时５７．８℃比６０℃时目的条带更明
亮，说明ＰＣＲ产物浓度更大。因此，选择５７．８℃作为
ＰＣＲ反应的退火温度。
３ 讨论
３．１ 酶切位点的选择及Ｃ３Ｈ１－ｎｐｔⅡ?Ｃ３Ｈ２载体的构建
通过基因重组来取代小立碗藓中的Ｃ３Ｈ基因，将小立
注：Ｍ，Ｍａｒｋｅｒ，１～６，退火温度分别为５６．０、５６．３、５７．０、５７．８、５９．１、
６０．０℃。
图１３ 不同的退火温度对ＰＣＲ产物电泳图
碗藓Ｃ３Ｈ的全基因分成上游臂（Ｃ３Ｈ１）和下游臂（Ｃ３Ｈ２）分
别插入到ｐＴＮ１８２质粒ｎｐｔⅡ基因的两端，最终得到与小
立碗藓Ｃ３ Ｈ 基因进行重组替换的Ｃ３ Ｈ１－ｎｐｔⅡ?Ｃ３ Ｈ２
基因。
在构建载体的过程中发现，酶切位点的设计对载体
构建效率的影响很大。由于考虑到选择比较常用的酶
切位点和其它一些问题，上游臂选择ＸｈｏＩ、ＥｃｏＲＶ ２种
酶切位点。总共挑取２０个阳性单菌落液体培养，提取
２０个单菌质粒，其中５个单菌落中提取的质粒电泳条带
高于原始ｐＴＮ１８２质粒，插入率为２５％。下游臂选择
ＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩ ２种酶切位点，以已经插入上游臂的
ｐＴＮ１８２－Ｃ３Ｈ１质粒作为插入下游臂的载体，操作与上游
臂相同，经过多次试验都没有筛选得到插入下游臂的菌
株，有阳性菌株但都是只插入了上游臂的菌株。排除菌
株、转化等问题，通过查找文献，考虑最有可能的原因是
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·生物技术· 北方园艺２０１６（０５）：１１３～１１８
酶切反应出问题。原因可能为限制性内切酶失活；酶切
反应时间；单酶切过程２种限制性内切酶酶切顺序；酶
切位点设计［８］。验证２种限制性内切酶活性：采用一种
限制性内切酶（２种酶都验证）酶切环状质粒，将产物采
用凝胶电泳验证只得到单一的条带，证明质粒被切开，
限制性内切酶活性没有问题。通过上述试验说明酶切
时间也没有问题。
改变单酶切过程２种限制性内切酶酶切顺序：其中
先用ＮｄｅＩ酶切，再用ＢａｍＨＩ酶切，得到６０个阳性单菌
落，其中只有１个阳性菌落提取的质粒通过验证插入了
下游臂，插入率仅为１．７％。先用ＢａｍＨＩ酶切，再用
ＮｄｅＩ酶切，并未筛选到插入了下游臂的菌株。虽然最终
筛选得到插入下游臂的菌株，但工作量大且插入率太
低，增加了构建载体的工作量。
酶切位点的设计，通过查找文献发现：下游臂选择２
个酶切位点相邻太近，虽没有共用碱基但仍影响酶切的
效率［９］。因此，在选择酶切位点时尽量选择有间隔的酶
切位点，如若只能选择挨着的酶切位点，可以采用单酶
切方法，尝试改变单酶切过程２种限制性内切酶酶切
顺序以提高试验成功的概率，同时也提高载体构建的
效率。
３．２ 目的基因ＰＣＲ条件的筛选
Ｃ３Ｈ１－ｎｐｔⅡ?Ｃ３Ｈ２基因长度约为３．５ｋｂ，以质粒为
模板，Ｃ３Ｈ１－Ｆ、Ｃ３Ｈ２－Ｒ为引物ＰＣＲ扩增，通过凝胶电泳
检测发现，除目的条带外，同时还出现１条非特异性的
条带，浓度低于目的条带，影响ＰＣＲ产物的质量。为提
高ＰＣＲ反应的特异性，在不重新设计引物的前提下，考
虑影响最大的２个因素：引物浓度和退火温度。
从结果中可以看到，通过改变引物浓度来提高目的
基因特异性效果不明显，但引物的浓度会影响产物的
ＰＣＲ产物的浓度，因此在设计ＰＣＲ反应体系是要充分
考虑到引物浓度的问题。退火温度的选择最终决定
ＰＣＲ产物的特异性，同时也影响到了ＰＣＲ产物的浓度。
因此，在ＰＣＲ反应中如果有目的条带但同时出现非特异
性条带，为提高试验效率可以先考虑改变退火温度来提
高特异性。
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Ｏｐｔｉｍｕｍ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ＰＣＲ ｆｏｒ Ｃ３Ｈ１－ｎｐｔⅡ?Ｃ３Ｈ２ Ｔａｒｇｅｔ Ｆｒａｇｍｅｎｔ
ＣＵＩ Ｃａｉｙｕｎ，ＹＡＮ Ｇｕｏｈｏｎｇ，ＪＩＡＮＧ Ｓｈａｎ
（Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕｉｙａｎｇ，Ｇｕｉｚｈｏｕ ５５０００１）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔａｋｉｎｇ Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌａ ｐａｔｅｎｓ ａｓ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍａｔｅｒｉａｌｓ，ｔｈｅ ｆｕｌ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｃ３ Ｈｔｈａｔ ｗａｓ １ ９８１ｂｐ ｉｎ ｔｈｅ
Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌａ ｐａｔｅｎｓ ｗｏｕｌｄ ｂｅ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ｕｐｓｔｒｅａｍ ｆｒａｇｍｅｎｔ（１ ０００ｂｐ），ｔｈｅ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｆｒａｇｍｅｎｔ（９８１ｂｐ）．Ｐｒｉｍｅｒｓ
ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｗｉｔｈ ｕｐｓｔｒｅａｍ ａｎｄ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｆｒａｇｍｅｎｔ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｈａｌｆ ｗａｓ ｎａｍｅｄ ｕｐｓｔｒｅａｍ ａｒｍ（Ｃ３Ｈ１，７３５ｂｐ）
ａｎｄ ｔｈｅ ｌａｔｔｅｒ ｈａｌｆ ｗａｓ ｃａｌｅｄ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ａｒｍ （Ｃ３Ｈ２，７００ｂｐ）．Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ＤＮＡ ｏｆ Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌａ ｐａｔｅｎｓ ｔｏ
ｔｅｍｐｌａｔｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｐｒｉｍｅｒ ｏｆ Ｃ３Ｈ１ａｎｄ Ｃ３Ｈ２，ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｃ３Ｈ１ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ａｄｄｉｎｇ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｓｉｔｅ ｗａｓ ＸｈｏＩ ａｎｄ
ＥｃｏＲＶ ａｎｄ Ｃ３Ｈ２ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ａｄｄｉｎｇ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｓｉｔｅ ｗａｓ ＮｄｅＩ ａｎｄ ＢａｍＨＩ ｂｙ ＰＣＲ．Ｔｈｅ Ｃ３Ｈ１ａｎｄ Ｃ３Ｈ２ｗｅｒｅ ｉｎｓｅｒｔｅｄ
ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｐＴＮ１８２ｖｅｃｔｏｒ ａｎｄ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｖｅｃｔｏｒ（Ｃ３Ｈ１－ｐＴＮ１８２－Ｃ３Ｈ２ｐｌａｓｍｉｄ）ｗａｓ ｓｕｃｃｅｅｄ．Ｃ３Ｈ１－ｎｐｔＩＩ－Ｃ３Ｈ２ｆｒａｇｍｅｎｔ
ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ＰＣＲ，Ｔｈｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｉｍｅｒ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎｎｅａｌｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｔｈａｔ ｈａｄ ａｎ ｅｆｅｃｔ ｏｎ ｔｈｅ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｏｆ ｔｈｅ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ ｗａｓ ｂｙ ｔｈｅ ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ ｗａｓ ｈｉｇｈｅｒ ｗｈｅｎ ｐｒｉｍｅｒ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｗａｓ ０．２０μｍｏｌ／Ｌ ａｎｄ ａｎｎｅａｌｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｗａｓ
５８．７℃．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌａ ｐａｔｅｎｓ Ｃ３ Ｈｇｅｎｅ；ｇｅｎｅ ｋｎｏｃｋ ｏｕｔ；ｖｅｃｔｏｒ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ；ａｎｎｅａｌｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ
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