全 文 ：第 3 5卷第 4期
2 0 0 6年 8月
上海师范大学学报 (自然科学版 )
JO u m la fO s h na hg ai N
o n l l a 1 Uni v e功 ity ( N咖 rla 豁 e ~ )
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3 5
.
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4
2 0 0 6
,
Au g
.
植物激素对小立碗醉愈伤组织诱导及分化影响
陈静文` , 曹 同’ , 施定基“
( 1
. 上海师范大学 生命与环境科学学院 , 上海 2X() 2 34 ; 2 . 中国科学院植物研究所光合作用研究中心 , 北京 10以为3 )
摘 要 : 小立碗拜 ( 尸入” co m “ er l la aP et sn ( H ew d . ) B . 5 . G . )作为独特的模式植物在分子生物
学研究中被广泛应 用 . 本实脸以 改良的 Kh o p 培养基为基本培养基 ,研究添加不同种类和浓度
配比的植物激紊对小 立碗茸愈伤组织诱导及分化的影响 . 实脸结果表明 : 当糖浓度为 2% , 添
加 KT 0
.
05 m g
·
L
一 ’ 或添加 6 一B A O . 05 m g · L 一 ’ , 在温度 ( 25 土 1 )℃ ,光照强度 3仪均 一 4以x〕h ,
光照周期 12 / 12 丫 d 条件下培养 ,诱导小 立碗醉愈伤组织的效果最为理想 . 诱导愈伤组织分化
的实验结果表明 : 未添加任何植物激素的肠叩 培养基上分化出正常的配子体且数童最多 . 添
加 2 , 4 一D 或 IA A 的培养基上能长出较多的原丝体 .
关锐词 : 茸类植物 ;,J 、立碗醉 ;组织培养 ;愈伤组织 ;激素 ;分化
中圈分类号 : 伪 46 . 8 文献标识码 : A 文章编号 : l姗悦 37( o2 6) 04姗 o刁 5
小立碗醉 ( Ph ys c o m ietr al aP t en 。 ( Hde w . ) B . 5 . C . )隶属于苔醉植物中的鲜纲 、 葫芦醉 目、 葫芦醉
科 、小立碗醉属川 ,分布于欧洲 、北美洲 、 亚洲 、 非洲及大洋洲等地 〔2 一 4 } ,经分类修订后 ,种下有 4 个亚
种 〔, l ,我国湖南省张家界地区有其加洲亚种 ( P . p a t e n s ( H e dw . ) B . 5 . G . s u b s p · e al ifo m ic a · ( C ur m e t A n -
ds o on ) T an )的分布记录 〔` 一 ’ ] . 小立碗醉是迄今为止同源重组频率最高的陆生植物 , 它的基因组为
5 1 1M b
,是拟南芥的 4 倍 [,] ,和水稻基因组相差不多 〔’ “ 〕 , 染色体为 27 条 〔川 . 近年来 shc ae fe : D G 等研究
证明其同源重组频率和酵母差不多 ,是拟南芥的 l以x〕倍〔’ 2〕 . 因此小立碗醉提供了研究基因功能的工
具 , 已成为功能基因组学研究的模式植物汇’ 3 ] . 而小立碗醉的人工组织培养是深人开展研究的基础 , 国内
外有一些研究报道 . Ho lot fr 用半自动生物反应器培养小立碗醉 〔’ 4长H o h e 用生物反应器来培养小立碗醉
并研究了如何调控细胞分化和植物生长 〔” ] ; R es ik 研究了绿丝体和轴丝体上芽的诱导 〔’ ` ] . 国内潘一
廷 〔” ]等初步报道了小立碗醉愈伤组织诱导和组织培养的基本条件 ,并观察了其愈伤组织的亚显微结
构 . 本文主要研究了不同植物激素和浓度配比对小立碗鲜愈伤组织的诱导及分化的影响 ,为小立碗醉植
物组织培养扩繁和资源的开发利用进一步提供科学依据和实验方法 .
1 材料和方法
1
.
1 材料
小立碗醉由施定基教授从国外实验室中获得并转赠 ,在本实验室无菌条件下培养 ,切取茎尖作为供
试材料 .
收稿 日期 : 2X( 拓刁 3一 10
甚金项目: 国家自然科学基金西部重大项 目( 0 20 20 19) 和面上项目 ( 30 370 11 , 30 17X() 7 6 )资助 .
作者简介 : 陈静文 ( 19 80 一 ) ,女 ,上海师范大学生命与环境科学学院硕士研究生 ; 曹同 ( 19 46 一 ) ,男 ,上海师范大学
生命与环境科学学院教授 ,博士生导师 .
第 4期 陈静文 , 曹 同 , 施定基 : 植物激素对小立碗辞愈伤组织诱导及分化影响 71
1
.
2 方法
本次所有试验均以改良的 K力o p 培养基 〔’ 吕]为基本培养基 , P H 6 . 5 , 固体培养基中琼脂为 0 . 8% . 培
养条件为 :培养温度 ( 25 士 l) ℃ ,光照强度 3 (XX) 一 4以X )h ,光照周期 12 / 12 丫 d .
1
.
2
.
1 不同激素配比对愈伤组织的影响
选用了 2 , 4 一D 、 6 一B A 、 KT 、 IA A 、 BI A 、 N AA 这 6 种植物激素来诱导小立碗醉的愈伤组织 ,其中 2 , 4 一 D 、
IA A
、
BI A 和 N A A 是人工合成生长素 , 6 一 B A 和 KT 是细胞分裂素 . 培养 3d0 后发现 6 一B A 和 K T 可诱导小
立碗醉脱分化形成愈伤组织 ; 2 , 4 一D 、认A 和 BI A 可促进小立碗醉的分枝 ;而 NA A 会抑制小立碗醉的生
长 ,使植株褐化 于是选用有诱导愈伤组织作用的 6 一BA 和 KT , 6 一BA 浓度为 o , 0 . 05 mg · L 一 ’ (单位下
同 ) , 0 . 1 , 0 . 5 , 4 个水平 ; KT 浓度为 O , 0 . 05 , 0 . 1 , 0 . 5 , 4 个水平 ;设置了 4 个葡萄糖浓度 O , 0 . 5% , l % ,
2 %
,配制成 16 种不同植物激素浓度配比的培养基 , 以筛选出最佳诱导愈伤组织的配比方案 (表 1) . 将
切取的茎尖接在 16 种培养基上 ,每一处理接 10 个 ,光照培养箱培养 ,每 7d 转接一次 ,培养 ZOd 后观察
愈伤组织诱导率和褐化率 ,诱导率越高表明该种激素配比适合用来诱导小立碗醉的愈伤组织 ,相反褐化
率越高则表明该种激素配比会导致愈伤组织的褐变促使其死亡 .
表 l 不同激素配比培养基表
培养基号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 1 12 1 3 14 15 16
糖浓度 ( % ) 0 0 0 0 0 . 5 0 . 5 0 . 5 0 . 5 1 . 0 1 . 0 1 . 0 1 . 0 2 . 0 2 . 0 2 . 0 2 . 0
6
一
B A ( m g
·
L
一 ’
) 0 0
.
05 0
·
10 0
·
5 0 0 0
.
0 5 0
.
10 0
.
5 0 0 0
.
05 0
.
10 0
.
5 0 0 0
.
0 5 0
.
10 0
.
5 0
KT ( m g
·
L
一 ,
) 0 0
.
05 0
.
10 0
.
5 0 0
.
10 0
.
5 0 0 0
.
05 0
.
5 0 0
.
10 0
.
05 0 0
.
0 5 0 0
.
5 0 0
.
10
1
.
2
.
2 愈伤组织的分化
选取在愈伤组织诱导实验中生长状况良好 ,大小一致的愈伤组织 ,转人添加不同植物激素的分化培
养基上 . 在分化实验中 ,选用有诱导愈伤组织作用的 6 一B A 、 KT ;可促进茎尖分枝的 2 , 4 一 D ,认 A ,共 4 种植
物激素 . 经过初步的实验 ,发现 2 , 4 一D 和 I从 可分化出原丝体 , 而原丝体正是分子生物学实验所用的材
料 ,所以对 2 , 4 一D 和 IA A 的浓度与分化原丝体之间的关系进行进一步探讨 (表 2 ) . 每一处理接 5 个 , 3d0
后统计愈伤组织的分化情况 .
表 2 不同激素浓度的分化培养基
培养基号 17 18 1 9 20 2 1 22 2 3 24 25
6
,
B A (哪 · L 一 ’ ) 0
KT ( m g
·
L
一 ,
) o
0
.
5 0 0 0 0 0
0 0
.
5 0 0 0 0
2
,
4
·
D ( m g
·
L
一 ’ l ) o 0 0 0
.
5 0 0
.
05 0 0 0
IA A (哪 · L 一 , ) 0 0 0 0 0 . 5 0 0 0 . 0 5 0 .
2 结果与分析
2
.
1 不同激紊配比对愈伤组织的影响
在 16 种不同的激素配比中 ,添加葡萄糖的培养基中诱导出的愈伤组织较大 , 这说明葡萄糖提供了
愈伤组织生长所需的碳源 ( 图 1 ) . 除 1号培养基外 ,其余 巧 个培养基中的小立碗辞都诱导出了愈伤组
织 ,诱导率为 10 % ;2 一 4 号培养基中的愈伤组织小 , 且褐化严重 , 褐化率为 10 % ; 7 , 8 , 12 号培养基中
的愈伤组织较大 ,结构紧密 ,但褐化情况严重 ,褐化率为 95 % ; 9 , 1 1 ,巧 , 16 号培养基中的愈伤组织较大 ,
结构较为松散 ,褐化率约为 85 % . 6 和 or 号培养基中的愈伤组织体积大 ,结构紧密 ,褐化率为 75 % ; 5 和
上海师范大学学报 (自然科学版 ) 2以拓年
14 号培养基中的愈伤组织大 ,结构松散 ,褐化率较低 , 约为 50 % ; 13 号培养基中愈伤组织结构紧密 ,褐
化率最低 ,仅为 15 % .
用生物统计学中的直观分析法分析试验结果 ,从褐化率看 6 一 B A 的 R 值为 56 . 25 , KT 的 R 值为
26
.
25
, 因此对小立碗醉愈伤组织的褐化影响 6 一B A 的作用比 KT 明显 , 从各因素的水平看 , 当糖浓度为
2% 时 ,添加单一低浓度激素诱导小立碗醉愈伤组织的形成效果较为理想 .
图 1 16 种培养基上小立碗辞愈伤组织的诱导
2
.
2 植物激素对愈伤组织分化的影响
将小立碗醉愈伤组织转人含不同植物激素的分化培养基上 . 结果表明 : 未添加任何激素的 nK叩 培
养基上的愈伤组织分化情况最好 ,生长出的新植株最多且生长状况良好 ( 图 2 ) ;添加 6 一B A 的培养基上
愈伤组织没有分化 ,说明 6 一 BA 对愈伤组织的分化不起作用 ;添加 KT 的培养基上能分化出少量的配子
体 ;添加 2 , 4 一 D 和 I从 的培养基上都能分化出配子体和原丝体 ,但浓度不同时所分化的结果也有区别 ,当 2 , 4 一OD . 05 m g · L 一 ’ 和 IA OA . l m g · L 一 ’ 时 , 分化出的原丝体较多 .
表 3 植物激素对愈伤组织分化的影响
培养墓号 17 18 19 20 2 1 2 2 2 3 24 25
分化出配子体
分化出原丝体
十 + + + 十 + + + +
+ + + + 十 + + +
注 : + 表示有 ; + 十表示较多 ; + + + 表示很多 ; 一表示无
3 结 论
3
.
1 不同滋素配比对愈伤组织的影响
在这 16 种不同植物激素配 比的培养基中 , 当糖浓度为 2% 时 , 添加 6 一BA 0 . 05 m g · L 一 ’ 或 KT
0
.
05 mg
·
L
一 ’ ,愈伤组织诱导率为 10 % ,且褐化率较低 ,诱导效果最佳 . 6 一B A 和 KT 都是细胞分裂素 , 在
高等植物中起着促进细胞分裂及横向增粗等功能 ,但由于苔醉植物是低等植物向高等植物演替的植物 ,
没有真正的根 、茎 、 叶分化及维管束 , 因此细胞分裂素未能产生类似在高等植物中的那些作用 . 在苔醉植
第 4期 陈静文 , 曹 同 , 施定基 : 植物激素对小立碗辞愈伤组织诱导及分化影响
簸
图 2 愈伤组织在 KnoP 培养基上分化出的配子体
图 3 在 K n叩 十 2 , 4 一 D培养基上分化出的原丝体
图 4 小立碗醉具抱子体的植物体
物中 , 6 一B A 和 KT 抑制了植物的分化 ,在植物伤口处产生脱分化现象 , 从而形成了愈伤组织 , 但高浓度
的细胞分裂素会使愈伤组织褐化 , 加速其死亡 ,只有适当浓度的细胞分裂素才能使愈伤组织保持脱分化
并进一步增殖 .
3
.
2 植物激紊对愈伤组织分化的影响
通过分化实验 ,发现不含激素的 nK 叩培养基即可形成正常的配子体 ,说明小立碗醉愈伤组织分化
成正常的配子体比高等植物容易 ,这与李文安在对地钱进行分化实验中所得到的结果相一致〔” 〕 ;在添
加 2 , 4 一D 和 IA A 的培养基上可分化得到原丝体 . 2 , 4 一 D 和 IA A 属于人工合成的生长素物质 ,能使愈伤组
织停止脱分化 ,并促进细胞分裂 , 产生新的植株 . 苔醉植物有着特有的原丝体阶段 , 在分子生物学实验
中 ,小立碗醉的原丝体是主要的实验材料 ,在小立碗醉基因打靶实验中 , 要求其转化材料— 原丝体是同一发育阶段 ,转化材料的大量获得和发育阶段同一性是实验成功的关键 . 通过实验 , 发现 2 , 4 一D 和
认 A 的浓度与分化出原丝体的量有一定的关系 , 当添加 2 , 4 一D o . 05 m g · L 一 ’或 I从 0 . l m g · L 一 ’ 时 ,所得
的原丝体是最多的 . 因此 ,通过愈伤组织的分化可得到大量生长状况一致的原丝体用于实验研究 .
本实验采用小立碗醉茎尖作为外植体 ,研究愈伤组织诱导的最适培养条件 ,进而诱导其分化形成正
常的配子体 ,并在室外培养下得到抱子体 ,完成了整个生活史 . 对小立碗醉快繁的研究进行了初步探讨 ,
以期在较短时间内得到大量小立碗醉植株及其原丝体 ,作为分子生物学实验的材料 .
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(责任编辑 : 吴 澄 )