全 文 ：遗　传 HEREDITAS(Beijing)26(4):560～ 566 , 2004 专论与综述
收稿日期:2003 05 23;修回日期:2003 09 30
基金项目:国家自然基金资助项目(39970407)[ Suppored by the National Natu ral Foundation of China(No.39970407)]
作者简介:董　文(1976-),男 ,在读博士生 ,细胞生物学专业。 E-mail:w donglz@163.com
通讯作者:郭光沁(1968-),男 ,博士 ,教授 ,细胞生物学专业。 E-mail:xbyjs@lzu.edu.cn
苔藓植物小立碗藓 ,功能基因组学研究新的模式系统
董　文 ,李　卫 ,郭光沁 , 郑国
(兰州大学细胞研究所 ,兰州 730000)
摘　要:苔藓植物具有相对简单的发育模式 , 单倍体的配子体在其生活史中占主导地位 ,作为研究植物生物学过程
的模式系统具有诸多的优越性。苔藓植物小立碗藓能够高效地通过同源重组的方式将外源核酸整合到其核 DNA ,
这就使得基因打靶在此物种中就像在小鼠胚胎干细胞和酵母中一样成为一个非常便利的技术。另外由于小立碗
藓与高等植物在生物特征上有很大相似之处加之具有其他诸多优越性 , 它有望成为一个诱人的植物生物学和功能
基因组学研究的模式系统。
关键词:功能基因组学;反求遗传学;基因打靶;模式系统;苔藓植物;小立碗藓
中图分类号:Q933　　　文献标识码:A　　　 文章编号:0253-9772(2004)04-0560-07
The Moss Physcomitrella patens , a New Model System
for Functional Genomics
DONG Wen , LI Wei , GUO Guang-Qin , ZHENG Guo-Chang
(Institute of Cell B iology , Lanzhou University , Lanzhou 730000 , China)
Abstract:The potential of moss as a model system to study plant biological process is associated with their relatively
simple developmental patternand the dominance of the haploid gametophyte in the life cycle.The mossPhyscomi trella
patens exhibits a very high rate of homologous recombination in its nuclear DNA , making gene targeting approaches in
this plant as convenient as in yeast or inES cel ls of mice.Shar ing many biolog ical features with higher plants and hav-
ing many other advantages , the moss Physcomi trella patens wil l be an attractive model system for plant biology and
functional genome analysis.
Key words:functional genomics;reverse genetics;gene targeting;model system;moss;Physcomi trella patens
　　从原核生物大肠杆菌到真核高等植物拟南芥等
模式系统基因组核酸序列测定已完成[ 1 ～ 4] ,尤其是
新近人类基因组计划和水稻基因草图的完成倍引瞩
目。这方面努力的最终目标是建立特定物种的基因
图谱 ,并对其所对应的基因功能进行研究。可以预
见将有更多的基因组序列被测定 , 而下一步摆在科
学工作者面前的任务即是揭示所测核酸序列的功
能 ,即被称作后基因组学(post-genomics)或功能基
因组学(functional genomics)。目前有多种方法用于
这方面的研究[ 5] ,而在已知核酸序列的情况下研究
其功能的反求遗传学(reverse genetics)方法目前来
说是最为有效的。所谓的反求遗传学即就是在已知
核酸序列的基础上 ,在特定的可译框(ORF)的特定
位点实现突变而获得基因功能缺失突变体来研究其
造成的表型效应 ,这反过来就可以确定这一核酸序
列的功能。而实现定点突变的方法就是所谓的基因
打靶(gene target ing),即通过同源重组将外源 DNA
序列整合到宿主基因组的特定位点 ,实现原基因的
插入突变或其特定序列被替换。由于其结果的可预
见性和准确性 ,此技术已经成为细菌 、酵母 、少数种
DOI :10.16288/j.yczz.2004.04.029
类丝状真菌及哺乳类基因功能研究中的核心技术 ,
并取得了不菲的成果[ 6 ～ 11] 。尤其是在酿酒酵母 S .
cerevisiae中基因的打靶的频率(同源重组占所有被
转化个体的百分数)最高可达到 95%。而在哺乳类
动物中利用基因打靶实现基因敲除(genes knock-
out)进而实现基因功能的研究也已成为一项常规技
术。Smithies 和 Capecchi研究小组研究发现在小鼠
胚胎干细胞(ES)中 ,基因打靶的频率可达 0.1%～
10%[ 12 ,13] 。这些开创性的工作再加之它做为试验
材料的其他优越性 ,小鼠已成为哺乳类动物研究的
模式系统 。通过基因打靶技术已经在小鼠中获得上
千种基因缺失突变体 。大量的试验表明小鼠胚胎干
细胞中基因打靶的频率可达 10-2或更高[ 14～ 16] 。然
而由于外源 DNA在高等植物基因组中通过随机整
合的方式而整合入随机位点 ,不管是直接的基因转
化(如利用 PEG 介导的原生质体转化 、电穿孔法及
其利用基因枪法对其各种组织进行转化[ 17 ,18])或者
利用农杆菌 T-DNA 介导的遗传转化[ 19 , 20] ,不管是
在人工位点[ 17 ,19]还是在自然位点[ 20] ,基因打靶的
频率都非常低 ,大概在 10-4 ～ 10-5 ,这一数字与转
化方法及植物种类和组织类型有关 。这使得要在大
量的转化株中查找基因打靶突变体极为困难 ,所以
基因打靶技术在普通的高等植物分子生物学研究中
难以成为一个常规技术[ 21 ,22] 。但是与高等植物不
同 ,小立碗藓能够有效地将外源 DNA 片段通过同
源重组整合到其基因组[ 23] ,成为植物中通过同源重
组获得突变体的先例 , 是植物分子生物学研究的重
大突破。这是一个研究它的功能基因组学的有效工
具 ,目前这方面的研究已经初具规模 ,加之小立碗藓
在其他方面的优越性 ,有望成为植物功能基因组学
研究的模式系统 。
1　苔藓植物小立碗藓及其作为模式植
物的优越性
　　苔藓植物小立碗藓(Physcom itrella patens)能
够实现高效的基因打靶 ,这一部分将在下文作较详
细的讨论。除此之外 ,苔藓植物作为植物中的一个
特殊的类群在其他方面还有得天独厚的优越条件 ,
在此做一简要的论述。与蕨类植物及种子植物相
似 ,苔藓植物也具有世代交替 ,但是它的单倍体世代
即配子体世代占优势 。小立碗藓在人工培养条件下
的生活史如图所示(图 1)。其孢子(spore)萌发后形
成二维结构上的原丝体(protonema);其中刚萌发形
成的无分支 、具有大量叶绿体的原丝体被称之为绿
丝体(chloronema);其经过分支生长而形成含少量
未发育叶绿体而被称为无丝体(caulonema)的原丝
体;无丝体分化出芽 ,进而生长成为雌雄同株或异株
的单倍体个体。雌株(或雌枝)分化成颈卵器
(archegonia)进而分化成卵子 ,而雄株(或雄枝)分
化出精子器(antheridia)。成熟精子借助水游动到
卵子。卵受精后发育成营养半自主性的二倍体的孢
子体(sporophy te),孢子母细胞经过减数分裂分化成
单倍性的孢子。小立碗藓的每个孢蒴大概可形成
4000个孢子[ 24] 。有一个事实可能已被大家遗忘 ,
那就是无菌条件下首先获得再生植株是在苔藓植物
中实现的 ,目前对于苔藓植物尤其是小立碗藓的培
养转化体系已经比较完善。对它的转化大多是通过
对由绿丝体游离出的原生质体进行 PEG-介导的遗
传转化而实现的 。基因枪法 、显微注射法也已经发
展的比较成熟 ,但是对高等植物使用比较成熟的农
杆菌介导的转化在此物种尚未有成功的先例。苔藓
生殖周期短 ,小立碗藓在简单的培养基上大概 8周
可以完成一个生殖周期 ,一年可以完成几个生殖周
期 ,这可以大大的缩短试验周期 ,同时它的个体小 ,
有利于规模化培养和突变体筛选 。其单倍体的配子
体在其生活史中占主导地位 ,这将有利于突变的产
生和遗传性状的直接分析 ,很早以前就获得多种突
变体[ 25～ 28] ,即可充分说明这一点 。而且 ,它的有性
生殖产生的孢子体不但可以在适合的诱导条件下由
配子体发育而来 ,而且还可以直接通过无配子生殖
直接获得 ,即通过诱导孢子体组织再生成二倍体的
原丝体 ,在一些种中可以再生出孢蒴 ,进而产生单倍
体的孢子[ 29] 。虽然解剖结构简单 ,细胞种类少 ,组
织仅有几层细胞构成 ,但是它有复杂的形态学结构
和复杂的形态发生过程。如上所述 ,它的配子体发
育可分为两个阶段:原丝体阶段和配子体阶段。前
者是一个由单细胞连接构成的丝状网络结构 ,后者
是一个类似于高等植物的三维结构 ,具有复杂的器
官分化 ,可以从单细胞水平跟踪其发育过程 。这在
发育生物学研究上有极大的优越性。生长调节物如
细胞分裂素 、生长激素等及环境因子对苔藓植物的
发育调节与高等植物有类似的效果 ,可以以它为材
料对高等植物的生理生化过程进行间接研究。通过
流式细胞术研究表明小立碗藓基因组大小大概为
561　4 期　　　　　　　　　　　　董　文等:苔藓植物小立碗藓 ,功能基因组学研究新的模式系统
480 Mbp ,大约是拟南芥基因组大小的 3倍 ,分布在
27条 1 ～ 2 μm 长的小染色体上 ,目前世界上有两个
小立碗藓 EST(expressed sequence tags)库 ,大概共
收集 10 000多条序列 ,初步分析表明这些序列与高
等植物相对应的基因高度相似 。苔藓植物有极强的
再生能力 ,在小立碗藓及其他许多种类中 ,其植物体
的任何部分在适当的条件下都可以再生出原丝体 ,
通常是在植物组织上直接再生出绿丝体 ,不需要经
过愈伤组织形成和分化 ,可以说它的每一个细胞在
发育上都具有全能性 ,这有利于实现一些无法由有
性过程繁殖的突变体的种质保存 。而且 ,苔藓植物
尤其是小立碗藓(Physcomitrella patens)及葫芦藓
(Funaria hygrometrica)等种类的遗传 、发育 、生理
生化以及细胞学研究等方面已经积累了较为丰富的
资料 ,这些都为对其进一步研究打下了一定的基础 ,
这些研究大多集中在细胞分裂 、细胞生长 、细胞极性
化 、细胞的超微结构 、光形态建成 、对激素及重力的
反应 、信号传导途径 、质体发育以及器官发生等多个
领域 ,Cove[ 30]以及 Reski[ 31]对这些方面做了详尽的
论述。
图 1　培养条件下小立碗藓生活史
Fig.1　Simplified life cycle of Physcomitrella patens in culture
2　小立碗藓遗传转化及高效基因打靶
苔藓植物小立碗藓(Physcomitrella patens)能
够有效的将外源 DNA 片段通过同源重组整合到其
基因组[ 23] ,成为通过同源重组获得突变体的先例 。
这是植物分子生物学研究的一个重大突破 。通过
PEG 介导的原生质体转化 , 不管是在人工位
点[ 32 , 33]还是在自然位点[ 23] ,同源重组的频率可达
3% ～ 90%。这与酵母中的同源重组频率相
当[ 10 , 23 ,34] ,远高于小鼠胚胎干细胞[ 14] ,而在较高等
的植物中可称之为是一枝独秀[ 17 ～ 20 ,35～ 37] 。随后
的一些工作充分证明了这一方法对于植物基因功能
研究的有效性 。通过此技术目前已经在质体分
裂[ 38] 、不饱和脂肪酸生物合成[ 39] 、泛素依赖的蛋白
水解途径[ 40] 、光合作用[ 41]及嘌呤补救途径等[ 42] 几
个互不相关生物过程中基因功能的确定中被应用 。
不管是在动物中还是植物中 ,在基因水平上如
何调控真核生物细胞器的分裂的研究依然都是空
白。而在细菌中 ,FtsZ 与真核生物细胞骨架成员微
管蛋白相同源 , 在细菌分裂中参与分裂环的形
成[ 43 ～ 45] 。同时也发现 FtsZ 同源序列在植物中也
存在[ 46 , 47]并且在小立碗藓中被分离出来。内共生
学说认为叶绿体和线粒体是原核细菌被真核细胞祖
先吞噬后共生进化而来 , 它增殖受到严格的调
控[ 48] 。那么这个基因在真核生物细胞器的分裂中
是否起作用呢?最为直接的方法就是利用基因打靶
将此基因敲除。然而由于同源重组的频率在高等植
物中极低 ,所以这很难实现。而利用反义 RNA 基
因沉默技术往往导致表型不稳定[ 21 ,49] 。用大约 1
kb不连续的同源序列的替换型载体转化小立碗藓 ,
其 FtsZ1 基因被成功的敲除。基因打靶的频率高达
14%[ 38] 。在正常的野生型小立碗藓植株细胞中通
常有 50多个叶绿体 ,而在 FtsZ1 基因敲除后的植株
细胞中只有一个巨大叶绿体 ,但此基因功能的丧失
对线粒体的分裂及植物体形态发生没有明显的影
响 ,此方法首先证明了 FtsZ1 基因的编码蛋白对叶
绿体分裂是必须的 。
小立碗藓富含花生四烯酸(占总脂肪酸的 30%
以上)[ 50] 。与高等植物相比 ,苔藓植物 、蕨类植物以
及藻类植物的一些种能够产生更多种类的多不饱和
562 遗　传 HEREDITAS (Beijing)2004　　　　　　　　　　　　　　　　26卷　
脂肪酸(polyunsaturated fatty acids (PUFA))[ 51] 。
而诸如花生四烯酸(AA)、十二碳五烯酸(EPA)是低
等植物所特有的 。它是从亚油酸去饱和与延长而合
成的 ,其中■6脂酰基的去饱和是必须的 。这个长
链的 PUFA在人类前列腺素代谢中起极其重要的作
用[ 52] ,但在低等植物细胞膜中的具体功能还不清
楚 ,为了确定其功能 , ■6脂酰基去饱和酶(脱氢酶)
基因在小立碗藓中利用基因打靶被敲除 , PCR 及
Nouthern分析确证了试验结果 ,虽然基因敲除植株
在表型上与正常植株没有多大差异 ,但其脂肪酸组
成明显发生了变化 ,具有了明显的生化表型差异 。
基因敲除导致了亚油酸含量大幅上升 ,而在所有的
基因敲除植株中不产生花生四烯酸 。这也同时充分
表明基因打靶技术不但可以用于对基因功能的研
究 ,也可用于代谢生化过程的研究 。
ZLAB1 是在光合系统 Ⅱ光捕获复合体中编码
一个重要的叶绿素-a/b结合蛋白(CAB)的基因 ,
此基因属于一个高度保守的包含至少有 15个基因
的 Cab 多基因家族[ 53 ,54] 。在小立碗藓中这个基因
被利用带有其 1 kb 同源片段的插入型载体敲除 。
在序列水平同时证明这是以同源重组的方式被整合
的[ 41] 。9个转化株中有 3株证明在 ZLAB1 目的位
点通过同源重组而将目的基因被敲除的 ,即其基因
打靶的频率为 30%。PCR扩增的结果验证了此结
果 ,但是此基因被敲除的植株没有表现出明显的特
殊表型 ,考虑到它是一个多基因家族中的一员 ,这个
现象也就不难解释了 。
在真核细胞中蛋白质选择性降解的主要途径是
通过遍在蛋白依赖的蛋白质降解途径实现的 。26S
蛋白酶体是一个 ATP依赖性的多亚基蛋白复合体 ,
它能够选择降解遍在蛋白标记的蛋白质 ,是真核细
胞中遍在蛋白介导的蛋白质降解系统中的重要成
员 ,这个多亚基蛋白复合体的核心部分是 20S蛋白
酶体 ,与一对 19S的调节复合体相连系[ 55] 。RPN10
蛋白是 19S复合体中的一个亚基 ,它在体外对多遍
在蛋白链有高度亲和性 ,有可能在被遍在蛋白标记
的需要被降解的蛋白质识别上起重要作用。然而由
于在酿酒酵母的基因 rpn10 被敲除以后没有引起任
何表型上的变化 ,没有像预期的那样对氨基酸同系
物的敏感性提高 , 所以它的功能在此系统中尚不能
确定[ 56] 。但在小鼠中此基因的敲除却对其胚胎是
致死的[ 57] 。而在小立碗藓中此基因被敲除后虽然
对其生存不是致死的 ,但其原丝体的发育发生了变
化 ,形成芽体的数目减少[ 40] 。对于此基因功能的研
究也表明多系统对于基因功能研究的必要性。
以上是近年苔藓植物小立碗藓基因功能研究所
取得的代表性成果 ,说明其作为功能基因组学研究
模式系统的有效性和可行性 。由于具有极大的发展
前景 ,吸引了许多实验室加入此项研究的行列之中 ,
这方面的成果将更加丰富。
3　小立碗藓中高效基因打靶的原因
什么原因导致了同源重组在苔藓植物小立碗藓
中如此高效 ?对于这个问题的探讨有利于在高等植
物中建立高效的基因打靶程式 ,所以此问题的解决
至关重要。这也许有多种可能的原因 。到底是其酶
系统有异呢还是其表达调控机制不同 ?目前依然不
清楚 ,这也是以后研究工作将会努力的一个方向。
很显然 , PEG介导的遗传转化对于苔藓植物小立碗
藓是极为有效的[ 34] ,但在高等植物中却不是这样
的[ 22] ,这说明转化方法不是其决定因素。有人推测
这也许与其本身的单倍体状态有关[ 23] ,因为大多数
基因打靶频率高于 1%大都是在诸如原生动物 、酵
母 、一些绿藻和丝状真菌及苔藓这些单倍体中取得
的 ,而在野生型的二倍体酵母中同源重组频率没有
如此高 。此观点也同样得到了双链断裂修复假说的
支持 。外源 DNA以同源重组的方式还是随机插入
的方式整合入寄主基因组在很大程度上与这寄主的
DNA双链断裂修复机制种类密切相关 。在酿酒酵
母中 ,同源重组是其双链断裂修复的主要机制[ 58] ,
单倍体的物种为了保持其基因组的完整性 ,只有通
过同源重组而不是通过随机重组来修复。然而在高
等植物中 ,利用其单倍体组织进行这方面的研究表
明 ,单倍体状态本身并不能导致同源重组频率的升
高[ 22] 。转化是发生在细胞周期的特定时期 G2/M
转换点的 ,这说明同源重组也许有可能在此时期更
为有效[ 31] 。事实上在哺乳类动物中间接的实验证
据已经存在 ,在 S期和 G2期同源重组比 G1期更有
效 ,但是在苔藓植物小立碗藓中细胞周期的特定阶
段是否对同源重组有明显的效果还不得而知。目前
用于转化的原生质体都是从绿丝体分离到的 ,而绿
丝体在孢子萌发以后 24 小时之内是同步分裂
的[ 31 ,38] ,它的绿丝体都富集在 G2/M转换点 ,而无
丝体细胞则大都富集在 G1/M转换点 ,通常在实验
563　4 期　　　　　　　　　　　　董　文等:苔藓植物小立碗藓 ,功能基因组学研究新的模式系统
条件下它的原生质体都富集在 G2/M 转换点周
围[ 59] ,这也许与它的高效同源重组有关 , 但是在酿
酒酵母类似的试验却没有得到预期的效果 ,没有迹
象表明同源重组与细胞周期间没有直接关系[ 58] 。
所以 ,到底是细胞周期的同步化还是单倍体的状态
或者是由二者共同决定了在苔藓植物中的高基因打
靶频率目前还难以确定 。总体来说 ,在教原始的生
物中 ,同源重组的发生频率较高 ,而在较高等的生物
中往往较低 ,这一现象也许与物种维持其自身基因
组稳定性的能力亦即其本身的酶系统对外来 DNA
的精确识别及其降解等因素有关。当然这都还缺乏
实验证据 ,有待进一步研究 。可以研究小立碗藓确
切的细胞时相与基因打靶的频率之间的关系 ,也可
以高等植物花粉细胞为材料进行这方面的研究 ,因
为在花粉母细胞减数分裂后这些细胞基本上是同步
分裂的 ,并且处于单倍体状态 。利用这种特殊的细
胞类群 ,也许可以揭开小立碗藓高频率基因打靶与
细胞周期及单倍体状态之间的关系之谜 。
4　小结与展望
基因打靶技术已经成为细菌 、酵母 、少数种类丝
状真菌 ,以及哺乳类动物基因功能研究中的核心技
术 ,并取得了不少的成果 ,由于基因打靶的频率在高
等植物中极低 ,使它很难成为植物基因组研究的常
规技术 ,然而苔藓植物小立碗藓的高效基因打靶将
一改此历史并取得了可喜的成果 ,加之它在其他方
面的优越性 ,有望成为植物功能基因组学研究的模
式系统。利用小立碗藓中高效的基因打靶有助于通
过基因敲除来研究其更多基因的功能。由于高等植
物和小立碗藓有诸多的相似之处 ,利用这个系统作
为工具来研究其他高等植物中的同源基因功能也有
极大的可行性 ,同时也可以对苔藓植物中其他种进
行这方面的研究 ,看其基因打靶的频率是否也是如
此有效 ,这有利于对小立碗藓高效的同源重组机制
进行研究 ,也可以扩大基因资源 。鉴于其高效的同
源重组 ,可以实现基因特定位点甚至特定碱基的改
变来研究蛋白质特定位点的作用 ,在理论上可以实
现按照既定目标“修改”蛋白的结构而在蛋白质工程
研究中将会起到非常重要的作用。小立碗藓原丝体
生长迅速 ,24小时生物量可增加一倍[ 60] ,可以进行
规模化培养 ,将其转化系做成植物生物反应器来生
产诸如次生代谢物 、抗体等特需物质而提高其经济
与应用价值 ,具有极其诱人的前景。
参 考 文 献(References):
[ 1] 　Blat tner F R , Plunket t G I , Bloch C A , Perna N T , Bu rland V ,
Riley M , Collado-Vides J , Glasner J D , Rode C K , Mayhew G
F , Gregor J , Davis N W , Kirkpatrick A , Goeden M A , Rose D
J , Mau B, ShaoY.The com plete genome sequence of Escherichia
coli K-12.Science , 1997 , 277:1453～ 1474.
[ 2] 　Kunst F , Ogasaw ara N , Moszer I , Albertini A M , Alloni G ,
Azevedo V , Bertero M G , Bessieres P , Bolotin A , Borchert S ,
Borriss R , Boursier L , BransA , Braun M , Brignell S C , Bron S ,
Brouillet S , Bruschi C V , Caldw ell B, Capuano V , Carter N M ,
Choi S K , Codani J J , Connerton I F , Cummings N J , Daniel R
A , Denizot F , Devine K M , Dusterhof t A , Ehrlich S D , Emmer-
son P T , Ent ian K D , Errington J , Fab ret C , Ferrari E , Foulger
D , Fritz C , Fujita M , Fujita Y , Fuma S , Galizzi A , Galleron N ,
Ghim S Y , Glaser P , Gof feau A , Golight ly E J , Grandi G ,
Guiseppi G , Guy B J , Haga K , Haiech J , Harwood C R , Henaut
A , Hilbert H , Holsappel S , Hosono S , Hullo M F , Itaya M ,
Jones L , Joris B , Karamata D , Kasahara Y , Klaerr-Blanchard
M , Klein C , Kobayashi Y , Koet ter P , Koningstein G , Krogh S ,
Kumano M , Kuri ta K , Lapidus A , Lardinois S , Lauber J ,
Lazarevic V , Lee SM , Levine A , Liu H , Masuda S , Mauel C ,
Medigue C , Medina N , Mellado R P , Mizuno M , Moestl D ,
Nakai S , Noback M , Noone D , O Reilly M , Ogaw a K , Ogiw ara
A , Oudega B , Park S H , Parro V , Pohl T M , Portetelle D , Por-
wollik S , Prescot t AM , Presecan E , Pujic P , Pu rnelle B ,
Rapoport G , Rey M , Reynolds S , Rieger M , Rivolta C , Rocha
E , Roche B , Rose M , Sadaie Y , S ato T , Scanlan E , Schleich S ,
Sch roeter R , S cof fone F , Sekiguchi J , S ekow ska A , Seror S J ,
Serror P , Shin B S , Soldo B , S orokin A , Tacconi E , Takagi T ,
Takahashi H , Takemaru K , Takeuchi M , Tamakoshi A , T anaka
T , Terpst ra P , Tognoni A , Tosato V , Uchiyama S , Vandenbol
M , Vannier F , Vassarot ti A , Viari A , Wambut t R , Wedler E ,
Wedler H , Weitzenegger T , Winters P , Wipat A , Yamamoto H ,
Yamane K , Yasumoto K , Yata K , Yoshida K , Yoshikaw a H F ,
Zumstein E , Yoshikaw a H , Danchin A.The complete genome
sequence of the Gram-posit ive bacterium Bacillus subt ili s.Na-
ture.1997 , 390:249 ～ 256.
[ 3] 　C layton R A , White O , Ketchum K A , Venter J C.The first
genome f rom the third domain of lif e.Nature , 1997 , 387:459～
462.
[ 4] 　Adam s M D , Celniker S E , Holt R A , Evans C A , Gocayne J D ,
Amanatides P G , Scherer S E , Li P W , Hoskins R A , Galle R F ,
George R A , Lewis S E , RichardsS , Ashburner M , Henderson S
N , Sut ton G G , Wortman J R , Yandell M D , Zhang Q , Chen L
X , Brandon R C , Rogers Y H , Blazej R G , Champe M , Pfeif fer
B D , Wan K H , Doyle C , Baxter E G , Helt G , Nelson C R , Ga-
bor G L , Abril J F , Agbayani A , An H J , Andrew s-Pfannkoch
C , Baldw in D , Ballew R M , Basu A , Baxendale J , Bayrak taroglu
564 遗　传 HEREDITAS (Beijing)2004　　　　　　　　　　　　　　　　26卷　
L , Beasley E M , Beeson K Y , Benos P V , Berman B P , Bhan-
dari D , Bolshakov S , Borkova D , Botchan M R , Bouck J ,
Brokstein P , Brott ier P , Burtis K C , Busam D A , Butler H ,
Cadieu E , Center A , Chandra I , C herry J M , Caw ley S , Dahlke
C , Davenport L B, Davies P , de Pablos B , Delcher A , Deng Z ,
Mays A D , Dew I , Dietz S M , Dodson K , Doup L E , Dow nes
M , Dugan-Rocha S , Dunkov BC , Dunn P , Durbin K J , Evange-
lista C C , Ferraz C , Ferriera S , Flei schmann W , Fosler C ,
Gabrielian A E , Garg N S , Gelbart W M , Glasser K , Glodek A ,
Gong F , Gorrell J H , Gu Z , Guan P , Harris M , Harris N L ,
Harvey D , Heiman T J , Hernandez J R , Houck J , Hostin D ,
Houston K A , How land T J , Wei M H , Ibegw am C , Jalali M ,
Kalush F , Karpen G H , Ke Z , Kennison J A , Ketchum K A ,
Kimmel B E , Kodira C D , Kraf t C , Kravi tz S , Kulp D , Lai Z ,
Lasko P , Lei Y , Levi tsky A A , Li J , Li Z , Liang Y , Lin X , Liu
X , Mat tei B, M cIntosh T C , McLeod M P , McPherson D ,
Merkulov G , Milshina N V , Mobarry C , Morris J , Mosh refi A ,
Mount S M , Moy M , Murphy B , Murphy L , Muzny D M , Nel-
son D L , Nelson D R , Nelson K A , Nixon K , Nusskern D R ,
Pacleb J M , Palazzolo M , Pittman G S , Pan S , Pollard J , Puri
V , Reese M G , Reinert K , Remington K , S aunders R D ,
S cheeler F , Shen H , Shue B C , S iden-Kiamos I , Simpson M ,
Skupski M P , Smith T , Spier E , Spradling A C , S tapleton M ,
S trong R , Sun E , S virskas R , Tector C , Turner R , Venter E ,
Wang A H , Wang X , Wang Z Y , Wassarman D A , Weinstock G
M , Weissenbach J , Williams S M , Woodage T , Worley K C ,
Wu D , Yang S , Yao Q A , Ye J , Yeh R F , Zaveri J S , Zhan M ,
Zhang G , Zhao Q , Zheng L , Zheng X H , Zhong F N , Zhong W ,
Zhou X , Zhu S , Zhu X , Smith H O , Gibbs R A , Myers E W ,
Rubin G M , Venter J C.The Genome S equence of Drosophila
melanogaster.S cience.2000 , 287:2185～ 2195.
[ 5] 　Bouchez D , H ? f t e H.Functional genomics in plants.Pant phys-
iol , 1998 , 118:725～ 732.
[ 6] 　Miller B L , Miller K Y , Timberlake W E.Direct and indirect
gene replacements in Aspergi llus nid ulans. Mol Cel l Biol ,
1985 , 5:1714～ 1721.
[ 7] 　de Lozanne A , Spudich J A.Disruption of the Dictyostelium
myosin heavy chain gene by homologous recombinat ion.Science ,
1987 , 236:1086～ 1091.
[ 8] 　Grimm C , Kohli J:Observat ions on integrative t ransformat ion in
Sch izosaccharomyces pombe.Mol Gen Genet , 1988 , 215:87～
93.
[ 9] 　Asch D K , Kinsey J A.Relationship of vector insert size to ho-
mologous integration during transformation of Neurospora crassa
with the cloned am (GDH)gene.Mol Gen Genet , 1990 , 221:
37-43.
[ 10] Rothstein R.Target ing , disruption , replacement and allele res-
cue:integ rative DNA transformation in yeast.Methods Enzy-
mol , 1991 , 194:281～ 301.
[ 11] Papadopoulou B, Dumas C:Parameters cont rolling the rate of
gene targeting f requency in the protozoan parasite Leishmania.
Nucleic Acids Res , 1997 , 25:4278～ 4286.
[ 12] Doetschman T , Gregg R G , Maeda N , Hooper M L , Melton D
W , Thompson S , Smithies O.Targeted correct ion of a mutant
HPRT gene in mouse embryonic stem cells.Nature , 1987 , 330:
576～ 578.
[ 13] Thomas K R , Capecchi M R.Site-di rected m utagenesi s by gene
targeting in mouse embryo-derived stem cells.Cell , 1987 , 51:
503～ 512.
[ 14] Deng C , Capecchi M R.Reexaminat ion of gene targeting fre-
quency as a funct ion of the extent of homology betw een the target-
ing vector and the target locus.Mol Cell Biol , 1992 , 12:3365～
3371.
[ 15] Jasin M , Moynaham M E , Richardson C.Targeted t ransgenesis.
Proc Nat l Acad Sci USA , 1996 , 93:8804～ 8808.
[ 16] Mǜ ller U.T en years of gene targeting:targeted mouse mu tants ,
f rom vector design to phenotype analysis.Mech Dev , 1999 , 82:3
～ 21.
[ 17] Paszkow ski J , Baur M , Bogucki A , Potrykus I.Gene target ing in
plants.EMBO J , 1988 , 7:4021～ 4026.
[ 18] Half ter U , Morris P-C , Willmit zer L.Gene target ing in Ara-
bidopsis thal iana.Mol Gen Genet , 1992 , 231:186～ 193.
[ 19] Off ringa R , de Groot M J A , Haagsman H J , Does M P , van den
Elzen P J M , Hooykaas P J J.Extrachromosomal homologous re-
combination and gene target ing in plant cells af ter Agrobacterium-
mediated t ransformation.EMBO J , 1990 , 9:3077～ 3084.
[ 20] Lee K Y , Lund P , Low e K , Dunsmuir P.Homologous recombi-
nation in plant cells af ter Agrobacter ium-mediated t ransforma-
tion.Plan t Cell , 1990 , 2:415～ 425.
[ 21] Puchta H , Hohn B.From cent iMorgans to base pairs:homolo-
gous recombination in plants.Tren ds Plant S ci , 1996 , 1:340～
348.
[ 22] Mengiste T , Paszkow ski J.Prospects for the precise engineering
of plant genomes by homologous recombination.Biol Chem ,
1999 , 380:749～ 758.
[ 23] Schaefer D G , Zr¨ yd J-P.Efficient gene targeting in the moss
Physcomitrel la patens.Plant J , 1997 , 11:1195～ 1206.
[ 24] Cove D.The Moss , Physcomi trella patens.Plan t Growth Reg-
u l , 2000 , 19:275～ 283.
[ 25] Ashton N W , Cove D J.The isolation and preliminary characterization
of auxot rophic and analogue resistant mutants of the moss ,
Physcomitrella patens.Molec Gen Genet , 1977 , 154:87～ 95.
[ 26] Ashton N W , Grimsley N H , Cove D J.Analysis of gametophytic
development in the moss , Physcomi trella patens , using auxin and
cytokinin resistant mutants.Planta , 1979 , 144:427～ 435.
[ 27] Courtice G R M , Cove D J.Mu tants of the moss , Physcomi trel la
patens w hich produce leaves of altered morphology.J Bryol ,
1983 , 12:595～ 609.
[ 28] Knight C D , Cove D J.The genetic analysis of t ropic responses.
Env E xp Bot , 1989 , 29:57～ 78.
565　4 期　　　　　　　　　　　　董　文等:苔藓植物小立碗藓 ,功能基因组学研究新的模式系统
[ 29] Ashton N W , Champagne C E M , Weiler T , Verkoczy L K.The
bryophyte Physcomitrel la patens replicates ext rachromosomal
t ransgenic elements.New Phytol , 2000 , 146:391～ 402.
[ 30] Cove D J , Knigh t C D , Lamparter T.Mosses as model systems.
Trends Plan t Sci , 1997 , 2:99～ 105.
[ 31] Reski R.Development , genetics and molecular biology of mosses.
Bot Acta , 1998 , 111:1～ 15.
[ 32] S chaefer D G.Molecular genetic approaches to the biology of the
moss Physcomitrel la patens.PhD Thesis , 1994 , University of
Lausanne.
[ 33] Kammerer W , Cove D J.Genetic analysis of the result of ret rans-
f ormation of t ransgenic lines of the moss, Physcomitrel la patens.
Mol Gen Genet 1996 , 250:380～ 382.
[ 34] Schaefer D G.Gene targeting in Physcomitrel la patens.Curr
Opin Plant Biol , 2001 , 4:143～ 150.
[ 35] S odeinde O A , Kindle K L.Homologous recombinat ion in the nu-
clear genome of Chlamydomonas reinhardt ii.Proc Nat l Acad
Sci USA , 1993 , 90:9199～ 9203.
[ 36] Hallmann A , Rappel A , Sumper M.Gene replacement by homol-
ogous recombination in the mult icellular g reen alga Volvo x car ter-
i.Proc Nat l Acad Sci USA , 1997 , 94:7469～ 7474.
[ 37] T hykjaer T , Finnemann J , Schauser L , Christensen L , Poulsen
C , Stougaard J.Gene target ing approaches using posit ive¨ C nega-
t ive select ion and large f lanking regions.Pla nt Mol B iol , 1997 ,
35:523～ 530.
[ 38] St repp R , Scholz S , Kruse S , Speth V , Reski R.Plant nuclear
gene knockout reveals a role in plastid division for the homolog of
the bacterial cell division protein FtsZ , an ancest ral tubulin.Proc
Nat l Acad S ci USA , 1998 , 95:4368～ 4373.
[ 39] Girke T , S chmidt H , Zahringer U , Reski R, Heinz E .Identification
of a novel delta 6-acyl-group desaturase by targeted gene disruption in
Physcomitrella patens.Plant J , 1998, 15:39～ 48.
[ 40] Girod P A , Fu H , Zry¨ d J P , Vierst ra R D.Multiubiqui tin chain
binding subunit MCB1(RPN10)of the 26S proteasome is essen-
t ial for developmental progression in Physcom itrel la patens.
Plant Cell , 1999 , 11:1457～ 1472.
[ 41] Hofmann A H , Codó n A C , Ivascu C , Russo V E A , Knight C ,
Cove D , S chaefer D G , Chakhparonian M , Zr5d J-P.A specif ic
member of the cab multigene fami ly can be eff icient ly targeted and
disrupted in the moss Physcomitrel la patens.Mol Gen Genet ,
1999 , 261:92～ 99.
[ 42] Schaefer D G.A new moss genetics :t argeted mutagenesi s in
Physcomi trella patens.Annual Rev , Plan t Biol , 2002 , 53:477
～ 501.
[ 43] de Bier p, C rossley R , Rothfield L.The essent ial bacterial cell di-
vision protein FrsZ is a GT Pase.Nature (London), 1992 , 359
～ 256.
[ 44] Erickson H P.FtsZ , a prokaryotic homolog of tubulin? Cell ,
1995 , 80:367～ 370.
[ 45] Roth field L I , Justice S S.Bacterial cell division:the cycle of the
ring.Cell , 1997 , 88:581～ 584.
[ 46] Kiessling J , Kruse S , Rensing S A , Harter K , Decker E L , Res-
ki R.Visualizat ion of a cytoskeleton-like FtsZ netw ork in chloro-
plasts.J Cel l Biol , 2000 , 151:945～ 950.
[ 47] Osteryoung K W , S tokes K D , Rutherford S M , Percival A L ,
Lee W Y.Chloroplast division in higher plants requires members
of tw o functionally divergent gene families wi th homology to bac-
terial FtsZ.Plan t Cell , 1998 , 10:1991～ 2004.
[ 48] Gray M W.T he endosymbiont hypothesis revi si ted.Int Rev Cy-
tol , 1992 , 141:233～ 357.
[ 49] Puchta H.Gene replacement by homologous recombination in
plants.Plant Mol Biol , 2002 , 48:173～ 182.
[ 50] Grimsley N H , Grimsley J M , Hartmann E.Fat ty acid composi-
tion of mutants of the moss Physcomitrel la patens.Phyto-
chemist ry , 1980 , 20:1519～ 1524.
[ 51] Dembit sky V M.Lipids of bryophytes.Prog Lipid Res , 1993 ,
32:281～ 356.
[ 52] Samuelsson B.Leucot rienes:mediators of immediate hypersen-
si tibity and inflammation.S cience , 1983 , 220:568～ 575.
[ 53] Long Z , Wang S-Y , Nelson N.Cloning and nucleot ide sequence
analysis of genes coding for the major chlorophyll- binding protein
of the moss Physcom itrel la patens and the halotolerant algae
Duna liel la salina.Gene , 1989 , 76:299～ 312.
[ 54] Reski R , Faust M , Wang X H.Genome analysis of the moss
Physcomitrel la patens (Hedw)BSG.Mol Gen Genet , 1994 ,
244:352～ 359.
[ 55] Voges D , Zwickl P , Baumeister W.The 26S proteasome:a
molecular machinery designed for cont rolled p roteolysis.Annu
Rev Biochem , 1999 , 68:1015～ 1068.
[ 56] van Nocker S , S adis S , Rubin D M , Glickman M , Fu H , Coux
O , Wefes I , Finley D , Vierst ra R D.The mul tiubiquit in- chain-
binding protein mcb1 is a component of the 26S proteasome is
Saccharomyces cerevisiae and plays a nonessential , subst rate-spe-
cific role in protein turnover.Mol Cel l Biol , 1996 , 16:6020 ～
6028.
[ 57] Kawahara H , Kasahara M , Nishiyama A , Ohsumi K , Goto T ,
Kishimoto T , S aeki Y , Yokosaw a H , Shimbara N , Murata S ,
Chiba T , Suzuki K , Tanaka K.Developmentally regulated , alter-
native splicing of the Rpn10 gene generates multiple forms of 26S
proteasome.EMBO J , 2000 , 19:4144～ 4153.
[ 58] Paques F , Haber J E.Mult iple pathw ays of recombination in-
ducedby double-st rand breaks in Saccharomyces cerevisiae.Mi-
crobiol Mol Biol Rev , 1999 , 63:349～ 404.
[ 59] S chween G , Gorr G , Hohe A , Reski R.Unique tissue specific
cell cycle in physcomit rella.Plan t boi l , 2003, 5:1～ 9.
[ 60] Boyd PJ , Hall J , Cove D J.An airlif t fermenter for the cul ture of
the moss Physcomi trella patens.In:Glime JM , editor.Methods
in bryology , 1988 , Tokyo:Hat tori Botan ical Laboratory .41 ～
45.
566 遗　传 HEREDITAS (Beijing)2004　　　　　　　　　　　　　　　　26卷