全 文 ：中国药房 2009年第 20卷第 27期 Ch ina Pharmacy 2009 V ol.20 No.27 · 2097·
*主管药师。研究方向:神经功能损伤后的药物保护与改善。电
话:0316-2072442。E-mail:yunqihu@sohu.com
欧亚旋覆花总黄酮提取物对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用研究
胡建平 1 , 2 *,梅和珊 1 ,赵可新 2 ,马 骐 2 ,单靖珊 2 ,王永利 1(1.河北医科大学药理教研室 ,石家庄市 050000;
2.中国石油天然气集团公司中心医院 ,廊坊市 065000)
中图分类号 R285;R972 文献标识码 A 文章编号 1001-0408(2009)27-2097-03
摘 要 目的:研究欧亚旋覆花总黄酮提取物(TFIB)对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用 。方法:实验分为 6组 , 即假手
术 、模型 、金纳多及 TFIB高 、中 、低剂量组 。对各组大鼠进行神经功能评分 ,采用 TTC染色法测定脑梗死体积 、HE染色法观察脑
组织形态学变化 、黄嘌呤氧化酶法测定血清中超氧化物歧化酶(SOD)活性 、硫代巴比妥法测定丙二醛(MDA)含量 、双波长荧光分
光光度法检测大鼠大脑皮层和纹状体神经细胞胞浆 Ca 2 +浓度([ Ca 2 +] i)的变化 。结果:与模型组比较 , TFIB 高 、中剂量组神经功能
评分显著降低(P <0.01);T FIB高 、中剂量组缺血再灌注损伤后脑梗死体积显著减小(P<0.01);TFIB高 、中剂量组神经细胞变
性坏死的病理变化显著改善;T FIB 高 、中剂量组大鼠血清 SOD 活力显著增强 ,MDA 含量显著降低(P<0.01);TFIB高 、中剂量
组胞浆 Ca 2 +浓度显著降低(P <0.01)。结论:TFIB对脑缺血再灌注损伤有显著的保护作用 ,其作用机制与抑制并减少体内脂质过
氧化物的产生 、增强机体抗氧化活性有关 。
关键词 脑缺血再灌注;欧亚旋覆花总黄酮提取物;金纳多;超氧化物歧化酶;丙二醛;神经功能评分;脑梗死体积;细胞内钙浓度
Protection by Total Flavonoids from Inula britannica against Focal Cerebral Ischemia- Reperfusion In-
jury in Rats
HU Jian -ping , MEI He -shan , WANG Yong -li(Dept.o f Pharmaco logy , Hebei Medical University ,
S hi jiazhuang 050000 ,China)
HU Jian-ping , ZHAO Ke-x in , MA Qi , SHAN Jing-shan(China Petrol and Natural Gas G roup Company
Central Hospi tal , Langfang 065000 , China)
ABSTRACT OBJECT IVE:To study the pro tection by the to tal flavonoids from In ula britannica(TFIB)against focal
ce rebral ischemia-reper fusion injury.M ETHODS:The experimental ra ts w ere divided into 6 groups:sham opera tion group ,
model g roup , Gina ton group , TFIB groups (high , medium and low dosage).T he neu rolog ical score of each group w as evalu-
ated , and the inf arction size w as measured by TTC staining ;the histological changes of brain tissue w ere observed by HE
staining , se rum activ ity o f superoxide dismutase (SOD)w as de tected by xanthinox idase m ethod;se rum content of malondi-
aldehyde (MDA)w as determined by thio -barbitone met hod;the intracellula r calcium concentra tion([ Ca2 +] i)in ce rebral
co r tex and striatum w as determined by tw o w ave -leng th f luorospectropho tom etry.RESULTS :As compared with m odel
g roup , the rats trea ted by TFIB (eithe r high or m edium dosage)had significantly decreased neurolog ical sco res(P <0.01),
significant improvement in patholog ical change o f degenera tion and necrosis of neurocy tes and significant increase in SOD ac-
tiv ity but significantly decrease in M DA content (P<0.01);TFIB groups (high , medium)show ed significantly decreased
cerebral infa rction size afte r ischemical -reper fusion injury(P<0.01)and significant decrease o f the intrace llular calcium
concentration([ Ca 2 +] i)(P<0.01).CONCLUSION :T he rem arkable pro tection by TFIB against focal ce rebra l ischemia-
reper fusion injury might be att ributed to the inhibition and reduction o f the production o f lipid perox ida tive p roduct in body and
the enhancemen t of t he antioxydan t activity.
KEY WORDS Cerebral ischemia-reper fusion;T otal flavonoids from Inu la br itannica(TFIB);Ginaton;SOD ;MDA ;Neu-
rolog ical score;Cerebral infarc tion size ;Intracellula r calcium concentra tion
制α-葡萄糖苷酶活性是 TMP 降血糖机制之一 。本文可为研
究蒲公英在糖尿病中的应用提供一定的实验依据 。
参考文献
[ 1] 陈福星 ,陈文英 ,郝艳霜.蒲公英多糖对小鼠免疫器官的
影响[ J] .动物医学进展 , 2008 ,29(4):10.
[ 2] Kriengsak T ,Unaroj B ,Kevin C , et al.Comparison of
ABTS , DPPH , FRAP , and ORAC assays f or estim at-
ing antiox idant activ ity from guava f ruit ex trac ts[ J] .J
Food Compos Anal , 2006 , 19:669.
[ 3] 张 丽 ,李彩芳 ,李晓梅 ,等.加拿大蓬α-葡萄糖苷酶抑
制作用[ J] .河南大学学报(医学版),2008 , 27(4):39.
[ 4] 李爱英 ,袁江永.苦葫芦中有效成分的提取分离及降血糖
作用研究[ J] .中国药房 , 2007 , 18(18):1 364.
(收稿日期:2009-01-11 修回日期:2009-05-24)
· 2098· China Pharm acy 2009 Vol.20 No.27 中国药房 2009年第 20卷第 27期
欧亚旋覆花总黄酮提取物(T FIB)由河北医科大学药学院
研制开发 , 其主要有效成分为黄酮类化合物 , 体外研究表明
TFIB通过抑制钙内流 、降低细胞内过氧化物水平和增加谷胱
甘肽水平而对抗谷氨酸对大脑皮层神经细胞的损伤 , 产生显著
的神经保护作用 [1 ] 。本研究拟采用大鼠局灶性脑缺血再灌注模
型 , 通过对缺血后脑组织形态学 、血清中丙二醛(M DA)含量 、
超氧化物歧化酶(SOD)活力和神经细胞胞浆钙浓度([ Ca 2 +] i)
变化的监测 , 评价 TFIB在缺血再灌注脑损伤中的神经保护作
用 ,并对其机制进行初步探讨 。
1 材料
1.1 仪器
AG135型电子天平(德国M ettler toledo 公司);40-90-
8C型温控热垫(美国 FHC公司);600型三用水浴箱(金坛市
富华仪器有限公司);电热灼烧器(上海医疗器械八厂);CS213
型电热培养箱(重庆实验设备厂);5415D 型离心机 (德国 Ep-
pendorf 公司);T U -1800型紫外可见分光光度计 (北京普析
通用仪器公司);RM 2135型石蜡切片机 (德国 Leica公司);
ZHPY-型恒温式附贴切片展开仪(河北医科大学);光学显微
镜(日本 Olympus公司);Fluo-star 型多功能微分析仪(德国
BM 公司)。
1.2 试药
银杏叶提取物注射液(金纳多 , 台湾济生化学制药厂股份
有限公司 ,批号:20040335 ,每 1 mL 含银杏黄酮苷 0.84 mg);
TFIB(河北医科大学药学院);氯化 2 , 3 , 5-三苯基四氮唑
(T TC ,北京福星化工厂);水合氯醛(河北春光试剂厂);SOD 、
M DA 试剂盒(南京建成生物工程研究所);乙二醇双-2-氨基
乙醚-四乙酸(EGTA)、聚乙二醇辛基苯基醚(T riton-100)、
钙离子荧光探针(Fura-2/Am , 美国 Sigm a公司);胎牛血清
(北京鼎国生物技术有限责任公司);DM EM/F12培养基(日本
Gibco 公司);其余试剂均为国产分析纯 。
1.3 动物
清洁Ⅱ级 SD 大鼠 , ♀,体质量 230 ～ 270 g ,由河北医科大
学实验动物中心提供(动物生产许可证号:XCSK(冀)609068)。
2 方法
2.1 TFIB对局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用
2.1.1 实验分组:72只 SD大鼠随机分为 6组 ,即假手术 、模
型 、金纳多(4 mg ·kg -1)及 TFIB高 、中 、低剂量(8 、4 、2 mg ·
kg
-1)组 。
2.1.2 大鼠局灶性脑缺血再灌注模型的复制 [1 ]:以线栓法复
制局灶性脑缺血再灌注模型大鼠 , 除假手术组外 , 各组大鼠于
插入拴线后舌下 iv 生理盐水 、金纳多和不同浓度的 TFIB 。
2.1.3 神经功能评分:参考 Bederson [2 ]和 Lin [3 ]的 10分制评
分方法 ,于术后 6 h进行神经功能评分 。评分标准:(1)提起鼠
尾 , 观察前肢有无异常变化 ,凡有术后左前肢内收 、内旋者 , 视
其轻重评为 0 ～ 3分 , 若大鼠表现为躯体向左侧旋转 , 加 1分;
(2)将大鼠置于金属网上 ,向后轻扯鼠尾 ,观察大鼠两前肢肌张
力 , 根据左侧前肢肌张力下降程度评为 0 ～ 3分;(3)将大鼠置
于光滑平面上 , 观察侧向推挡阻力 , 根据左侧前肢阻力下降程
度评为 0 ～ 3分 。
2.1.4 脑梗死范围的测定 [2 ]:缺血后 6 h ,大鼠断头 ,取出脑组
织 , 去除嗅球 、小脑和脑干 , 置于 —80 ℃冷冻 3 min后取出 , 将
脑组织由前向后做 6 ～ 7个大脑连续冠状粗切片 , 置于 2%
TTC 磷酸盐缓冲液中 , 37 ℃避光恒温孵育染色 20 min , 正常
脑组织被染成红色 , 梗死区为苍白色 , 染色的脑片以 4%福尔
马林溶液固定 24 h ,取出 ,分离红色和白色区域 ,称是质量并计
算梗死区域占全脑质量的百分数进行统计分析 。
2.1.5 HE染色观察组织学变化:大鼠于缺血 2 h再灌注 4 h
后 , ip 10%水合氯醛(3.5 mL ·kg -1)麻醉 ,仰位固定于手术台
上 , 剪开胸腔 , 暴露心脏 , 剪去心包膜 , 将针头自大鼠左心室插
入主动脉 ,剪开右心耳 ,夹闭胸主动脉 ,全速灌流肝素化的生理
盐水 200 mL ,再用 4%多聚甲醛灌流固定 2 h 。断头取脑 ,以视
交叉前后两点做冠状切片 , 将脑片放入 4%多聚甲醛固定液中
固定 。脑片经常规梯度脱水 、透明 、包埋 、切片(厚度为 6μm)、
贴片 、下行脱蜡至水、苏木精染色 、盐酸乙醇分化 、伊红复染 、水
洗 、上行脱水 、透明 、中性树胶封片后 , 光镜下观察组织学变
化 。
2.1.6 血清中 SOD 活力和M DA 含量的测定:大鼠缺血 2 h
再灌注 4 h后 ,内眦取血 , 3 000 r ·min -1离心 15 min ,分离血
清 ,置于 —80℃冰箱保存 ,备用 。
2.2 TFIB对脑缺血再灌注后脑组织胞浆[ Ca2+] i的影响
分组及给药同“2.1.1”项下操作 。缺血 2 h再灌注 4 h后 ,
在激发波长为 340和 380 nm 波长处交替扫描 ,测定荧光强度 ,
分别测定大脑皮层和纹状体神经细胞胞浆 [Ca 2 +] i:[ Ca2 +] i=
Kd ·(Fm ax/Fmin)·(Rmin)/(Rmax —R)。
2.3 统计学方法
实验数据用x ±s表示 , 单因素方差分析 、Dunnet t T 3两
两比较及 K ruskal-Wallis检验采用 SPSS 11.0数理统计软件
进行处理 。
3 结果
3.1 TFIB对脑缺血再灌注损伤后大鼠神经功能评分的影响
假手术组未见行为异常改变;模型组大鼠出现显著的行为
改变;金纳多和 TFIB高 、中剂量组与模型组比较神经功能评
分显著降低(P <0.01)。 TFIB对模型大鼠神经功能评分的影
响见表 1。
表 1 TFIB对模型大鼠神经功能评分的影响
Tab 1 Effects of TFIB on neurologic score of model rats
组别 剂量/mg· kg -1 神经功能评分
假手术组 - 0
模型组 - 8.8±0.7*
金纳多组 4 5.8±1.0#
TFIB低剂量组 2 8.1±0.8
TFIB中剂量组 4 6.5±0.9#
TFIB高剂量组 8 5.4±1.1#
与假手术组比较:*P<0.01;与模型组比较:#P<0.01
vs.sham operat ion group:*P<0.01;vs.model g roup:#P<0.01
3.2 TFIB对大鼠脑梗死体积的影响
T FIB可显著缩小脑缺血再灌注损伤后脑梗死体积 , 与模
型组比较 , TFIB高、中 、低剂量组大鼠梗死面积显著降低(P <
中国药房 2009年第 20卷第 27期 Ch ina Pharmacy 2009 V ol.20 No.27 · 2099·
《中国药房》杂志———《化学文摘》(CA)收录期刊 ,欢迎投稿 、订阅
表 4 TFIB对脑缺血再灌注损伤后脑神经细胞胞浆 [Ca2+] i
的影响
Tab 4 Effects of TFIB on intracellular calcium concen-
trat ion ([ Ca2 +] i)of model rats af ter ischemical-reperfu-
sion injury
组别 剂量/mg· kg -1 [ Ca2+] i/ nmo l·L -1大脑皮层 纹状体
假手术组 - 283±34 234±45
模型组 - 790±76* 989±101*
金纳多组 4 574±50# 686±107#
TFIB低剂量组 2 719±85 890±83
TFIB中剂量组 4 583±72# 726±85#
TFIB高剂量组 8 570±62# 774±90#
与假手术组比较:*P<0.01;与模型组比较:#P<0.01
vs.sham operation group:*P<0.01;vs.model g roup:#P<0.01
0.01或 P <0.05);TFIB中剂量与金纳多作用相似 。TFIB对
模型大鼠脑梗死体积的影响见表 2。
表 2 TFIB 对模型大鼠脑梗死体积的影响
Tab 2 Effects of TFIB on cerebral infarct ion size of
model rats
组别 剂量/mg· kg -1 脑梗死体积/ %
假手术组 - 0
模型组 - 15.7±1.6*
金纳多组 4 8.3±2.1##
TFI B低剂量组 2 13.6±1.1#
TFI B中剂量组 4 9.1±1.5##
TFI B高剂量组 8 7.5±2.1##
与假手术组比较:*P<0.01;与模型组比较:#P <0.05 , ##P<
0.01
vs.sham operation group:*P<0.01;vs.model g roup :#P<
0.05, ##P<0.01
3.3 TFIB对缺血再灌注后脑组织形态学观察结果
光镜下检查 , 模型组缺血侧大脑皮层和纹状体出现严重的
神经细胞变性坏死 , 其中皮层锥体细胞表现为胞体固缩 , 核浓
缩 、深染 , 染色质浓缩 、边聚 ,胞浆呈嗜酸性改变 , 细胞与周围组
织形成显著的间隙 , 间质疏松 ,出现空泡性变性 。而假手术组未
见上述病理变化 , 神经细胞核仁清晰 、核圆形 , 核膜完整 。4 、 8
mg · kg -1TFIB可显著改善上述病理变化 , 2 mg ·kg -1TFIB
对缺血侧神经细胞的病理变化无显著改善作用 。
3.4 TFIB对大鼠血清 SOD活力及MDA含量的影响
与模型组比较 ,TFIB高、中剂量组SOD 活性显著升高(P <
0.01), TFIB高、中、低剂量组M DA 含量显著降低(P<0.01或
(P<0.05)。TFIB对模型大鼠血清 SOD 活力 、MDA 含量的影
响见表 3。
表 3 TFIB对模型大鼠血清 SOD活力、MDA含量的影响
Tab 3 Effects of TFIB on serum SOD activity and MDA
content of model rats
组别 剂量/mg· kg -1 SOD/ IU ·mL -1 M DA/ nmol ·mL -1
假手术组 - 136±22 9.5±0.8
模型组 - 77±20* 13.3±0.9*
金纳多组 4 108±15# 9.9±1.0##
TFI B低剂量组 2 82±12 11.9±1.6#
TFI B中剂量组 4 107±17# 10.0±0.9##
TFI B高剂量组 8 114±19# 9.6±0.9##
与假手术组比较:*P<0.01;与模型组比较:#P <0.05 , ##P<
0.01
vs.sham operat ion group:*P<0.01;vs.model g roup :#P <
0.05, ##P<0.01
3.5 TFIB对脑缺血再灌注损伤后脑神经细胞胞浆 [ Ca2+] i
的影响
与模型组比较 , TFIB高 、中剂量组大鼠脑神经细胞胞浆
[C a2 +] i显著降低(P <0.01)。 TFIB对脑缺血再灌注损伤后脑
神经细胞胞浆[Ca 2 +] i的影响见表 4。
4 讨论
本研究结果支持了金纳多通过抗氧化自由基损伤产生神
经保护作用的观点 [4 ] 。TFIB具有与金纳多相似的抗氧化作用 ,
两者均可以显著增加缺血再灌注损伤模型大鼠血清中 SOD活
力 , 降低M DA 含量;可以改善脑缺血再灌注损伤后脑组织状
况;可以改善脑缺血再灌注损伤后大鼠神经功能评分 , 显著降
低脑梗死体积 ,表明其具有神经保护作用 。
本研究表明 , TFIB主要通过抑制和减少体内脂质过氧化
物的产生 , 增强机体抗氧化能力 , 降低缺血再灌注损伤区神经
元胞浆游离[ Ca 2 +] i ,减轻脑缺血再灌注对神经元的损伤 ,进而
产生脑保护作用 。
参考文献
[ 1] 杨世方 ,闵宝珍 ,周锡英 ,等.大鼠局灶性脑缺血再灌注模
型的研究[ J] .中风与神经疾病杂志 , 1996 ,13(1):15.
[ 2] Bederson JB , Pit ts LH , Germano SM , et al.Evaluati_
on of 2 , 3 , 5-tripheny lte trazo lium chlo ride as a stain
fo r detection and quantification o f experiment al ce re-
bra l infarction in rats[ J] .S troke , 1986 , 17(6):1 304.
[ 3] Lin Y , Philis JW.Deoxycof orm ycin and oxypu rino l:pr_
o tection against focal ischemic inju ry in the rats[ J] .Br_
ain Res ,1992 ,571(2):272.
[ 4] Liang YQ , Zhang XP , Tang YZ.Effect s o f magnesium
salicylate (MgS)on free intracellular calcium in isolated
embryonic ra t brain ce lls[ J] .Chin Pharma B ull , 2000 ,
16(5):567.
(收稿日期:2009-02-14 修回日期:2009-06-07)