全 文 ：收稿日期: 2000- 12- 21
作者简介:张江洪 ( 1966- ) ,男 ,农艺师 ,硕士 .研究方向:植物生理生化 .
文章编号: 1006-7817-( 2001) 02-0257-05
荧光抗体在热带作物小粒种咖啡的 C3 /C4属性鉴别中
的应用
张江洪 1 , 杨汉金2 , 林梅馨 2 , 潘廷国 3
( 1.厦门出入境检验检疫局 ,福建 厦门 361012; 2.厦门大学生命科学学院 ,福建 厦门 361005;
3.福建农林大学生命科学学院 ,福建 福州 350002)
摘要: 用从烟草提纯的 1, 5-二磷酸核酮糖 ( RuBP)羧化酶制备兔抗 RuBP羧化酶抗体 ,并以异硫氰酸盐荧光
素 ( F ITC)标记抗体 .采用直接免疫荧光法对典型 C3植物水稻、 C4植物甘蔗和小粒种咖啡等进行了 RuBP羧
化酶的组织化学定位 .结果表明: C3和 C4植物叶切片中 RuBP羧化酶的分布明显不同 , C3植物的特异荧光位
于叶肉细胞 , C4植物的特异荧光绝大部分位于维管束鞘细胞 ;小粒种咖啡的特异荧光仅分布在叶肉细胞 .因
此认为 ,小粒种咖啡应属 C3植物 .
关键词: C3植物 ; C4植物 ; 小粒种咖啡 ; 叶肉细胞 ; 维管束鞘细胞 ; RuBP羧化酶 ; 免疫荧光法
中图分类号: Q945.11 文献标识码: A
Application of immunofluorescence to C3 /C4 attribute identification of a tropical
crop, Coffea arabica
ZHANG Jiang-hong
1 , YAN G Han-jin
2 , L IN Mei-x in
2 , PAN Ting-guo
3
( 1. Xiamen Ex it-Entry Inspection & Quarantine Bureau, Xiamen, Fujian 361012, China; 2. Life Science
Colleg e, X iam en Univ er sity , Xiamen, Fujian 361005, China; 3. Co lleg e of Life Sciences, Fujian Ag riculture
and Fo restr y Univ ersity, Fuzhou, Fujian 350002, China)
Abstract: Rabbit antiserum raised purified ribulo se-1, 5-bisphosphate carboxyla se ( RuBPCase) f rom tobacco
w as used to lo ca te RuBPCase in lea f blade transection of classica l C3 , C4 plants and Coff ea arabica by direct
imm uno fluo rescence method. The antibody was labelled by fluor esecin iso thio cyanate ( FITC ) . It was
discove red tha t in cla ssical C4 plant ( sugarcane ) , the specific fluo rescence was loca ted a lmost ex clusiv ely in
bundle sheath cell chlo r oplasts, while in C3 plant ( rice ) , the specific fluo rescence was in mesophyllous cell
chlo roplasts, which proved the difference in RuBPCase loca tion betw een cla ssical C4 and C3 plants. The
specific fluo rescence of C. arabica was located only in mesophyllous cell chlo roplasts, so it wa s concluded that
C. arabica belong s to C3 plant.
Key words: C3 plant; C4 plant; Cof fea arabica; bundle shea th cell; leaf mesophyllous cell; ribulose-1, 5-
bispho sphate carboxylase; immuno fluo rescence method
1, 5-二磷酸核酮糖 ( RuBP)羧化酶主要存在于叶绿体的间质中 ,呈可溶状态 .其由 8个大
亚基和 8个小亚基组成 [1 ] ;可被抗酶血清抑制也可被抗大亚单位血清抑制 ,但不被抗小亚单位
血清抑制 [2 ] .不同种植物抗大亚单位血清无特异性 ,而抗小亚单位血清具有特异性 .多年来 ,人
们分别对该酶的分离纯化、稳定性、动力学特性、结构功能和遗传信息定位等方面进行了一系
列深入的研究 [3, 4 ] ,由于影响 RuBP羧化酶的因素很多 ,分离纯化的离体测定活力研究尚无法
取得一致的结果 . RuBP羧化酶离体后活力降低 ,原因可能是其诱导失活 [ 5] ,因而对该酶活力
福建农业大学学报 30( 2): 257- 261, 2001
Journal of Fujian Ag ricultural Univ ersity
DOI : 10. 13323 /j . cnki . j . f af u( nat . sci . ) . 2001. 02. 027
测定结果的解释须格外谨慎 . Ha t tersley et al[6 ]最早用间接免疫荧光法 ,对 C3和 C4植物叶片
的徒手切片中 RuBP羧化酶的分布进行了比较研究 .王美琪等 [7 ]采用比间接免疫荧光法更具
特异性的直接免疫荧光法 ,先后对木瓜、大米草等植物的叶切片进行了相应的研究 .由于对热
带作物基础研究较少 ,迄今尚未有小粒种咖啡的碳素同化途径的报道 .本试验采用免疫荧光方
法 ,通过对小粒种咖啡叶切片的 RuBP羧化酶的组织化学定位 ,以探明小粒种咖啡的碳素同化
途径 ,以及在个体发育过程中的一些光合特性的变化 .
1 材料与方法
1.1 材料
供试小粒种咖啡 (Coff ea arabica )采自厦门大学生物馆前面的苗圃 ,以典型的 C3植物水
稻和 C4植物甘蔗作分析比较 .
试验主要试剂及仪器有异硫氰酸盐荧光素 ( FI TC) (瑞典 Fluka产品 ) , Sephadex G-25
( Pharmacia产品 ) , Sephadex G-50( Pharmacia产品 ) , Sephadex G-200 ( Pha rmacia产品 ) ,
DEAE纤维素 ( DE-52) ( Whatman产品 ) ,卡介苗 (厦门卫生防疫站提供 ) , Kodaco lor Go ld 400
( 27DIN )彩胶 (澳大利亚 Melbourne产品 ) ,紫外分光光度计 ( UV-240型 ,日本岛津产品 ) ,
Olympus荧光显微镜 ( BH2-RFL5型 ) .
1.2 小粒种咖啡叶片 RuBP羧化酶的提取、纯化
参照张志良等 [8 ]改进过的方法 .透明液依次经 Sephadex G-50柱、 SephadexG-200柱、
DEAE-纤维素柱 ( DE-52) ,以磷酸缓冲液洗脱 ,合并酶活部分的洗脱液 .
1.3 RuBP羧化酶抗体的制备、纯化
用于 RuBP羧化酶兔抗血清制备的抗原—— 从烟草中提取的 RuBP羧化酶 ,经聚丙烯酰
胺凝胶电泳后 ,呈现一条纯化的谱带 .
1. 3. 1 免疫方法 按照单价免疫球蛋白常量免疫方法 (多点注射 ) [9 ]进行 .分别取 RuBP羧化
酶抗原 10、 20、 25 mg溶于 1 mL 50 mmol· L- 1磷酸缓冲液 ( pH 7.4)中 ,加入等体积的 Freund
完全佐剂 .第一次注射至兔子的四脚掌皮下 ; 10 d后第 2次注射至肩胛骨中间 ;又隔一周第 3
次注射至髂骨部位下 ; 10 d后再注射水剂抗原 ( RuBP羧化酶 10 mg )一针 ,一周后取兔耳静脉
血测定血清的抗体效价 .另取一只不进行免疫的灰色雄兔为对照 .
1. 3. 2 抗体鉴定 按免疫电泳法 [8 ]进行抗体鉴定 .抗原稀释 1 024倍 ,抗体对质量浓度为 60
μg· mL- 1的 RuBP羧化酶仍能产生一条蓝色沉淀线 [10 ] .经类似测试从烟草提取的 RuBP羧化
酶兔抗血清与小粒种咖啡提取的 RuBP羧化酶之间存在明显的交叉反应 .因而 ,这一抗体的荧
光标记物可用来检测咖啡叶片内该酶的分布 .
1. 3.3 抗体纯化 当对免疫兔的耳静脉血的效价测定较高时 ,让免疫兔断食 1 d后 ,即从其颈
动脉采出全部血液 ,待收集的血于室温下完全凝固后放入冰箱过夜 .次日倾出血清 ,于 20 000
× g离心 20 min,弃残留的红血球 .在透明的抗血清中加入等体积的 PBS(内含 8. 5 g· L- 1
NaCl的 10 mmol· L- 1磷酸缓冲溶液 , pH 7.6) ,于 20 000×g离心 20 min,弃沉淀 ,上清液中加
入 ( N H4 ) 2 SO4达 0.5饱和度 .在冰箱静置 2 h后 ,于 20 000×g离心 20 min,弃上清液 .沉淀溶
于适量 PBS中 ,再加入 ( N H4 ) 2 SO4达 0.5饱和度 .重复操作 ,弃上清液 ,沉淀溶于少量 10 mmo l
· L- 1磷酸缓冲液 ( pH 7.6)中 .
·258· 福建农业大学学报 2001年第 30卷
1.4 抗体的荧光素标记
采用 Y. T. Tchan改进的直接法 ,用 FITC直接标记纯化的 RuBP羧化酶抗体 ,反应液 pH
维持在 9.0- 9. 5[11 ] .标记完毕的抗体蛋白液经 Sephadex G-25柱分装若干小管 ,待 F /P比值测
定用 .
1.5 标记抗体的鉴定
以 PBS为空白对照 ,精确配制各梯度质量浓度的 FITC标准液 ,用 72型分光光度计测得
其 D ( 490 nm)值 ,绘制标准曲线 ,然后根据所测得的荧光标记抗体液的 D ( 490 nm )值 ,从曲线
中反查 FITC质量浓度 .以紫外分光光度计测定总蛋白质质量浓度 .若经 Sephadex G-25柱的
2、 3、 4管标记抗体液的 F /P值符合文献 [12 ]的要求 ,为精制的荧光抗体液 .
1.6 标记抗体染色组织切片
供试叶片置于 0℃下预冷 20- 30 min后 ,徒手切片 ,迅速将叶切片置于载玻片上 ,用体积
分数为 75%乙醇固定 10- 15 min,使抗原固定在原位 .冷风吹干后 ,用 0.01 mol· L- 1 PBS( pH
7.4)反复冲洗 15 min后 ,用冷风吹干 .滴 2- 3滴精制好的荧光抗体液于载玻片中的组织切片
上 ,于 37℃、自然光、保湿状态下结合反应 60 min,以 0. 01 mol· L- 1 PBS ( pH 7.4)反复冲洗
15 min后 ,封片 .设置的对照有: ( 1)正常血清 ; ( 2) 0.01 mol· L- 1 PBS ( pH 7.4) ; ( 3)先加未标
记的抗体液反应 60 min后 ,加标记抗体液 . 3种对照结合反应均为 1 h,用 PBS冲洗 ,封片 .
1.7 荧光显微观察、拍照
染色好的组织切片应立即进行荧光显微观察 .超高压汞灯为激发光源 ,用 510 nm滤光片
将叶绿素的红色自发荧光滤去 .由于特异荧光在兰紫色激发光下淬灭很快 ,需选用 27DIN的
高速彩胶 ,荧光显微拍照的曝光时间宜控制在 20 s以内 .组织切片中特异荧光呈黄绿色 ,去除
叶绿素的红色自发荧光 ,还剩细胞壁的自发荧光 .
2 结果与分析
2.1 典型 C3和 C4植物的 RuBP羧化酶免疫荧光定位
用 FITC标记的 RuBP羧化酶抗体染色典型 C3植物水稻和 C4植物甘蔗的叶切片 .结果
表明:水稻叶切片叶肉细胞特异荧光较强 (图 1A) ,表明该酶广泛分布于叶肉细胞的叶绿体内 ,
而在其正常血清对照试验中则看不到特异反应 (图 1B) ;在甘蔗叶切片中 ,其特异荧光聚集在
维管束鞘细胞内 ,环绕维管束呈花环状 (图 1C) ,表明 RuBP羧化酶分布于维管束鞘细胞的叶
绿体内 ,而在正常血清对照组织中没有特异荧光 ,只有细胞壁的自发荧光 (图 1D) .上述两种植
物中特异荧光分布的不同显示了它们 RuBP羧化酶分布的不同 .
2.2 小粒种咖啡的免疫荧光定位
小粒种咖啡叶切片经 FITC标记的 RuBP羧化酶抗体染色后 ,仅在叶肉细胞有特异反应 ,
维管束鞘细胞则没有特异反应 (图 1E) ;而在正常血清对照组中没有特异荧光 ,只有细胞壁的
自发荧光 (图 1F) ,呈典型的 C3植物反应 .小粒种咖啡的碳素同化途径尚未见报道 .
2.3 不同光照条件下的 RuBP羧化酶免疫荧光反应
由于荧光抗体技术在植物研究方面的应用才刚刚起步 .目前尚未有用这一技术研究
RuBP羧化酶对光反应的报道 .本试验在其他反应条件均相同的情况下 ,比较不同光照下
RuBP羧化酶免疫荧光特异反应 . 结果表明 ,在自然光条件下 , 叶切片中的 RuBP羧化酶和荧
·259·第 2期 张江洪等: 荧光抗体在热带作物小粒种咖啡的 C3 /C4属性鉴别中的应用
A.水稻叶切片经用 FITC标记的 RuBP羧化酶抗体染色 ,示特异荧光仅与叶肉细胞 (箭头所示 )的叶绿体结合 ; B.水稻叶切
片的正常血清对照 ,示只有自发荧光而无特异荧光 ; C.甘蔗叶切片经用 FITC标记的 RuBP羧化酶抗体染色 ,示特异荧光仅
与维管束鞘细胞 (箭头所示 )的叶绿体结合 ; D.甘蔗叶切片的正常血清对照 ,示只有自发荧光而无特异荧光 ; E.小粒种咖啡
叶切片经用 FI TC标记的 RuBP羧化酶抗体染色 ,示特异荧光与叶肉细胞 (箭头所示 )的叶绿体结合 ; F.小粒种咖啡叶切片
的正常血清对照 ,示只有自发荧光而无特异荧光 .
图 1 水稻、甘蔗和小粒种咖啡叶切片的荧光显微比较 (× 368)
Fig. 1 Compari son of f luorescent microscopy in leaf blade trans ections of rice, s ugarcane and Cof f ea a rabica (× 368)
光抗体结合呈特异反应明显要比在避光条件下强烈得多 ,这也从免疫组织化学上得到进一步
证实: Ru BP羧化酶是一种光激活的酶 .同时也与现有的分子免疫学理论相符的 ,即抗原和抗
体的结合反应中 ,作为抗原的酶蛋白不仅要依赖于一级结构 ,同时也依赖于其四级结构 .荧光
抗体技术显示的是被活化的 RuBP羧化酶 .
3 讨论
C3和 C4植物的解剖学和生理学特性明显不同: C3植物维管束鞘细胞几乎无叶绿体 ,
RuBP羧化酶严格地位于叶肉细胞 ;而 C4植物维管束鞘细胞叶绿体有序排列 ,具有花环状解
剖结构 , RuBP羧化酶严格地位于维管束鞘细胞 . C3-C4中间型植物维管束鞘细胞有叶绿体 ,
RuBP羧化酶不像 C4植物那样严格地位于维管束鞘细胞 ,在叶肉细胞和维管束鞘细胞都有 .
现有资料表明: C4植物光合途径是对短暂雨季和长期高温干旱的热带气候的适应 ,由 C3植物
进化而来。本试验对小粒种咖啡叶切片的荧光显微观察结果表明 ,其维管束鞘细胞不具有花环
状解剖结构 ; RuBP羧化酶的免疫荧光定位与 Bauwe[13 ]对黄菊属中的 C3植物种的试验结果一
致 ,与 Chollet et al[14 ]对 Flaveria cronquistii种的免疫荧光反应相吻合 .上述结果表明 , RuBP
羧化酶在不同碳素同化途径植物的叶肉、维管束鞘细胞的严格分布特点 ,可以作为鉴定 C3或
C4植物的一个极为重要的生理生化指标 .
·260· 福建农业大学学报 2001年第 30卷
荧光抗体技术以其高度的特异性、定位性、敏感性和快速性等特点 ,已成为现代生命科学
研究的强有力手段之一 .该技术是组织化学和免疫学的结合 ,在医学、微生物学等早就有广泛
的应用 ,只是近 20年来才被应用于高等植物叶片内酶的定位 [6, 7 ] .这一技术与普通染色法、电
子显微术、放射自显影术等结合 ,其应用越来越广泛 .它不仅可以进行组织定位 ,还可以进行细
胞乃至亚细胞水平定位的研究 ,这是一般血清学方法及同位素示踪法所不及的 .由于其免疫反
应的试验结果又具有形态学特征 ,这就显著提高了结果判断的可靠性 .
致谢: RuBP羧化酶兔抗血清制备的烟草 RuBP羧化酶抗原由中国科学院植物生理研究所李立人研究员惠
赠 ,谨此致谢 .
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