全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2009年第 1期
收稿日期：2008-07-03
基金项目：广东省科技重大专项计划项目（2004A2090102）
作者简介：詹爱军（1970-），男，博士后，兽医师，主要从事动物传染病研究；E-mail：zhanaijun@126.com
通讯作者：毕英佐
禽流感 （Avain Influenza，AI）是由 A 型流感病
毒引起的一种病毒性传染病 [1]，给世界养禽业造成
巨大的经济损失。 自 1993 年以来在我国部分地区
的鸭 、鹅 、鸽 、珍禽中经血清学调查证实有 AIV 阳
性鸡群存在或已分离到 H9 亚型流感病毒并证实
中等毒力以下 H9 亚型禽流感在我国广泛存在 ，造
成了家禽业的重大损失 [2~6]。 同时也给公共卫生安
全造成潜在的威胁，1999 年曾发生 AIV H9N2 亚型
感染人的事件更引起了人们的关注 [7]。 目前，国内
外利用单克隆抗体 （mAb）检测 AIV 的研究已有报
道 [8~10]。
基因免疫可以刺激动物机体产生免疫反应 。
用基因疫苗制备 H9亚型禽流感病毒单克隆抗体
詹爱军 1，2 王新卫 2，3 王敬师 2 李少璃 2 于康震 4 毕英佐 2
（1扬州大学，扬州 225009；2华南农业大学动物科学学院，广州 510642；3河南农业大学牧医工程学院，郑州 450002；
4中国兽药监察所，北京 100081）
摘 要： 用 H9亚型禽流感病毒 （AIV）HA基因反转录 cDNA第一链 PCR扩增其 HA基因，PCR产物与 pcDNA3.1
（＋）质粒构建重组质粒作为基因疫苗免疫 8 周龄 Balb/C 小鼠，细胞融合后用血凝抑制试验（HI）和 ELISA试验检测细胞
培养上清， 各获得一株阳性细胞株， 经 3 次亚克隆后都能稳定分泌 H9 AIV特异性抗体。 特异性检测与 NDV、H5 亚型
AIV、产蛋下降综合症（EDS76）病毒毒株没有反应，2株单抗经亚型鉴定均为 IgG2b，轻链的亚型为 kappa 链。 所获得的单
克隆抗体将在禽流感快速诊断和疾病预警监控中发挥重要作用。
关键词： H9亚型禽流感病毒 血凝素 单克隆抗体 基因免疫
Preparation of Monoclonal Antibodies against the
Hemagglutinin of H9 Subtype of Avian Influenza
Virus by Genetic Immunization
Zhan Aijun1，2 Wang Xinwei2，3 Wang Jingshi1 Li Shaoli1 Yu kangzhen4 Bi Yingzuo1
（1Yangzhou University，Yangzhou 225009；2College of Animal Science，South China Agricultural University，Guangzhou
510642；3College of Animal Husbandry and Veterinary，Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002；4China Institute of
Veterinary Drug Control，Beijing 100081）
Abstract： Hemagglutinin genes of H9 subtype of avian influenza virus（AIV） was amplified by PCR.The digested
PCR products of HA was cloned into plasmid pcDNA3.1 （+）. BALB/C mice of 8 weeks old were immunized with
recombinant plasmid pcDNA-H9. The spleen cells of immunized mice were fused with Sp2/0 myeloma cells. Indirect
enzyme linked immunosorbent assay （ELISA） and hemagglutinatin inhibition （HI） test were used to screen hybridoma
cells. Two McAbs specifically against AIV H9 were obtained，which were not reacted to AIV-H5，NDV and EDS76
virus. The subtype of the belonging to McAbs was identified as IgG2b，kappa light chain. The two McAbs would be
useful as specific reagents in diagnosing avian influenza in practical poultry industry.
Key words： H9 subtype avian influenza virus （AIV） Hemagglutinin Monoclonal antibodies Genetic immuniza
tion
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 1期
Barry 等首次（1994）用 hGH 基因免疫小鼠，并用免
疫鼠脾细胞建立了杂交瘤，最终成功地获得了分泌
抗 hGH 抗体的单克隆细胞株 [11]，为单克隆抗体的
研制开辟了一条新的途径。 本试验利用 H9 亚型禽
流感病毒（AIV）HA 基因真核表达质粒（pcDNA3.1-
H9） 免疫雌性 BALB/C 小鼠， 制备抗 H9 亚型禽流
感病毒（AIV）HA 的单克隆抗体，为进一步建立 H9
亚型禽流感快速鉴别诊断试剂盒奠定基础。
1 材料和方法
1.1 实验动物、菌种、质粒与相关试剂
Balb/C 小鼠购自中山医科大学实验动物中心，
H9 亚型禽流感病毒 HA 基因 、 基因工程宿主菌
DH5 由华南农业大学动物科学学院生物技术室保
存。NDV、H9 亚型 AIV 和 H5 亚型 AIV、产蛋下降综
合症病毒毒株、pcDNA3.1（＋）质粒由华南农业大学
兽医学院兽医微生物实验室提供。 Ex Taq DNA 聚
合酶﹑dNTPs﹑HindⅢ﹑BamHⅠ﹑DNA Marker DL2000﹑
DL15000﹑琼脂糖均为 TaKaRa 公司产品 ；溴化乙锭
（EB）购至宝泰克生物科技有限公司；E.Z.N.A Plasmid
Minipreps Kit（200）﹑E.Z.N.A Gel Extraction Kit（200）
均为 Omega 产品；细胞基础培养基 IMDM 和降植烷
为 Gibco BRL 公司产品；新生小牛血清购自杭州四
季青生物工程材料研究所。 Mouse Mab Isotyping Test
Kit 购自 HyCult biotechnology b.v 公司。
1.2 引物设计与合成与 H9 基因 PCR 扩增
根据已发表 H9 亚型禽流感病毒 HA 基因序列
设计了 1 对引物，用于扩增 H9 亚型 AIV HA 基因。
在 P1 的 5′端加上 BamHⅠ酶切位点，P2 的 5′端加
上 HindⅢ酶切位点。 引物序列如下：P1 5-ATGGA
TCCGCAGATAAAATCTG CATC-3，P2 5-ATAAGCT
TTATACAAATGTTGCATCT-3， 由上海搏亚生物技
术有限公司合成，合成后的引物用 DEPC 水稀释后
于-20℃保存。
PCR 反应体系组成如下：P1/P2 各 2 μl，Ex Taq
酶 0.5 μl，10×Ex Taq Buffer 10 μl， 模板 1 μl，dNTP
8 μl，无菌双蒸水 76.5 μl，总体积 100 μl 混匀。 PCR
反应程序 ：94℃预变性 3 min；94℃ 40 s，52℃ 40 s，
72℃ 2 min，30 个循环；72℃后延伸 10 min。 PCR 产
物用 1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。
1.3 重组质粒的构建与鉴定
PCR 产物用酚仿抽提纯化并与 pcDNA3.1 （+）
质粒分别用 HindⅢ/ BamHⅠ双酶切， 反应体系分
别为 H9 PCR 纯化产物 40 μl，HindⅢ 3.5 μl，BamH
Ⅰ3.5 μl，K 缓冲液 10 μl， 双蒸水 43 μl， 总体积
100 μl。 pcDNA3.1（+）30 μl，HindⅢ5 μl，BamHⅠ5
μl，K 缓冲液 10 μl，双蒸水 50 μl，总体积 100 μl。
混匀后离心 ，37℃酶切 3 h。 酶切产物电泳回收纯
化，用连接试剂盒连接基因和质粒，连接产物转化
感受态细胞 DH5α。 然后参照姜伯 [12]方法进行阳性
菌落的筛选与鉴定后 ， 用试剂盒 E.Z.N.A Plasmid
Minipreps Kit （200） 抽提重组质粒 。 将真核质粒
pcDNA3.1-H9，用 HindⅢ、BamHⅠ进行单酶切和双
酶切鉴定。
1.4 真核质粒 pcDNA3.1-H9 的免疫
8 周龄的一级雌性 Balb/C 小鼠 5 只 ， 首免用
0.5%的盐酸普鲁卡因预处理股四头肌 ，20~30 min
后在处理过的相同部位肌肉注射 pcDNA3.1H9 质
粒 100 μg/只；每隔 2 周同样方法免疫，接种量每次
加 50 μg/只。以 HI 试验定期检测小鼠血清，当抗体
效价达到 24 以上时，直接进行细胞融合，融合前不
进行加强免疫。
1.5 细胞融合
参照文献 [13]制备饲养细胞 ，复苏骨髓瘤细胞
培养至对数生长期，制备小鼠脾胀淋巴细胞 ，分别
计数后 ，按比例混匀离心 ，在 45～60 s 内加入 1 ml
40℃的 PEG-4000 （pH8.0） 至细胞沉淀上， 轻轻混
匀，1 000 r/min 离心 5 min，弃上清 ，加足量的 HAT
培养液重新悬浮细胞，加入饲养细胞混匀 ，分装于
24 孔和 96 孔细胞培养板， 置 37℃ 5% CO2 饱和湿
度培养箱中培养， 第 6 d 用新鲜的 HAT 培养液半
量换液 1 次，第 11 d 改用 HT 培养基。
1.6 杂交瘤细胞上清的检测与阳性株的克隆、建
株与腹水制备
待细胞集落长至孔底的 1/10 时， 取细胞上清
液采用 HI 和 ELISA 方法检测， 检测抗原用 NDV、
H9 和 H5 亚型 AIV、 产蛋下降综合症病毒及 H9 亚
型 AIVHA 表达蛋白， 阳性孔用有限稀释法进行克
隆化，克隆化 3 次所有孔均为阳性后建株。取 12 周
龄以上的雌性 BALB/C 小鼠 6 只，腹腔注射降植烷
0.5 ml/只，1 周后， 腹腔注射杂交瘤细胞 3×106 个/
118
2009年第 1期
只， 待小鼠腹部明显肿胀， 无菌操作采集腹水，10
000 r/min 离心 10 min，吸取中间层液体 ，即为粗提
单克隆抗体。
1.7 单克隆抗体特性鉴定
杂交瘤细胞培养上清液和腹水用 HI 和 ELISA
方法检测效价。 分别用 HI 和 ELISA 方法与 NDV、
H9 亚型 AIV 和 H5 亚型 AIV、产蛋下降综合症病毒
毒株反应， 检测其特异性。 用 Mouse Mab Isotyping
Test Kit 鉴定单克隆抗体的亚型。 经超离纯化的 H9
亚型病毒与 1×样品缓冲液沸水浴中 3 min，用 SDS-
PAGE 分离后， 电转印至硝酸纤维素膜， 用 50 g/L
脱脂乳封闭， 依次用 H9 单克隆抗体、HRP 标记的
羊抗鼠 IgG 孵育，最后用 HRP 底物溶液显色，以进
一步鉴定单克隆抗体。
2 结果
2.1 H9 基因 PCR 扩增结果
用设计好的特异性引物从已反转录的 cDNA
的第一链扩增出 AIV-H9 HA 基因， 片段的大小约
为 1 700 bp（图 1）。
2.2 阳性重组质粒 pcDNA-H9 的构建
挑取 5 个菌落进行 PCR 检测 ， 检测到 2 个
pcDNA-H9 的阳性 PCR 产物 。 如图 2，4、5 为 PCR
检测出来的 H9 HA 片段，大小约为 1 700 bp，说明
目的基因已连接到 pcDNA 上。 然后对重组质粒进
行单双酶切， 结果表明 ， 用 HindⅢ、BamHⅠ消化
pcDNA-H9 重组质粒 ，获得 2 个 DNA 条带 ，大小分
别为 5 500 bp 和 1 700 bp；用 HindⅢ、BamHⅠ分别
进行单酶切各获得单一条带 ， 大小约为 7 200 bp
（图 3）。 送生物公司测序进一步表明克隆正确。
2.3 细胞融合和腹水制备
第 4 次免疫后 2 周后检测有 2 只小鼠血清抗
体效价达到 24，取一只进行细胞融合，接种 432 孔，
其中 356 孔有杂交瘤细胞生长， 融合率超过 80%，
用 HI 和 ELISA 方法分别检到 1 株阳性杂交瘤 ，分
别标记为 H9-01（2E6）和 H9-02（3B1）。 BALB/C 小鼠
腹腔注射杂交瘤细胞后，6只小鼠采集到腹水 45 ml。
2.4 特性鉴定结果
用 HI 和 ELISA 方法检测效价分别达到 211 和
1∶200 000， 与 NDV、H5 亚型 AIV 和产蛋下降综合
症病毒不反应（表 1），提示与 H9 亚型 AIV 有良好
的特异性。 2 株单抗经亚型鉴定均为 IgG2b，轻链的
图 1 H9-AIV HA 基因 RT-PCR 结果
M.DL2000 Marker；1,2.HA 基因 RT-PCR 产物
图 2 阳性重组菌的 PCR 鉴定
M.DL2000 Marker；1~3.阴性 ;4,5.PCR 阳性结果
图 3 pcDNA-H9 重组质粒酶切鉴定
M1.DL2000 Marker；M2.DL15000 Marker；1，2.HindⅢ与 BamHⅠ
分别单酶切结果 ；3.HindⅢ与 BamHⅠ同时酶切结果
H9-1 H9-02
图 4 H9 HA 单克隆抗体 H9-01 与 H9-02 的亚型测定
2 000
1 000
750
500
250
100
bp
2 000
1 000
750
500
250
100
bp
詹爱军等：用基因疫苗制备 H9亚型禽流感病毒单克隆抗体 119
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 1期
亚型为 ｋappa 链 （图 4），Western-Blotting 检测没有
反应条带，提示可能与病毒 HA 蛋白的空间结构对
应。
3 讨论
20 世纪 90 年代人们开始认识到基因免疫的
作用。 随着研究的深入发现，基因疫苗免疫不仅可
以刺激动物机体产生细胞免疫，也可以产生强烈的
体液免疫 [14]。 因此，有学者利用基因免疫来制备单
克隆抗体 [15~18]，丰富了制备单克隆抗体的方法。 尽
管存在一些不足，但基因免疫制备单克隆抗体具有
自己的优点 [15~18]。 基因疫苗产生的抗体蛋白相对于
原核表达纯化的蛋白要纯得多，不会涉及到原核表
达成分的假阳性干扰， 从而使筛选工作相对容易；
基因免疫在动物机体内产生的蛋白能维持其天然
构像， 可以制备最接近于天然免疫的单克隆抗体；
对于制备小分子蛋白以及难以纯化的蛋白单克隆
抗体提供了一条新的途径。 因此，笔者用基因免疫
和杂交瘤技术成功研制出抗 H9 亚型禽流感病毒
的单克隆抗体，特异性实验结果证明，这两株单克
隆抗体是抗 H9 亚型禽流感病毒血凝素蛋白的特
异性单克隆抗体，具有较好的亚型特异性。 为制备
流感血凝素单克隆抗体提供了新途径。
H9N2 亚型禽流感在亚洲鸡群中逐步流行 ，对
鸡的危害越来越严重。 1998 年以来，中国部分省、
市、自治区爆发该亚型禽流感的流行，造成蛋鸡产
蛋量急剧下降， 肉鸡和青年鸡的呼吸道疾病和死
亡、淘汰率升高，造成了严重的经济损失。 H9N2 亚
型禽流感抗原性不断变化 [19]，经常发生抗原漂移和
抗原转变现象， 而以血凝素基因的突变率最高 [20]。
因此，制备单克隆抗体研究其抗原表位的变化对进
一步揭示和了解 H9N2 亚型流感病毒变异机制具
有重要意义，同时，应用单克隆抗体建立快速检测
病原的合适方法如胶体金层析试纸条法和压电免
疫传感器法等对于控制与预防该亚型流感也具有
现实意义。 笔者利用基因免疫制备抗 H9N2 亚型禽
流感 HA 蛋白单克隆抗体在禽流感的检测监控上
具有良好的应用前景。
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  H9N2 AIV H5N1 AIV NDV EDSV
HI(2 ) H9-01 2
2 2 0
ELISA(OD ) H9-02 0.556 0.134 0.096 0.063

表 1 2 株 H9 单克隆抗体与 NDV、H9 和 H5
亚型 AIV 和 EDSV 的反应
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