Gene Cloning，Expression and Characterization of an HAP Phytase from <em>Pseudomonas fluorescens</em> 206-文献传递-植物通论文库

摘要：从浙江嘉兴人工鱼塘底泥样品筛选到产植酸酶活性较高的假单孢菌(Pseudomonas fluorescens)206。通过简并PCR和TAIL-PCR技术从Pseudomonas fluorescens 206菌株基因组DNA中克隆得到一个新的编码组氨酸酸性植酸酶（HAP）的基因，命名为phyP。该基因ORF全长1 284 bp，编码了427个氨基酸和一个终止密码子，前24个氨基酸为信号肽。将phyP在大肠杆菌中表达，重组蛋白经硫酸铵分级沉淀和阴离子交换柱纯化后达到电泳纯。对其酶学性质分析表明：重组植酸酶PhyP最适pH为5.5，在pH3.5-7.5的条件下具有较好的稳定性；重组植酸酶PhyP最适温度为45℃，在25℃时也具有较高的酶活性，因此植酸酶PhyP在饲料行业，尤其是水产行业具有潜在的应用前景。

Abstract:A Pseudomonas fluorescens 206 strain producing HAP phytase was isolated from the bottom mud of artificial fish ponds in Jiaxin city. A novel HAP phytase encoding gene phyP was cloned by degenerate PCR and TAIL-PCR. The full length gene consist 1 284 bp and encodes 427 amino acids, including a putative signal peptide of 24 residues. The gene phyP was expressed in E.coli. The recombinant enzyme PhyP was purified to homogeneity by ammonium sulfalte precipitation and anion exchange chromatography. The optimal pH of recombinant PhyP was pH5.5, and the enzyme showed high stability at pH3.5-7.5. The optimal temperature of PhyP was found to be 45 ℃, and the enzyme had a higher activity at 25 ℃. These superior properties of PhyP make it advantageous for applying in feed industries, especially fisher industry.

全文：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第8期
磷是动物生长、繁殖及代谢所必需的矿物质因
素之一。谷物、豆类和油料等作物中的磷 60%-70%
是以植酸的形式存在的［1］，因单胃动物体内缺乏能
分解植酸磷的酶而难以被利用。典型猪日粮中植酸
磷的利用率只有 15%，其余 85% 左右的磷从粪便中
排出，从而造成饲料中的磷得不到有效利用，高磷
粪便对环境的污染等问题［2］。
植酸酶（EC.3.1.3.8）是催化植酸及其盐类水解
为肌醇与磷酸（盐）的一类酶的总称，属磷酸单酯
收稿日期：2013-03-26
基金项目：广州医学院科研项目（2006GD058）
作者简介：李雅楠，女，博士，讲师，研究方向：微生物工程；E-mail ：yanan_2007@126.com
来源于假单孢菌 206 植酸酶基因的克隆、表达及
酶学性质研究
李雅楠1 黄火清2 姚斌2 赵青1 刘昆1 马文康1
（1. 广州医学院生物化学与分子生物学教研室，广州 510182 ；2. 中国农业科学院饲料研究所，北京 100081）
摘要：从浙江嘉兴人工鱼塘底泥样品筛选到产植酸酶活性较高的假单孢菌（Pseudomonas fluorescens）206。通过简并 PCR
和 TAIL-PCR 技术从 Pseudomonas fluorescens 206 菌株基因组 DNA 中克隆得到一个新的编码组氨酸酸性植酸酶（HAP）的基因，命
名为 phyP。该基因 ORF 全长 1 284 bp，编码了 427 个氨基酸和一个终止密码子，前 24 个氨基酸为信号肽。将 phyP 在大肠杆菌中
表达，重组蛋白经硫酸铵分级沉淀和阴离子交换柱纯化后达到电泳纯。对其酶学性质分析表明：重组植酸酶 PhyP 最适 pH 为 5.5，
在 pH3.5-7.5 的条件下具有较好的稳定性；重组植酸酶 PhyP 最适温度为 45℃，在 25℃时也具有较高的酶活性，因此植酸酶 PhyP
在饲料行业，尤其是水产行业具有潜在的应用前景。
关键词：假单孢菌（Pseudomonas fluorescens）植酸酶基因克隆与表达酶学性质
Gene Cloning，Expression and Characterization of an HAP Phytase
from Pseudomonas fluorescens 206
Li Yanan1 Huang Huoqing2 Yao Bin2 Zhao Qing1 Liu Kun1 Ma Wenkang1
（1. Depatment of Biochemistry，Guangzhou Medical College，Guangzhou 510182 ；2. Feed Research Institute，Chinese Academy of
Agricultural Sciences，Beijing 100081）
Abstract: A Pseudomonas fluorescens 206 strain producing HAP phytase was isolated from the bottom mud of artificial fish ponds in
Jiaxin city. A novel HAP phytase encoding gene phyP was cloned by degenerate PCR and TAIL-PCR. The full length gene consist 1 284 bp and
encodes 427 amino acids, including a putative signal peptide of 24 residues. The gene phyP was expressed in E.coli. The recombinant enzyme
PhyP was purified to homogeneity by ammonium sulfalte precipitation and anion exchange chromatography. The optimal pH of recombinant PhyP
was pH5.5, and the enzyme showed high stability at pH3.5-7.5. The optimal temperature of PhyP was found to be 45℃, and the enzyme had a
higher activity at 25℃. These superior properties of PhyP make it advantageous for applying in feed industries, especially fisher industry.
Key words: Pseudomonas fluorescens HAP phytase Gene cloning and expression Characteristics
水解酶，可使植酸磷降解成肌醇和磷酸，其对单胃
动物的饲喂效果已得到了广泛的确证［3］。它可使植
物性饲料中磷的利用率提高 60%，粪便中磷的排出
量减少 40%，而且还可以减少钙磷的添加，降低饲
料成本［4-6］。同时，因为解除了植酸的抗营养作用，
所以植酸酶的添加还可以提高单胃动物对淀粉、脂
肪、蛋白质等营养物质的利用率［7］，还能释放被植
酸鳌合的各种矿物元素［8］，对提高畜牧生产效益及
减少环境污染均具有重要意义。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第8期140
尽管植酸酶在单胃动物日粮中的添加效果得到
了广泛的验证，并取得了重要的经济效益、环境效
益和社会效益［2，9］，然而对单胃畜禽而言，植酸酶
的主要作用场所是单胃动物酸性的胃中，目前在饲
料上应用的植酸酶最适 pH 值主要是酸性的，只能
在酸性条件下发挥水解植酸的能力，在 pH 高于 6.0
时，酶活性几乎完全损失［10］。对于淡水养殖的主要
鱼类——鲤科鱼类来说，其自身的植酸酶活性不足，
在水产饲料中添加植酸酶能有效地提高淡水鱼对植
酸磷的利用率［11，12］。但鲤科鱼需要的酶制剂和家
禽家畜饲料里添加的酶制剂不同。鱼的消化道相对
短，消化道的 pH（一般 pH6.5-7.5）接近中性。因
此，水产饲料里的植酸酶制剂要求在中性 pH 下具
有较高的酶活性。另外由于水产养殖环境的水体温
度一般在 0-30℃之间，投放到养殖池塘的植酸酶需
在低温环境中具有较高活性。而到目前为止，在低
温及中性的环境下具有高酶活性植酸酶的报道还较
少。因此，开发低温中性植酸酶不仅具有较高的科
学理论价值，也具有较大的应用潜力和产业价值。
本研究从浙江嘉兴人工长期饲喂草料的鱼塘底
泥样品中，分离得到一株在中性条件下具有较高植
酸酶活性的菌株，经 16S rDNA 测序鉴定初步确定为
是假单胞菌属。通过简并 PCR 和 TAIL-PCR 的方法
从该菌中克隆分离得到一个新的编码植酸酶的基因。
将 phyP 在大肠杆菌中进行表达、纯化及酶学性质分
析，旨在为该植酸酶在水产行业的应用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株和质粒大肠杆菌菌株 BL21（DE3）、
DH5α、大肠杆菌表达载体 pET22b（+）购自
Novagen 公司；pGEM-T Easy 载体购自 Promega 公司。
1.1.2 试剂植酸钠（肌醇六磷酸十二钠，P0109）、
植酸钙、IPTG、X-gal 购自 Sigma 公司；限制性内
切酶购自 TaKaRa 公司；Taq DNA 聚合酶和 T4 DNA
连接酶购自 Promega 公司；层析介质购自 Amersham
Pharmacia 公司；引物由上海生工合成；其他试剂均
为进口或国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 产植酸酶菌株的分离、鉴定从浙江嘉兴人
工鱼塘采集的底泥样品，首先用固体植酸酶筛选
培养基 PSM，37 ℃ 培养 108 h［13］，然后在平板上
分离单菌落。将获得的单菌落转接到低磷培养基
LPM［14］。并对这些培养物进行植酸酶活性测定，从
中筛选具有植酸酶活性的菌株［15］。
利用 16S rDNA 的通用引物（27F 和 1492R，表
1），以 206 菌株的基因组为模板，进行 16S rDNA 片
段扩增，胶回收 PCR 扩增产物，连接到 pGEM-T Easy
载体后转化大肠杆菌 DH5α，筛选阳性克隆进行序
列测定。依据 16S rDNA 基因序列在 GenBank 数据
库中的比对分析结果，对 206 菌株进行初步鉴定。
表 1 引物序列
引物用途引物名称引物序列（5-3）
16S rDNA 扩增 27F AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
1495R GGTTACCTTGTTACGACTT
简并 PCR 扩增 HAP-F TCAGCCGCCAYGGTRTKMGIBCICCNAC
HAP-R TGCGABRTTIGWRTCRTGC
TAIL-PCR 扩增 206-Usp1 GAACAACGGGTCCGGCTTGCTGCGC
206-Usp2 CGCAGCCGGGGAACATGCCATCG
206-Usp3 CTGCCCGGCGACGGGCAGCTATC
206-Dsp1 CCTGCAATACAGCGAAGGCATGCC
206-Dsp2 TCGGCCATGCTCGCGATGCGGCGC
206-Dsp3 CACGTTGCCAGTCGTGGCGGTTCGC
表达引物 206-mF GGCGAATTCGGCCGAAACGAACCGTTACGT
206-mR GCCTCGAGTCAAGGGTAGCGGTACGCC
1.2.2 植酸酶基因的克隆根据已有的组氨酸
酸性植酸酶的氨基酸序列，寻找两段保守区域
RHGVRXPT 和 HDTN，根据密码子的简并性，设
计简并引物 HAP-F 和 HAP-R（表 1），用于植酸酶
基因片段的扩增。保守区的扩增采用降落 PCR 程
序，扩增条件为：94℃ 5 min ；94℃ 30 s，58℃ 30 s，
72℃ 60 s，以后每个循环依次降低 1℃，直到退火温
度为 50℃，共 8 个循环；接下来 94℃ 30 s，50℃ 30
s，72℃ 30 s，28 个循环；最终 72℃ 7 min。
根据已获得的植酸酶基因片段，设计特异性的
上下游引物（Usp1-3 和 Dsp1-3），采用 TAIL-PCR 的
方法获得全长基因［16］。将扩增产物与 pGEM-T Easy
连接，进行 DNA 序列测定。测序正确的上下游两条
片段序列和已知部分片段序列通过 Vector NTI 10.0
软件，拼接成一条完整的序列。并查找其完整的开
放阅读框，及基因相对应的氨基酸序列，并对蛋白
2013年第8期 141李雅楠等：来源于假单孢菌 206 植酸酶基因的克隆、表达及酶学性质研究
的理论分子量、等电点、氨基酸的组成做初步的分析。
1.2.3 基因序列分析在 NCBI 的 GenBank 中利用
BLAST 对该基因序列进行相似性研究，通过相似序
列查看目的基因的新颖性。利用 SignalP3.0 程序预
测蛋白序列中是否存在信号肽序列。通过 SWISS-
MODEL 程序预测植酸酶的三维结构信息和部分保守
位点，推测所克隆的植酸酶类型。
1.2.4 重组植酸酶表达载体的构建根据基因的序
列设计扩增植酸酶基因成熟蛋白序列的表达引物：
206-mF 和 206-mR（表 1），以 Pseudomona. fluoresce-
ns 206 菌株基因组 DNA 为模板，进行植酸酶基因
的 PCR 扩增。PCR 反应循环条件为：94℃ 5 min ；
94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，30 个循环；72℃
5 min。PCR 产物用 EcoR Ⅰ 和 Xho Ⅰ 双酶切，构
建表达载体 pET22b-phyP，电转化大肠杆菌 BL21
（DE3），用检测植酸酶活性和 SDS-PAGE 电泳的方
法验证植酸酶基因 phyP 在大肠杆菌中的表达。
1.2.5 重组植酸酶的诱导表达及纯化获得的阳性
克隆进行摇瓶培养，当 OD600 至 0.6 时，加入终浓
度为 0.8 mmol/L 的 IPTG 进行诱导，诱导 6 h 后取样
测定植酸酶活性。收集诱导上清液，用中空纤维超
滤浓缩诱导上清液。进一步利用 60%-80% 的硫酸
铵沉淀，沉淀物透析后利用 HiTrap Q XL 柱子纯化，
平衡缓冲液为 20 mmol/L 的 Tris-HCl（pH8.0），洗脱
液为含 1 mol/L NaCl 的 20 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），
上样量 5 mL，0-100% 洗脱 10 CV，流速 2 mL/min，
分部收集洗脱峰，得到电泳纯的目标蛋白。
1.2.6 重组植酸酶的酶学性质研究
1.2.6.1 植酸酶活性测定采用蓝钼法测定植酸酶
活性［17］。酶活性单位定义：一定条件下，每分钟释
放出 1 μmol 无机磷所需酶量为一个酶活性单位（U）。
1.2.6.2 重组植酸酶最适 pH 及 pH 值稳定性纯化
后的重组酶在不同的 pH（1.0-10.0）条件下测定其
最适 pH 值，37℃测定酶活性。将酶液在不同 pH 缓
冲液，37℃处理 1 h 后，并在最适 pH 缓冲液中测定
酶的剩余活性，研究酶在不同 pH 条件下的稳定性。
1.2.6.3 重组植酸酶最适温度及热稳定性在最适
pH 及不同温度（0-70℃）条件下测定酶活性以确定
其最适反应温度。热稳定性测定为在不同温度（45℃
和 55℃）条件下，将酶液分别处理不同时间，在最
适温度和最适 pH 条件下进行酶活性测定。
1.2.6.4 不同金属离子及化学试剂对重组植酸酶活
性的影响在酶促反应体系中加入不同的金属离子
及化学试剂，终浓度为 1 mmol/L 或 5 mmol/L。在最
适温度和最适 pH 条件下测定酶活性，以未加金属
离子和化学试剂的稀释酶液为对照。
1.2.6.5 重组植酸酶 Km 值和 Vmax 的测定用
不同浓度的植酸钠（0.125、0.25、0.5、1、2 和 4
mmol/L）为底物，在最适 pH 和最适温度下测定酶
活性，计算相应的反应速度，利用米氏方程双倒数
法求得 Km 值及 Vmax。
2 结果
2.1 菌种的分离鉴定
206 菌株是需氧型革兰氏阴性菌，最适生长温
度为 30℃。在低磷培养基中生长时可检测到植酸
酶活性。利用 16S rDNA 的通用引物，可以从 206
菌株基因组获得该菌的 16S rDNA 基因序列（1 450
bp）。序列比对结果显示，与报道的 Pseudomonas
fluorescens strain PC37 16S rDNA 一致性为 99.93%，
仅有一个碱基的差异，说明 206 菌株属于假单孢菌
属，初步命名为 Pseudomonas fluorescens 206。
2.2 植酸酶基因克隆与序列分析
简并 PCR 扩增出一条与预计大小相符的 DNA
片段，该片段序列在 NCBI 数据库中进行 BLAST 比
对结果表明，它与 Pseudomonas syringae 来源的 HAP
植酸酶 phyA 基因片段最高一致性为 62%，说明该
DNA 片段是编码植酸酶的基因片段。利用 TAIL-
PCR 扩增得到植酸酶基因 phyP 全长序列（图 1），
GenBank 注册号为：HM003047。该植酸酶基因以
ATG 为起始密码子，TGA 为终止密码子，由 1 284
个碱基组成，编码 427 个氨基酸和一个终止密码子。
分析表明前 24 个氨基酸为信号肽，并且包括 HAP
植酸酶的两个保守位点（RHGXRXP 和 HDTN），三
维结构预测表明该酶具有 HAP 家族植酸酶的典型
结构特征。该基因所编码成熟蛋白的理论分子量
为 44.3 kD，预测等电点为 8.67，成熟蛋白有两个
潜在的糖基化位点（N-X-S/T）。植酸酶基因 phyP 与
Pseudomonas syringae 的植酸酶基因 phyA，氨基酸序
列相似性为 55%。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第8期142
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1
73
25
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49
217
73
289
97
361
121
433
145
505
169
577
193
649
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241
793
265
865
289
937
313
1009
337
1081
361
1153
385
1225
409
72
24
144
48
216
72
288
96
360
120
432
144
504
168
576
192
648
216
720
240
792
264
864
288
936
312
1008
336
1080
360
1152
384
1224
408
下划线字母表示预测的信号肽序列，方框内字母表示植酸酶的保守位点，* 为终止密码子
图 1 植酸酶基因 phyP 的核苷酸序列和推测的氨基酸序列
2.3 植酸酶基因phyP在大肠杆菌中的表达与纯化
重组载体 pET22b（+）-phyP，转化大肠杆菌后
得到重组子。诱导重组子后的菌液经 SDS-PAGE（图
2）分析，检测到一条分子量约为 45 kD 的特异性条
带，与此酶的理论分子量相当。诱导培养的上清经
纯化后得到电泳纯的目的蛋白。酶的比活性由粗酶
液的 24.1 U/mg 提高到 356.2 U/mg，纯化了 14.8 倍。
72
kD
M 1 2 3
60
45
30
21
M ：蛋白质 Marker ；1 ：转化空载体大肠杆菌蛋白粗提液；2 ：转化重组质粒
的大肠杆菌蛋白粗提液；3 ：纯化的重组蛋白
图 2 E. coli BL21 表达重组植酸酶 SDS-PAGE 分析
2.4 植酸酶酶学性质分析
2.4.1 最适 pH 及 pH 稳定性重组酶 PhyP 的最适
pH 值为 5.5，在 pH4.5-8.5 条件下，酶活性维持在
40% 以上，而在 pH<2.5 时酶活性基本丧失。将酶在
不同 pH 条件下处理 1 h 后测定酶活性，结果（图 3）
表明，从 pH3.5-7.5 剩余酶活均在 80% 以上，说明
该酶在较广的 pH 范围内具有较好的稳定性。
2.4.2 最适温度及热稳定性纯化的 PhyP 最适温
度为 45℃，在 20℃时，该酶仍有约 40% 的相对活
性，即在 20-45℃时，植酸酶 PhyP 具有较高的活性，
但是当温度高于 50℃时酶的活性急剧下降。热稳定
性试验（图 4）表明，该植酸酶的热稳定性比较差，
45℃处理 30 min，剩余酶活为 70%，55℃处理 10
min，基本丧失所有活性。
2.4.3 金属离子及相关化学试剂对酶活性的影响
结果（表 2）显示，Ca2+ 对重组酶具有明显的激活作
用，1 mmol/L 的 Ca2+ 可使酶活提高 20%，而 Fe3 +、
2013年第8期 143李雅楠等：来源于假单孢菌 206 植酸酶基因的克隆、表达及酶学性质研究
表 2 金属离子及相关化学试剂对重组植酸酶 PhyP 的影响
化学试剂
相对酶活性（%）
化学试剂
相对酶活性（%）
1 mmol/L 5 mmol/L 1 mmol/L 5 mmol/L
对照（无） 100.00 100.00 Pb2+ 16.71 14.39
Na+ 103.50 112.65 Hg2+ 55.34 19.28
K+ 86.28 102.88 Ca2+ 119.96 116.40
Cr3+ 18.52 21.26 Zn2+ 15.71 12.23
Li+ 95.49 106.16 Co2+ 82.95 80.52
Cu2+ 24.79 9.31 Ag+ 52.91 12.52
Fe3+ 6.38 11.58 β-巯基乙醇 106.32 86.01
Mg2+ 103.44 101.81 EDTA 100.17 92.77
Mn2+ 107.28 68.27 SDS 56.63 12.25
3 讨论
本研究先利用植酸钙固体培养基，从浙江嘉兴
人工鱼塘底泥样品中筛选出能够降解植酸钙的微生
物，再利用低磷培养基，使微生物诱导表达植酸酶，
通过植酸酶活性检测分离得到能产生植酸酶的菌株
Pseudomonas fluorescens 206。通常情况下能在植酸钙
平板上显示透明圈的微生物有两种，一种是通过分
泌有机酸溶解植酸钙，另外一种是能够分泌植酸酶
水解植酸钙。为了排除有机酸的干扰，更好的筛选
到产植酸酶的微生物，在本研究中利用低磷培养基
诱导植酸酶的表达。通过结合植酸钙培养基和低磷
培养基成功筛选得到了植酸酶的生产菌 Pseudomonas
fluorescens 206，该方法可以进一步的应用于筛选产
植酸酶的微生物，具有较好的应用前景。
本研究结合简并 PCR 和 TAIL-PCR 的方法成功
获得了一个新的来源于假单孢菌的组氨酸酸性植酸
酶基因 phyP。该基因编码的氨基酸序列与来源于
Pseudomonas syringae 的植酸酶基因的序列一致性为
55%，表明来源于 Pseudomonas fluorescens 206 的植
酸酶基因 phyP 具有较高的新颖性。活性中心及三维
结构分析表明植酸酶 PhyP 是组氨酸酸性植酸酶中
一个新的成员。表达的 PhyP 的最适 pH 为 5.5，在
鱼消化道的 pH 环境下（pH6.05-7.5），重组植酸酶
PhyP 具有 50% 的相对酶活性，在 pH8.5 的条件下
还具有 40% 的相对酶活性。在 pH3.5-8.5 条件下处
理 1 h，酶活性可维持在 60% 以上，表明该植酸酶
在偏中性的环境下具有较高的植酸酶活性和稳定性。
而其他已报道的 HAP 植酸酶，多数在 pH6.0 时植
0
20
40
60
80
100
120
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
pH
⴨ሩ
䞦⍫
࣋%

a
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
20
40
60
80
100
120
pH
⴨ሩ
䞦⍫
࣋%

b
图 3 重组酶的最适 pH（a）与 pH 稳定性（b）
0
20
40
60
80
100
120
20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70৽ᓄ⑙ᓖ°C
⴨ሩ
䞦⍫
࣋%

a
0
20
40
60
80
100
120
0 5 10 15 20 25 30৽ᓄᰦ䰤min
⴨ሩ
䞦⍫
࣋%

55°C
45°C
b
图 4 重组酶的最适温度（a）与热稳定性（b）
Zn2+ 和 Cu2+ 对酶具有明显抑制作用。但该酶对 Ag+、
Hg2+ 和 SDS 具有较好的抗性，在 1 mmol/L 的 Ag+、
Hg2+ 和 SDS 存在时，该酶仍能保持 50% 的酶活性。
2.4.4 酶的 Km 值和 Vmax 酶动力学分析结果表明，
重组酶 Km 为 0.49 mmol/L，Vmax 为 238 μmol/mg/min。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第8期144
酸酶活性就非常低了，在 pH7.0 时基本检测不到活
性。因此本研究发现的植酸酶基因 phyP 可用于研究
HAP 植酸酶的作用机理，以及 HAP 植酸酶在高 pH
时水解植酸的机制。此外，植酸酶 PhyP 的 pH 性质
及低温下具有较高酶活性的特点，使它在水产养殖
方面具有广阔的应用，值得工业化开发。
在利用 TAIL-PCR 的方法获得该植酸酶基因的
下游序列时发现，在 phyP 的下游 72 bp 的位置还存
在另一个 HAP 植酸酶，命名为 phyP2。植酸酶基因
phyP2 全长 1 287 bp，编码 428 个氨基酸，前 23 个
氨基酸为信号肽序列。植酸酶基因 phyP2 的 DNA 序
列与 phyP 的一致性仅为 62.4%，氨基酸序列一致性
仅为 52.1%，表明这两个序列的一致性非常低，由
此推断这两个基因来源于不同的祖先，为研究植酸
酶的横向进化提供有利证据。而像这样两个组氨酸
酸性植酸酶基因串联在一起的现象还是首次被发现。
4 结论
利用 PCR 方法获得了一个新的来源于假单孢菌
菌株 206 的组氨酸酸性植酸酶基因 phyP，并将基因
在大肠杆菌中表达。重组植酸酶 PhyP 最适温度为
45℃，在 20℃重组酶具有 40% 的相对酶活性。PhyP
的最适 pH 为 5.5，在偏中性环境具有较高的酶活性。
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（责任编辑马鑫）

Gene Cloning，Expression and Characterization of an HAP Phytase from Pseudomonas fluorescens 206

来源于假单孢菌206植酸酶基因的克隆、表达及酶学性质研究

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