全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(11):173-178
收稿日期 ： 2015-05-15
基金项目 ：国家“863”计划项目（2012AA101204-2），海南省自然科学基金项目（313075），海南省重大科技项目子课题（ZDZX2013023-1），
中央级公益性科研院所基本科研业务费（ITBB2015RC01）
作者简介 ：曾长英，女，博士，研究方向 ：木薯抗逆机理 ；E-mail ：zengchangying@itbb.org.cn
通讯作者 ：彭明，男，博士，研究方向 ：植物分子遗传 ；E-mail ：pengming@itbb.org.cn
miR319a 及其靶基因在木薯中的低温响应分析
曾长英  周玉飞  彭明
（中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海口 571101）
摘 要 ： 旨在探索 miRNA 在木薯低温逆境中的调控作用，前期小 RNA 测序筛选出 miR319 对低温显著响应，通过实时定
量 PCR 方法分析 miR319 与其 4 个不同靶基因在两个木薯品种的 4 种低温处理下的差异表达情况。结果显示，miRNA 与其靶基因
在两个不同木薯品种间的响应不同，4 个低温处理间的响应也不同，miRNA 与各个靶基因的相关系数也不同。比较发现在 C4 中
miR319a 与 3 个靶基因（GSTU8 除外）负相关性均好于 SC124，处理之间在 NAH 中的负相关表现最典型，miR319 与 4 个靶基因
之间的相关系数从大到小的顺序为 ：MYB33>Unknown>TCP4>GSTU8，预示着 MYB33 和 Unknown（021030m）两个靶基因在 C4 的
NAH 中是 miR319a 更为优先的调控目标。结果表明在木薯的低温逆境适应过程中 miR319 对 MYB33 和 Unknown 两个靶基因的调
控作用值得深入研究。
关键词 ： miR319 ；耐低温 ；靶基因 ；负向调控 ；相关系数
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.11.015
The Differential Expression Characteristics of miR319 and Four
Targets Response to Low Temperature Treatments in Two Cassava
Varieties
Zeng Changying Zhou Yufei Peng Ming
（Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Haikou 571101）
Abstract: To study the regulation roles of microRNAs in cassava low temperature adaption, our early small RNA transcriptome profile
identified miR319 response to low temperature in cassava. This study, we assayed the expression patterns of miR319 and its 4 different target
genes between two cassava varieties under 4 low temperature treatments based on real-time quantitative polymerase chain reaction（PCR）
technique. The results showed that the expression patterns of miR319a and its target genes differed in two different cassava varieties, differed
among the four cryogenic treatments, and same to the correlation coefficients between microRNAs and four different target genes. After the
comparison study, we found that the negative correlations between miR319 with three targets（MYB33, TCP4 and Unknown）are larger in C4
than those in SC124, and the NAH treatment has most typical negative correlation, and the order of negative correlation coefficients between
miR319 and its target gene from large to small are ：MYB33>Unknown>TCP4>GSTU8. All those data reveal that MYB33 and Unknown target
（021030m）are priority target genes miR319 might execute its negative regulation under NAH treatment in C4, and thus the regulation of
miR319 on MYB33 and unknown target in cassava low temperature adoption is worth in-depth study in the future.
Key words: miR319 ；chilling tolerance ；targets ；negative regulation ；correlation coefficients
miRNA（microRNA）是近年来在真核生物中发
现的一类内源、不编码蛋白、长度为 20-24 nt 的单
链小分子 RNA［1］。miRNA 能与靶 mRNA 分子的 3
UTR 区特异性配对，引起靶 mRNA 的降解或者抑制
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其翻译，从而实现对靶基因在转录后水平上的负向
调控［2］。miR319 最初是通过对 jaw-D 基因突变体的
正向遗传分析发现的，它可通过靶向 TCP 转录因子
来调控植物叶片的形态建成与生长发育［3］。过表达
miR319 基因会引起植物表型变化，包括植物叶片边
缘锯齿化、果实畸形、叶片向上生长等一系列异常
的表型［4］。Schommer［5］进一步发现 miR319 还可调
控茉莉酸生物合成，从而调控植物叶片的衰老进程。
此外，miR319 还在花瓣和雄蕊的发育过程中起着关
键的调控作用，如 miR319a 成熟序列的一个碱基发
生突变，会导致 miR319 功能缺失，引起花瓣变短
变窄、雄蕊变短等［6］。
在 低 温 胁 迫 下，Sunkar 等［7］ 发 现 miR393 和
miR319c 在拟南芥冷害下强烈上调表达 ；贾蓓［8］
通过基因芯片在水稻中发现 miR319a/b 在低温处理
0.5 h 即有表达量的下调。Wang 等［9］进一步发现过
量表达 miR319b 能提高转基因水稻的耐低温能力，
同时提升转基因植株的脯氨酸含量和逆境后的成活
率。与此同时，其靶基因 OsPCF6 和 OsTCP21 在转
基因植株中下调表达，推测 miR319b 可能是通过活
性氧的清除实现耐低温能力的提升。
木薯是典型的热带块根作物，其耐低温能力及
特性与拟南芥及以种子为收获目标的水稻可能存在
差异，本研究旨在针对 miR319 在木薯低温胁迫过
程的响应特点做初步的探索。
1 材料与方法
1.1 材料
木薯品种 SC124 和 C4。
1.2 方法
在室外大田采用种茎繁殖的方法将木薯 SC124
和 C4 种植在体积为 3 L 的塑料盆，每周浇施 1/4
浓度的霍格兰大量元素营养液和阿农微量元素营
养液，常规病虫害管理 3 个月后，将盆栽苗移到
SANYO 人工气候培养箱内进行低温处理。实验共
设 置 4 个 处 理 ：驯 化 处 理（acclimation treatment，
AT ：25℃梯度降温至 14℃后开始计时）；驯化后
寒 害（acclimation hurt，AH ：在 经 历 5 d 驯 化 处 理
后再由 14℃梯度降温至 4℃）；非驯化寒害（non-
acclimation hurt，NAH ：25℃ 直 接 降 温 至 4℃） 和
对 照（negative control，NC ： 一 直 维 持 25℃ 的
温度）。
4 个处理的前中后 3 个时间点的功能叶混合成 4
个样品 ：NC（0 d、5 d 和 10 d），AT（6 h、24 h 和
5 d），AH（6 h、24 h 和 5 d）和 NAH（6 h、24 h 和
5 d），这 4 个样品抽提的 RNA 同时用于小 RNA 的
定量分析和靶基因的定量分析。miRNA 的 RT-PCR
检 测 参 考 Wang 等［10］ 的 Multiplexed RT-PCR 方
法，内参基因为 U6，靶基因的特异引物设置在跨越
miRNA 与靶基因结合区的前端（5 端）和后端（3
端），内参基因为 Actin。
2 结果
2.1 miR319与其靶基因在SC124的4个处理转录组
中的消长关系
前期对 SC124 的 4 个处理中的根茎叶混合样
品进行了小 RNA 测序和转录组测序，两组数据中
miR319a 与其靶基因之间的表达量关系如表 1 所示 ：
miR319 在 NAH 中相对于 NC 来说下调表达了 6.6 倍，
4 个靶基因则是上调表达 7-155 倍之多，涉及的基
因有 MYB33、TCP4、GSTU8 及一个未知功能基因
（以下简称 Unknown）。而在其他两个低温处理与对
照的比较中未发现 miR319 与其靶基因在表达量上
存在消长关系。
表 1 miR319 与其靶基因在 NAH 下表达量上的消长关系
处理比较 miRNA miRNA 变化倍数 靶基因 靶基因变化倍数 代码 功能描述
NAH vs. NC
miR319a -6.59375 004606m 7.187952 MYB33 myb domain protein 33
miR319a -6.59375 004517m 10.72166 TCP4 TCP family transcription factor 4
miR319a -6.59375 021030m 11.89342 Unknown
miR319a -6.59375 015766m 154.6823 GSTU8 glutathione S-transferase TAU 8
注 ：“-”表示所测 miRNA 在 NAH 与 NC 的相对表达量取以 2 为底的对数所得结果，为下调表达的倍数，其靶基因均为正值，意为在 NAH 与 NC 中上调表达，
mRNA 的 ID 号引用的是 JGI 数据库 http ：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html 对木薯基因的命名，取其后 7 位数，如 Cassava4.1_004606m 简写为 004606m
2015,31(11) 175曾长英等 ：miR319a 及其靶基因在木薯中的低温响应分析
2.1 miRNA在两个木薯品种中的不同响应特征
选取每个处理前中后 3 个时间点功能叶混合样
品对 miR319a 做的定量分析，结果（图 1-A）显示，
miR319a 在 C4 和 SC124 两个品种中的 4 个处理的响
应模式一致，均呈“反 Z”型。4 个处理的两两比
较分析（图 1-B）表明，SC124 的变化幅度显著大于
C4 相应处理间的表达量变化，尤其是在包含 NAH
处理的比较中，如 NAH/NC 和 NAH/AT，两品种间
的差异最大（图 1-B 中两曲线中间的间隔宽度，分
别为 2.269 和 3.21），而在 AT/NC（0.941）和 AH/NC
（0.937）中的差距则要小许多。这一结果与小 RNA
测序结果中仅在 NAH 中差异表达较大相一致。
-8
-7
-6
-5
-4
-3
-2
-1
0
NC AT AH NAH
Lo
g2
⴨ሩ㺘䗮䟿 miR319a
C4
SC124
A
-3
-2
-1
0
1
2
3
4
AT/NC AH/NC NAH/NC AH/AT NAH/AT NAH/AH
Lo
g2
⴨ሩ㺘䗮䟿 miR319a C4SC124B
A ：纵坐标为 U6 的 CT 值 - 目的基因的 CT 值 ；B ：纵坐标为一组处理间的相对表达量取 Log2 的值，如 AT/NC 表示驯化处理与对照的相对表达量，
相对表达量计算公式为 2 - △△ CT，式中△△ CT =（△ CT sample - △ CT control），△ CT = CT（target）-CT（reference）
图 1 四个处理条件下 miR319a 与内参基因 U6 的相对表达量（A）及两两处理间的相对表达量（B）
2.2 miRNA与其靶基因在3个低温胁迫下的不同
响应
结合 miR319 与其 4 个靶基因在同一套样品中
的表达量变化（图 2）显示，miR319 在 C4 和 SC124
两个品种的 NAH 处理中都具有明显此消彼长的关
AT/NC AH/NC NAH/NC
miR319a
AT/NC AH/NC NAH/NC
SC124C4
-5
Lo
g2
⴨ሩ㺘䗮䟿
-4
-3
-2
-1
0
1
2
3
4
5
319a-4517 319a-4606
319a-1030 319a-5766
系，这与转录组数据相一致，且两品种间的变化
趋势相反，说明这一 miRNA 表达量上的差异可能
在这两个木薯品种的耐低温能力差异上起着重要作
用。而在 AH 处理下，尤其是 AT 处理下无明显的
规律。
图 2 miR319a 与 4 个靶基因在 C4 和 SC124 两个品种之间的表达模式
2.3 miRNA与靶基因之间的相关性分析
将 4 个处理中 miR319a 及其靶基因与 NC 的相
对表达量进行散点图分析（图 3），可得出以下拟
合方程，miR319a 与靶基因之间的相关系数表现出
一定的变化 ：C4 中 miR319a 与 3 个靶基因（TCP4、
MYB33 和 Unknown） 的 相 关 系 数 均 大 于 SC124 中
miR319a 与相应靶基因的相关系数，而 miR319a 与
GSTU8（5766） 的 相 关 系 数 却 是 在 SC124 中 大 于
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A ：miR319 与靶基因 miR319a-4517（TCP4）在 C4 中的相关性分析 ；B ：miR319 与靶基因 miR319a-4517（TCP4）在 SC124 中的相关性分析 ；C ：miR319 与
靶基因 miR319a-4606（MYB33）在 C4 中的相关性分析 ；D ：miR319 与靶基因 miR319a-4606（MYB33）在 SC124 中的相关性分析 ；E ：miR319 与功能未知
靶基因 miR319a-1030（Unknown）在 C4 中的相关性分析 ；F ：miR319 与功能未知靶基因 miR319a-1030（Unknown）在 SC124 中的相关性分析 ；G ：miR319
与靶基因 miR319a-5766（GSTU8）在 C4 中的相关性分析 ；H ：miR319 与靶基因 miR319a-5766（GSTU8）在 SC124 中的相关性分析。图中横坐标和纵坐标
分别为 miR319a 与靶基因在 NC/NC、AT/NC、AH/NC 和 NAH/NC 四组比较中的相对表达量
图 3 miR319a 与其靶基因在两个品种中 4 个处理间的相关性分析
y =-0.091x + 0.559
R2 = 0.104
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4
31
9a
-5
76
6GSTU8
miR319a
SC124
y =-0.096x + 0.545
R2 = 0.112
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4
31
9a
-1
03
0unknown
miR319a
SC124
y =-0.099x + 0.547
R2 = 0.119
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4
31
9a
-4
60
6MYB33
miR319a
SC124
0
y =-0.073x + 0.635
R2 = 0.110
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4
31
9a
-4
51
7TCP4
miR319a
SC124
y =-0.291x + 4.002
R2 = 0.001
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4
31
9a
-5
76
6GSTU8
miR319a
C4
y =-8.147x + 11.00
R2 = 0.168
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4
31
9a
-1
03
0unknown
miR319a
C4
y =-6.782x + 9.282
R2 = 0.173
0
2
4
6
8
10
12
14
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4
31
9a
-4
60
6MYB33
miR319a
C4
y =-2.793x + 4.436
R2 = 0.136
0
1
2
3
4
5
6
7
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4
31
9a
-4
51
7TCP4
miR319a
C4
C D
E
G H
A
F
B
2015,31(11) 177曾长英等 ：miR319a 及其靶基因在木薯中的低温响应分析
C4 中的相关系数。miR319 与靶基因的相关系数及
R2 值在两个品种中从大到小的顺序一致，依次为
MYB33>Unknown>TCP4>GSTU8。
3 讨论
miRNA 在 植 物 中 一 般 是 通 过 对 其 靶 基 因 的
mRNA 进行剪切，从而实现其对靶基因的负向调控，
从我们的研究结果可以看出，剪切是具有时间、部位、
处理方式及品种特异性。本研究发现 miR319a 在 C4
和 SC124 两个木薯耐低温能力不同的品种中的 4 个
低温胁迫处理表现大体一致，且在 SC124 中的变化
幅度要大于 C4 中的变化幅度，尤其是在 NAH（从
正常的 25℃直接降到 4℃的非驯化低温伤害处理）
中两个品种的差别最大。由此可见，miR319a 在未
经过驯化的 NAH 下品种差异最大，而通过 14℃的
驯化处理（包括 AT 和 AH），miR319 所介导的靶基
因调控在两个品种低温响应模式趋于一致。前期表
型分析结果发现，在 NAH 处理下木薯植株在 4 个低
温处理中低温伤害最显著，且 SC124 的表型伤害要
重于 C4 的低温伤害［11］，说明 NAH 处理下两品种
miR319a 表达量变化某种程度上表征了木薯低温胁
迫的程度。
miR319 是目前研究比较深入的植物 miRNA，
它的靶基因涉及 TCP 转录因子和 MYB 转录因子，
调控着植物叶和花的发育及叶片的衰老。前人研究
证明在叶的发育阶段，靶基因 TCP 转录因子负调控
叶的发育进程，而在叶片的衰老阶段，靶 TCP 转录
因子正向调控叶的衰老进程［5，12］。这个现象与木薯
miR319a 在低温胁迫伤害表现最明显的 NAH 处理中
呈现出与靶基因明显的消长关系不谋而合，因为在
NAH 处理中的低温伤害中大量的叶片出现黄化、萎
蔫，甚至干枯掉落，是明显的衰老过程。而对于 AT
和 AH 这两个经历了 14℃亚低温驯化过程的处理来
说，明显削弱了 miR319 对衰老的正向促进作用，起
到一种类似于延缓衰老的客观效果，这与亚低温驯
化减轻低温胁迫伤害的生产实践经验也是一致的。
由 miR319a 与 4 个不同靶基因的表达量的拟合
方程来看，拟合方程的斜率（即相关系数）和 R2 值（即
拟合程度）都不是很显著，原因之一可能是 ：仅依
靠 miR319a 一个成员与其 4 个共同的靶基因做消长
关系的拟合方程可能会发生信息转换的不准确。因
为 miR319 家 族 中 有 miR319a、miR319b、miR319c
等 3 个成员，且 3 个成员在叶的生长发育中发挥着
截然不同的功能［6］，表达水平各不相同且有部分重
叠，解决办法是用更为特异的 stem-loop 方法准确定
量 miR319 的 3 个不同成员的表达量变化，进而区
分哪个 miR319 成员在哪个处理下与哪个靶基因之
间具有明显的消长关系。
miR319a 与 4 个不同靶基因表达量的拟合方程
中的相关系数表明，与 miR319a 相关系数从大到小
的 靶 基 因 依 次 为 MYB33>Unknown>TCP4>GSTU8。
本研究组前期工作发现，在木薯低温胁迫的 NAH
处理中检测到 miR319a 对 TCP4（4517）在 miRNA
与 mRNA 结合区的第 8 个碱基处有剪切作用，但
miR319 的另外一个基因 GSTU8（5766）与 miR319
匹配区内未检测 miR319a 对它的剪切事件［13］。这
进一步验证了 miR319a 与 TCP4 的拟合方程中的相
关系数（-2.793，R2 为 0.136）也显著大于 miR319a
与 GSTU8 的相关系数（-0.091，R2 为 0.104）。此外，
我们还发现比经典靶基因 TCP4，与 miR319a 的相关
系数更高的有 MYB33 和功能未知基因（021030 m）
两 个 靶 基 因， 预 示 着 miR319 的 靶 基 因 MYB33 和
Unknown 处于更为优先的调控目标，MYB33 作为
miR319 的靶基因主要在花的发育过程中起着重要的
调控作用，如影响植物雄蕊的育性［14］。但 miR319
对 MYB33 和 Unknown 的调控作用在木薯的低温逆
境适应性过程中起着怎样的作用，是下一步值得深
入研究的问题。
4 结论
成功克隆并报道了 miR319a 及其 4 个不同靶
基因在两个木薯品种低温胁迫的响应特征，通过
miRNA 与靶基因之间在不同低温处理间的比较分析
表 明，miR319a 对 MYB33 和 Unknown（021030m）
两个靶基因的调控在木薯的低温适应性上有着重要
作用，是木薯低温适应性遗传改良的重要候选基因。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）