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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第10期
收稿日期 : 2012-04-05
基金项目 : 国家星火计划项目（2010GA870003）, 青海省科技计划项目（2010-Z-718）, 青海省犏牛示范项目（青农函 [2010]395 号）
作者简介 : 付永 , 男 , 硕士 , 助理研究员 , 研究方向 : 分子遗传学 ; E-mail: qhfuyong@163.com
通讯作者 : 魏雅萍 , 女 , 研究员 , 研究方向 : 动物遗传育种与繁殖 ; E-mail: yapingyue@yahoo.com
牦牛是青藏高原主要畜种，具有耐粗、耐寒等
特性，对高寒缺氧的高原环境具有极强的适应性，
为了提高牦牛的生产性能，我国从 20 世纪 50 年代
开始采用良种黄牛与牦牛进行杂交，杂种一代犏牛
生产性能明显优于牦牛，但由于犏牛雄性不育使其
在生产和育种中的应用均受到了极大的限制。因此，
Real-time PCR检测黄牛、牦牛、犏牛睾丸组织中
Boule、Dazl基因 mRNA表达
付永1 魏雅萍1 吴克选1 陈生梅1 张立成2 王谢忠2 孟茹3
（1 青海省畜牧兽医科学院，西宁 810016 ；2 青海省动物疫病预防控制中心，西宁 810001 ；3 西宁市畜牧兽医站，西宁 810003）
摘 要： 旨在探讨 DAZ基因家族 Dazl和 Boule基因与犏牛雄性不育的关系。采用实时荧光定量 PCR技术检测黄牛、牦牛和
犏牛睾丸组织中 DAZ基因家族 Boule和 Dazl基因mRNA表达并进行分析。结果表明，Boule和 Dazl熔解曲线扩增产物呈现单特异峰，
具有较高的灵敏度和特异性；标准曲线显示 Ct值与重组质粒浓度间线性关系良好，相关系数均大于 0.999；mRNA表达分析显示，3
种牛中 Dazl基因在犏牛睾丸组织中表达量最低，其中黄牛与牦牛、黄牛与犏牛差异显著（P<0.05），犏牛与牦牛差异不显著（P>0.05）；
Boule基因在 3种牛睾丸组织中的表达量显示，黄牛与牦牛差异不显著（P>0.05），黄牛、牦牛与犏牛差异显著（P<0.05）。结果提示，
Dazl和 Boule基因可作为研究犏牛雄性不育的候选基因。
关键词： 犏牛 雄性不育 Boule基因 Dazl基因 荧光实时定量 PCR
Expression of Boule and Dazl mRNA in Cattle，Yak and Cattle-yak
Testis Tissue by Real-time PCR
Fu Yong1 Wei Yaping1 Wu Kexuan1 Chen Shengmei1 Zhang Licheng2 Wang Xiezhong2 Meng Ru3
（1Qinghai Academy of Animal and Veterinary Science，Xining 810016；2Qinghai Animal Disease Control Center，Xining 810001；
3Animal Husbandry and Veterinary Station of Xining，Xining 810003）
Abstract: To study the relationship of Dazl and Boule gene that was in DAZ gene family with cattle-yak. Using Real-time fluorescence
quantitative PCR technique to detect and analysis the expression of Boule and Dazl mRNA in cattle, yak and cattle-yak testis tissue. The
melting curve analysis showed the product was specific to a single peak, with high sensitivity and specificity. The results showed a good linear
relationships （R2>0.999） between the Ct value and the concentration of plasmid for each gene on the condition. The results showed that, testis
tissue expression of Dazl gene in cattle-yak is the lowest, in which cattle and yak, cattle and cattle-yak were significant difference （P<0.05）,
cattle-yak and yak was not significant difference （P>0.05）； testis expression of Boule gene in three bovine showed that, no significant difference
of cattle and yak （P>0.05）, cattle and yaks had significant difference （P<0.05） with cattle-yak. The results suggest that, Dazl and Boule gene
can be a candidate gene for male sterility of cattle-yak.
Key words: Cattle-yak Male infertility Boule gene Dazl gene Real-time quantitative PCR
近年来犏牛雄性不育的研究是牦牛杂交改良中的一
大热点和难点［1，2］。当前对牦牛远缘杂种不育问题
的研究还基本停留在形态组织学观察的水平上［3］，
在基因水平的研究甚少。
DAZ 基因家族包括 Daz（Deleted in Azoospermia）、
Dazl（DAZ-like）和 Boule 基因，三者的编码蛋白均
2012年第10期 151付永等 ：Real-time PCR 检测黄牛、牦牛、犏牛睾丸组织中 Boule、Dazl 基因 mRNA 表达
为 RNA 结合蛋白，在生殖细胞中特异表达，参与调
节生殖细胞的发育和分化，是精子发生过程中减数
分裂的主要调控因子［4］。Dazl 基因在脊椎动物的生
殖细胞中表达，对生殖细胞的分化非常重要，突变
或缺失将导致雄性不育［5］。Boule 基因在睾丸组织
中特异表达，是精子发生过程中减数分裂转换的主
要调控因子，可能是牛精子发生的潜在调控因子［6］。
实时荧光定量 PCR 技术具有敏感、快速和准确等特
点，目前成为研究基因表达的首选方法［7］。
本研究采用 Real-time PCR 检测黄牛、牦牛和犏
牛睾丸组织中 Dazl 和 Boule 基因 mRNA 表达，探析
DAZ 基因家族中 Dazl 和 Boule 基因与犏牛雄性不育
的关系，旨在为揭示牦牛杂种的不育机制提供理论
依据和技术支持。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验动物 在青海省贵南县过马营镇选取成
年健康公黄牛、公牦牛和公犏牛各 10 头，屠宰后立
即采集睾丸，迅速置于液氮中保存。
1.1.2 主要试剂和仪器 总 RNA 提取试剂盒为上
海飞捷生物有限公司产品 ；反转录试剂盒和 SYBR
Premix Ex TaqTM II 荧光定量试剂盒为大连 TaKaRa 公
司产品 ；PCR 扩增试剂盒和质粒 DNA 抽提试剂盒
为上海生工生物工程有限公司产品 ；胶回收试剂盒
为 OMEGA 公司产品。凝胶成像系统（Dolphin-Doc，
美国 Wealtec 公司）、PCR 仪和实时荧光定量 PCR 仪
（ABI 7500，美国 ABI 公司）。
1.2 方法
1.2.1 引物设计与合成 以看家基因β-actin 为内参，
从 GenBank 检 索 牛 Dazl（GenBank 登 录 号 EF50-
1823.2）、Boule（GenBank 登 录 号 EU050657.1） 和
β-actin（GenBank 登录号 NM_173979）mRNA 序列，
综合考虑引物设计的各项原则，在 Primer Premier 3.0
软件中设计引物。引物由上海生工生物工程有限公
司合成，引物序列的相关信息见表 1。
表 1 引物信息
基因 引物序列（5-3） 扩增长度（bp） 退火温度（℃）
Dazl F ：tcctcctccaccacaatttcR ：gctccggtgtcaacttcatt 270 57
Boule F ：acttctgtcccaccaccttgR ：aggcaggagactgaggaaca 154 56
β-actin F ：tccctggagaagagctacgaR ：tagaggtccttgcggatgtc 179 58
1.2.2 RNA 提取与反转录 各牛睾丸组织的总 RNA
提取按照总 RNA 抽提试剂盒（上海飞捷生物有限
公司）的操作说明书进行，提取结果用紫外分光光
度计和琼脂糖电泳检测其质量。采用反转录试剂盒
进行 RNA 反转录。反应体系为 20 μL ：包括 5 μL 总
RNA，反转录酶 1 μL，oligo（dT）引物 1 μL，随机
引物 1 μL，5×RT Buffer 4 μL，加 ddH2O 至 20 μL 混
匀，37℃ 15 min，85℃ 5 s。反转录产物于 -20℃保存。
1.2.3 Dazl 和 Boule 基因 PCR 扩增、克隆测序
及 Real-time PCR 反应 使用 PCR 扩增试剂盒进行
PCR 扩增。扩增体系为 25 μL ：包括 12.5 μL 2×PCR
buffer，0.6 μL 上游引物，0.6 μL 下游引物，5 μL RT
产物，加水至 25 μL。扩增程序 ：94℃ 4 min ；95℃
50 s，退火（温度参见表 1）30 s，72℃ 30 s，40 个
循环；72℃ 7 min。PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳分离，
用 E.Z.N.A.TM DNA 凝胶回收试剂盒纯化（按说明书
操作）。回收的 DNA 片段与 pMD18-T Simple vector
载体连接并转化 DH5α 菌株。挑取阳性克隆，用
SanPrep 柱式质粒 DNA 抽提试剂盒提取质粒，PCR
鉴定后送上海生工生物工程有限公司测序。
mRNA 表达水平利用 ABI7500 实时荧光定量仪
来评估。使用 SYBR Premix Ex TaqTM II 荧光定量试
剂盒进行定量 PCR。反应体系为 20 μL ：包括模板 2
μL，SYBR Premix Ex TaqTM II （2×） 10 μL，10 μmol/L
上游引物 0.8 μL，10 μmol/L 下游引物 0.8 μL，Rox
Reference Dye II （50×） 0.4 μL，加无菌双蒸水 6 μL。
反应程序 ：95℃预变性 30 s ；95℃ 5 s，退火（温度
参见表 1）20 s，72℃ 34 s，40 个循环 ；95℃ 15 s，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第10期152
60℃ 1 min，95℃ 15 s，以 β-actin 为内参，每个样
品 3 个重复。分别取 Boule 和 Dazl 10 倍系列稀释
的（100-10-6）7 个克隆有目的片段的重组质粒作为
标准品，根据优化的条件在 ABI 7500 荧光定量 PCR
仪上进行扩增，采用三步法进行反应，反应体系为
20 μL，采用自动分析软件绘制标准曲线。
1.2.4 数据统计 定量结果用 SPSS17.0 软件进行统
计分析，文中数据均为平均数 ± 标准差（Mean±SD）
采用 One-Way ANOVA 分析，P<0.05 为差异有显著
性意义。
2 结果
2.1 RT-PCR 扩增结果
如图 1 所示，在黄牛、牦牛和犏牛睾丸组织中，
Dazl、Boule 和 β-actin 基因引物的 RT-PCR 扩增特异
性条带分别为 270 bp、154 bp 和 179 bp，与预期结
果一致。将 Dazl、Boule 和 β-actin 基因的扩增片段
克隆于 pMD18-T vector 中，用 DNAMAN 对测序结果
与引物设计源序列进行同源性比较，结果显示各基
因与引物设计源序列同源性达 99%，表明 PCR 扩增
片段为黄牛、牦牛和犏牛特异的 Dazl、Boule 和 β-actin
图 1 黄牛、牦牛和犏牛睾丸组织中 Dazl、Boule和 β-actin基因的 RT-PCR电泳图
M. DL1200 DNA Marker；1-3.分别为黄牛、牦牛和犏牛 Dazl基因扩增片段；4-6.分别为黄牛、牦牛和犏牛 Boule基因扩增片段；
7-9.分别为黄牛、牦牛和犏牛 β-actin基因扩增片段
基因 cDNA 片段。
2.2 标准曲线的建立及熔解曲线分析
Boule 和 Dazl 基因 10 倍系列稀释的（100-10-6 ）
7 个拷贝量的重组质粒作为标准品，根据优化的条
件在 ABI 7500 荧光定量 PCR 仪上进行扩增，采用
自动分析软件绘制标准曲线（图 2，图 3）反应呈现
良好的线性关系，相关系数均在 0.999 以上，对熔
解曲线（图 4，图 5）分析表明，溶解温度 Tm=（84±
0.4）℃处出现单特异峰，无引物二聚体及非特异性
扩增产物出现，扩增效果良好。
2.3 黄牛、牦牛和犏牛睾丸组织Dazl基因mRNA表
达水平
用Real-time PCR法对 3种牛Dazl 基因表达量进
行分析，结果（表 2，图 6）显示，黄牛睾丸组织
Dazl 基因 mRNA 表达量（8.398 0±2.261 46）均显著
高于牦牛睾丸组织 Dazl 基因 mRNA 表达量（1.202 0±
0.705 39），与犏牛睾丸组织 Dazl 基因 mRNA 表达
量（0.981 0±0.258 99）（P<0.05）。而牦牛睾丸组织
Dazl 基因 mRNA 表达量（1.202 0±0.705 39）和犏牛
睾丸组织Dazl基因mRNA表达量（0.981 0±0.258 99）
差异不显著（P>0.05）。
2.4 黄牛、牦牛和犏牛睾丸组织Boule基因mRNA
表达水平
用 Real-time PCR 法对 3 种牛 Boule 基因表达量
进行分析，结果（表 3，图 7）显示，黄牛睾丸组织
Boule 基因 mRNA 表达量（11.433 4±0.997 78）、牦牛
睾 丸 组 织 Boule 基 因 mRNA 表 达 量（11.156 3±
1.137 36），均显著高于犏牛睾丸组织 Boule 基因
mRNA 表达量（5.900 7±0.775 76）（P<0.05），而黄牛
睾 丸 组 织 Boule 基 因 mRNA 表 达 量（11.433 4±
0.997 78）与牦牛睾丸组织 Boule 基因 mRNA 表达量
（11.156 3±1.137 36）差异不显著（P>0.05）。
2012年第10期 153付永等 ：Real-time PCR 检测黄牛、牦牛、犏牛睾丸组织中 Boule、Dazl 基因 mRNA 表达
3 讨论
荧光定量 PCR 技术为组织 mRNA 检测提供了
一种敏感性和准确性较高的试验方法［8］。目前，常
图 2 Boule基因荧光定量 PCR标准曲线 图 3 Dazl基因荧光定量 PCR标准曲线
图 4 Boule基因荧光定量 PCR熔解曲线
图 6 黄牛、牦牛和犏牛睾丸组织 Dazl基因
mRNA表达水平
不同字母表示差异显著（P＜ 0.05），相同字母表
示差异不显著（P＞ 0.05）。下同
图 5 Dazl基因荧光定量 PCR熔解曲线
图 7 黄牛、牦牛和犏牛睾丸组织 Boule
基因 mRNA表达水平
表 2 黄牛、牦牛和犏牛睾丸组织 Dazl基因mRNA
表达水平的方差分析
变异来源
Dazl
平方和（SS） 自由度（df） 均方（MS） F 值
种类间 356.144 2 178.072 94.071*
种类内 51.110 27 1.893
总变异 407.253 29
* 表示差异显著。下同
表 3 黄牛、牦牛和犏牛睾丸组织 Boule基因 mRNA
表达水平的方差分析
变异来源 Boule平方和（SS） 自由度（df） 均方（MS） F 值
种类间 194.363 2 97.181 100.848*
种类内 26.018 27 0.964
总变异 220.381 29
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第10期154
用的荧光定量 PCR 包括荧光探针和 SYBR Green Ι
两种方法，其中 SYBR Green Ι 具有操作简单、成
本低、无污染、高效益、引物设计合成简便等优点，
是目前研究基因表达较为常用的方法之一［9］。本研
究 Boule 和 Dazl 基 因 SYBR Green Real-time PCR 熔
解曲线扩增产物呈现单特异峰，由于 SYBR Green Ι
是一种能够与任何 dsDNA 结合而发出荧光，其反应
的特异性完全取决于扩增的引物［10］，表明所设计的
引物具有较好的特异性，同时 Boule 和 Dazl 基因的
SYBR Green Real-time PCR相关系数均在0.999以上，
表明 Ct 值与重组质粒浓度间具有良好的线性关系。
DAZ 基因家族包括 Daz、Dazl 和 Boule 基因，
是精子生成的重要调控因子。Dazl 起源于 Boule 基
因，位于人类 2 号染色体，Boule 位于人类的 3 号染
色体上，是 DAZ 基因家族的祖先基因［11］。1997 年，
Reijol 等［12］克隆了小鼠 DAZ 同源基因 Dazl，它定
位于小鼠 17 号染色体，在睾丸中表达而在无精小鼠
中未检测到 Dazl 基因的表达。Dazl 基因是脊椎动物
亚门各物种精子发生的重要调控因子［13-15］，在脊椎
动物的生殖细胞中特异表达，对生殖细胞的分化非
常重要，突变或缺失将导致雄性不育［16］，所以推测
Dazl 基因在牦牛的精子生成过程中也起着重要的作
用。张庆波［17］对黄牛、牦牛和犏牛 Dazl 基因的组
织表达特征进行分析，结果显示，Dazl 基因仅在成
年黄牛和成年牦牛睾丸、卵巢组织中表达，在成年
犏牛的卵巢组织中表达，而在睾丸组织中检测不到
表达信号，得出了 Dazl 基因与犏牛的雄性不育有关。
而本研究采用实时荧光定量 PCR 技术检测 Dazl 基因
在 3 种牛睾丸组织中的表达量，研究结果显示犏牛
睾丸组织中有 Dazl 基因的表达，只是在睾丸组织中
的表达量很低，其中黄牛与牦牛、黄牛与犏牛差异
显著（P<0.05），犏牛与牦牛差异不显著（P>0.05），
说明 Dazl 基因是一个与生殖相关的基因。
1996 年，Eberhart 等［18］在果蝇中发现了 DAZ
基因的同源基因 Boule，与 DAZ 基因一样，Boule 基
因的编码蛋白含有一个 RNA 结合基序，在睾丸组织
中特异表达，进一步研究发现，Boule 基因是精子发
生过程中减数分裂转换的主要调控因子，果蝇、人
等睾丸组织 Boule 基因表达缺乏会导致无精子症并
产生不育［19］，所以推断和其它动物一样，Boule 基
因与牦牛的精子生成过程密切相关。李新福［20］对
犏牛和黄牛睾丸组织中 Boule 基因 mRNA 表达水平
进行了荧光定量 PCR 检测，结果显示，Boule 基因
在黄牛睾丸组织中 mRNA 表达量高于犏牛 ；而本研
究对 Boule 基因在黄牛、牦牛和犏牛 3 种牛睾丸组
织的表达量同时进行实时荧光定量 PCR 检测，结
果显示黄牛睾丸组织中 Boule 基因 mRNA 表达量与
牦牛差异不显著（P>0.05），黄牛、牦牛与犏牛差
异显著（P<0.05）。这可能是由于 Boule 基因突变
主要影响第一次减数分裂中期生殖细胞，使其不
能形成正常的染色体，不能发生细胞核膜分解有
关［21］，同时 Boule 基因 mRNA 表达水平降低可能
与犏牛精母细胞减数分裂障碍有关。本研究在犏牛
中检测到有 Boule 基因的表达而且表达量显著低于
黄牛和牦牛，可作为研究犏牛雄性不育的重要候选
基因。
4 结论
本试验采用 SYBR Green Real-time PCR 检测黄
牛、牦牛和犏牛睾丸组织中 DAZ 基因家族 Boule 和
Dazl 基因 mRNA 表达，结果显示 Boule 和 Dazl 基
因熔解曲线扩增产物呈现单特异峰，表明所设计的
引物具有较好的特异性，标准曲线显示 Ct 值与重
组质粒浓度间线性关系良好，表明试验可靠性较
高。mRNA 表达分析结果显示，Boule 和 Dazl 基因
在犏牛睾丸组织中表达量最低，这一分布可能与犏
牛精子发生过程中减数分裂调控作用相关，有待进
一步深入研究。本研究进一步证实了 DAZ 基因家族
Boule 和 Dazl 基因可作为研究犏牛雄性不育的候选
基因，最终为揭示牦牛杂种不育机制提供技术平台。
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（责任编辑 马鑫）