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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第5期
收稿日期 : 2011-11-01
基金项目 : 江苏大学高级人才启动基金资助项目（1281370001）
作者简介 : 闻崇炜 , 男 , 博士 , 研究方向 : 基因工程药物研发 ; E-mail: wenchw@ujs.edu.cn
响应面分析法优化重组原动蛋白 2β
诱导条件的研究
闻崇炜 刘瑞江 毛春友 胡萍萍 王亚丽
（江苏大学药学院，镇江 212013）
摘 要： 原动蛋白 2β（PK2β）是近年新发现的一个选择性激活 PKR1的蛋白质因子。采用响应面分析法（RSM）研究了利
用重组 BL21（DE3）表达 PK2β的最优诱导条件。结果表明，诱导时机与诱导物浓度对 PK2β的表达水平具有显著性影响，但诱
导时间不具有显著性影响。试验数据拟合与极值分析表明最优诱导条件为工程菌 OD600为 0.50时，采用终浓度为 0.11 mmol/L的
IPTG在 37℃诱导培养 7.73 h，此时 PK2β表达水平可达 242.78 mg/L。验证试验结果表明，重组 PK2β的表达水平比优化前提高了
46%，而 IPTG的用量减少了 89%，有利于大量制备该蛋白质进行后续功能研究及应用研究。
关键词： 原动蛋白 2β（PK2β） 响应面法 诱导时间 诱导物浓度 诱导时机 优化
Determination of Optimal Induction Conditions by Response Surface
Methodology： the Case of Recombinant Prokineticin 2β
Wen Chongwei Liu Ruijiang Mao Chunyou Hu Pingping Wang Yali
（School of Pharmacology，Jiangsu University，Zhenjiang 212013）
Abstract: Prokineticin 2β（PK2β）has been recently identified as a selective ligand for PK receptor 1. Herein, response surface
methodology（RSM）was applied to optimize induction conditions for high level expression of PK2β by recombinant Escherichia coli BL21（DE3）.
The results showed that time-point of induction and inducer concentration had significant effects on yield of recombinant PK2β. The optimal
induction conditions were as follows ： OD600 0.50 for induction-starting cell density, 0.11 mmol/L for IPTG concentration and 7.73 h for post-
induction time. The maximum yield of PK2β in shake flask experiment reached 242.78 mg/L when engineering bacteria were cultured under the
optimal conditions. The results of verification experiments showed that the yield of PK2β was 46% higher than that before optimization and the
usage of IPTG was saved up to 89% than the previous usage. The results will be helpful for large-scale preparation of PK2β for further function
and application study.
Key words: Prokineticin 2β（PK2β） Response surface methodology（RSM） Post-induction time Inducer concentration Time-
point of induction Optimization
原动蛋白 2（Prokineticin 2，PK2）是一个可以
传递生物节律、影响新生神经元迁移、促进睾丸血
管新生及影响胃肠道平滑肌收缩的多功能活性蛋白
质因子［1-5］。近年研究又发现 PK2 基因转录中还可
以发生可变剪接，相应的 mRNA 翻译后经弗林酶加
工后可生成一个衍生蛋白质因子，被命名为原动蛋
白 2β（Prokineticin 2β，PK2β）［6］。PK2β 可以选择
性地与 PK2 的受体之一即 PKR1 结合，但不与另一
受体 PKR2 结合，但是其具体生理功能尚未得到阐
明，因此，利用基因工程技术表达该蛋白质对后续
理论及应用研究具有重要意义。
基因工程技术表达重组蛋白质时，其效率不仅
受宿主菌、表达载体及目的基因的影响，还与所采
用的诱导条件紧密相关［7-11］。例如，以常用的 T7 表
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第5期174
达系统为例，诱导物（IPTG）的添加时机、终浓度
及诱导后培养时间的长短均为影响目的蛋白表达水
平的重要因素。目前常用单次单因子法进行诱导条
件的优化，而没有考虑多个因素之间的协调作用，
对提高重组蛋白表达水平往往收效不大。
响应面分析法（Response surface methodology，R-
SM）是由 Box 等提出的一种优化工艺条件的有效方
法，利用合理的试验设计，采用多元二次回归方程
拟合多种变量与响应值之间的函数关系，可以研究
因子与响应值之间、因子与因子之间的相互关系及
其主效应和交互效应，从而通过对回归方程的分析
来获取最优工艺参数。RSM 目前已经广泛用于农业、
生物、食品、化工等领域，成功提高了草鱼皮中明
胶及印加树叶中酚类物质的提取率、优化了培养基
组成以提高虾青素产量、同时还用于双歧杆菌与单
胞菌培养条件的优化、高效氯氰菊酯降解条件及细
胞因子免疫应答试验条件的优化，但是利用 RSM 优
化重组蛋白诱导条件的报道还较少见［12-18］。
本研究旨在利用 RSM 分析诱导时机、诱导物浓
度、诱导时间及其相互作用对重组 BL21（DE3）菌
株表达 PK2β 的影响，并对这 3 个重要的诱导条件
进行优化，从而为大量制备该蛋白质并用于后续功
能及应用研究提供有效的条件与方法。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 材料 表达重组 PK2β 的菌株 E. coli BL21
（DE3）由本实验室构建。
1.1.2 主要试剂 LB 培养基 ：蛋白胨 1%，酵母膏
0.5%，NaCl 1%。蛋白胨与酵母膏购自 OXOID 公司。
IPTG、考马斯亮蓝、卡那霉素购自 BBI 公司（Bio
Basic Inc.）。溴酚蓝购自 AMRESCO 公司。丙烯酰胺
（超级纯）、N，N- 亚甲基双丙烯酰胺（超级纯）购
自生工生物工程（上海）有限公司。过硫酸铵、N，N，
N，N- 四甲基二乙胺、乙醇、冰醋酸等其他试剂均
为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。
1.2 方法
1.2.1 种子培养及诱导表达 取 3 μL 重组 E. coli
BL21（DE3）冻存液接种到 3 mL 新鲜 LB 培养基（含
50 μg/mL 卡那霉素）中，37℃以 220 r/min 转速过夜
培养至OD600达到3-4左右。随后将种子菌液按照1‰
的比例转接到 50 mL 新鲜 LB 培养基（含 50 μg/mL
卡那霉素）中，37℃以 220 r/min 转速培养，待菌液
密度达到试验方案预定的 OD600，加入 IPTG 至预定
浓度以诱导工程菌表达重组 PK2β。
1.2.2 分析方法 诱导时机以加入 IPTG 时工程菌
液的 OD600 值表示，IPTG 的终浓度为诱导物浓度，
诱导时间指从加入 IPTG 起至培养终止时持续的时
间。重组 PK2β 的表达量通过十二烷基磺酸钠 - 聚
丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）及光密度扫描法测定，
所采用的定量分析软件为 Quantity OneTM v 4.5 软件
（Bio-Rad Laboratories Inc.）。SDS-PAGE 所使用设备
为 Mini-PROTEAN 3 电泳系统（Bio-Rad Laboratories
Inc.）。
1.2.3 试验设计
1.2.3.1 单因素试验设计 分别对影响诱导效果的
诱导时间、诱导时机及诱导物浓度进行考察。首先
固定诱导时机及诱导物浓度，设定不同的诱导时间，
以分析诱导时间长短对重组 PK2β 表达量的影响。
随后固定诱导时间及诱导物浓度，设定不同的诱导
时机，以分析诱导时机对重组 PK2β 表达量的影响。
此外，固定诱导时间及诱导时机，设定不同的诱导
物浓度，以分析诱导物浓度高低对重组 PK2β 表达
量的影响。
1.2.3.2 响应面试验设计 根据单因素试验结果，
利用 Box-Behnken 设计对诱导条件进一步优化。每
个因素取 3 个水平，在中心点上有 3 个重复。用多
项式回归分析对试验数据进行拟合，得到一个关于
响应变量（因变量）与自变量（操作条件）的二阶
模型，可用如下二次多项式描述，Yi =β0 + ∑ βi Xi
+ ∑ βii Xi2 + ∑∑ βij Xi Xj，式中 Yi为预测响应值，Xi
为各因素水平值，β0，βi，βii分别是偏移项、线性偏
移项和二阶偏移项，βij为交互作用系数。
1.2.4 模型拟合和验证 对优化试验所得的试验数
据与响应面模型进行拟合，得到模型中的各系数。
再对该多元函数进行分析以确定其极值点以及取得
极值时相应自变量值。最后按照计算所得到的参数
进行试验以验证模型的可靠性，确定最后的优化结
果。试验数据均用Design-Expert 7.0.0 软件 （Stat-Ease
Inc.）处理分析。
2012年第5期 175闻崇炜等 ：响应面分析法优化重组原动蛋白 2β 诱导条件的研究
2 结果
2.1 单因子试验结果
首先进行 3 组单因素试验，分别改变诱导时间、
诱导时机或诱导物浓度，考察对重组 PK2β 表达水
平的影响。
选取工程菌密度为 OD600=0.6 时，以 1 mmol/L
IPTG进行诱导，诱导时间分别为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、
6.0、7.0、8.0 和 9.0 h，收集样品，分析重组 PK2β
表达水平。结果（图 1-A）显示，诱导时间低于 6 h
时，PK2β 表达水平随诱导时间延长而逐步升高，但
是诱导时间长于 6 h 后，PK2β 表达水平没有显著增
长，甚至还略有降低。因此，工程菌的最佳诱导时
间范围为 4.0-8.0 h。
分别选择工程菌培养液的 OD600 为 0.1、0.2、0.3、
0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 和 0.9 时，以 1 mmol/L IPTG
进行诱导培养，诱导时间设定为 6 h，收集样品，分
析重组 PK2β 表达水平。结果（图 1-B）显示，当工
程菌培养液 OD600 低于 0.4 时开始诱导表达，重组
PK2β 表达水平较低，表明诱导时机选择过早，当
OD600 高于 0.6 时开始诱导，重组 PK2β 表达水平也
不高，表明诱导时机选择过晚，因此，最佳诱导时
机为工程菌 OD600 范围介于 0.2-0.6。
选取工程菌 OD600 为 0.4 时，分别加入 IPTG 至
终浓度为 0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0
和 5.0 mmol/L，诱导培养 6.0 h 后收集样品。结果（图
1-C）表明，随着 IPTG 浓度升高，重组 K2β 表达水
平也逐步升高，但是当 IPTG 浓度达到 0.5 mmol/L
后，重组 PK2β 表达水平基本不再随 IPTG 浓度升高
而发生变化，因此，最佳 IPTG 浓度范围介于 0.1-1.0
mmol/L。
2.2 响应面优化试验
本试验根据单因素试验结果确定 RSM 试验中的
试验因素及各水平的取值，具体条件为诱导时间 6.0
h，诱导时机 OD600=0.4，IPTG 终浓度 0.5 mmol/L，
设计 3 因素 3 水平试验以探讨三者之间的交互作用，
对诱导条件进行优化。各因素与水平编码表见表 1。
试验设计及每次试验结果见表 2。
2.3 RSM优化试验结果的计算与分析
对试验结果采用 Design-Expert 7.0.0 软件进行多
图 1 诱导时间、诱导时机及诱导物浓度对重组
PK2β表达水平的影响
表 1 Box-Behnken试验因素与水平
试验因素 代码 编码水平- 0 +
诱导时间（h） A 4.0 6.0 8.0
诱导时机（OD600） B 0.2 0.4 0.6
诱导物浓度（mmol/L） C 0.1 0.55 1.0
表 2 Box-Behnken试验设计与结果
试验编号 诱导时间 （h）
诱导时机
（OD600）
诱导物浓度
（mmol/L）
PK2β 表达水平
（mg/L）
1 4.0 0.4 1.0 190.88
2 8.0 0.6 0.55 192.56
3 8.0 0.4 0.1 237.85
4 6.0 0.4 0.55 167.32
5 4.0 0.6 0.55 162.19
6 6.0 0.4 0.55 170.39
7 6.0 0.2 1.0 142.11
8 6.0 0.6 0.1 200.81
9 6.0 0.2 0.1 143.41
10 6.0 0.4 0.55 179.66
11 8.0 0.2 0.55 97.15
12 4.0 0.2 0.55 95.06
13 4.0 0.4 0.1 230.56
14 6.0 0.6 1.0 163.61
15 8.0 0.4 1.0 163.44
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第5期176
元回归拟合，表明 PK2β 表达水平对自变量（诱导
时间、诱导时机及诱导物浓度）的函数关系符合以
下二次多项方程 ：
表达水平=39.32-12.22A+888.84B-104.78C+17.68
AB-9.65AC-99.72BC+0.94A2-986.43B2+145.61C2。
其中 A、B、C 分别为诱导时间、诱导时机及 IPTG 终
浓度。
二次响应面回归模型的方差分析结果（表 3）
表明，回归模型显著（P<0.05），失拟项不显著
（P>0.05），表明模型的拟合性较好。由回归方程可
以看出，B 因素（诱导时机）较其他因素对 PK2β 表
达水平的影响更为显著（P<0.01），C 因素（诱导物
浓度）次之（P<0.05），A 因素（诱导时间）的影响
最弱（P>0.05）。
表 3 回归方程方差分析表
总方差 自由度 平均方差 F 值 Prob>F
模型 20790.36 9 2310.04 5.73 0.0345
A（诱导时间） 18.94 1 18.94 0.047 0.8370
B（诱导时机） 7286.66 1 7286.66 18.06 0.0081
C（诱导物浓度） 2910.46 1 2910.46 7.21 0.0435
AB 199.94 1 199.94 0.50 0.5129
AC 301.54 1 301.54 0.75 0.4268
BC 322.20 1 322.20 0.80 0.4124
A2 51.66 1 51.66 0.13 0.7351
B2 5748.41 1 5748.41 14.25 0.0130
C2 3210.05 1 3210.05 7.96 0.0371
残差 2017.21 5 403.44
失拟项 1934.66 3 644.89 15.63 0.0607
净误差 82.54 2 41.27
总误差 22807.57 14
为了更直观地描述诱导条件对目的蛋白表达
水平的影响，以三维坐标图表示各因素对响应值的
影响关系。极值分析结果（图 2）表明，获得重组
PK2β的最优诱导条件为当工程菌的OD600 为 0.50时，
采用终浓度为 0.11 mmol/L 的 IPTG 在 37℃诱导培养
7.73 h，此时目的蛋白的表达水平可达 242.78 mg/L。
为了验证模型的准确性和有效性，在预测最优表达
条件下进行诱导试验，重组 PK2β 的实际表达水平
为 257.12 mg/L，可见该模型能够较好地预测蛋白表
A. 诱导时间固定为 6.0 h ；B. IPTG 浓度固定为
0.55 mmol/L ；C. 诱导时机固定为 OD600=0.4
图 2 重组 PK2β表达水平的响应面立体图
2012年第5期 177闻崇炜等 ：响应面分析法优化重组原动蛋白 2β 诱导条件的研究
达。与初始条件（工程菌的 OD600 为 0.40，IPTG 终
浓度为 1 mmol/L，诱导时间为 6 h）时的表达水平相
比，优化后的表达水平提高了 46%，而 IPTG 的用
量减少了 89%。鉴于 IPTG 价格较高，上述优化不仅
可以显著降低成本，还有利于获得大量重组 PK2β。
3 讨论
采用基因工程菌大量表达重组蛋白时会影响自
身其他蛋白质的合成，对自身造成代谢负担并且影
响其生长情况，因此恰当的诱导条件需要满足工程
菌总体可生长至较高密度，同时工程菌个体处于良
好生理状态，从而有利于高水平提高重组蛋白表达
水平［7-11］。
诱导时间的长短对重组蛋白的表达水平具有显
著影响。一般延长诱导时间有利于菌体内积累更多
的重组蛋白，但诱导时间过长意味着每次培养耗时
较长，不利于提高生产效率，并且有部分菌体可能
发生自溶而损失胞内重组蛋白。
诱导时机的选择需要兼顾工程菌总体的生长密
度与工程菌个体的生理状态。诱导时机过早意味着
在工程菌总体密度不高时就开始表达重组蛋白，过
早对工程菌造成代谢负担而不利于增殖，不利于提
高总表达水平。诱导时机过晚意味着工程菌个体生
理状态不佳而降低单位表达水平，也不利于提高总
表达水平。
诱导物用量高低与启动子能否发挥完全效率相
关。诱导物用量过低，不足以充分发挥启动子作用，
而不利于高水平表达重组蛋白。诱导物用量过高，
会导致工程菌过度表达重组蛋白，而影响自身增殖
相关蛋白质的合成，进而影响工程菌总体生长密度
而降低重组蛋白最终表达水平。因此，有报道表明
适度降低诱导物用量反而有利于提高重组蛋白表达
水平［19, 20］。
综上所述，在实际诱导过程中，诱导时间、诱
导时机与诱导物浓度这 3 个因素并非相对独立的事
件，而是一个有机整体。三者之间相互影响，具有
协同作用。要建立高效表达重组蛋白的最佳诱导条
件，必须充分考虑各种因素之间的交互作用，RSM
比单次单因子法更适用于快速有效的确定大肠杆菌
表达重组蛋白时所需的最优诱导条件。
4 结论
本试验获得了重组 BL21（DE3）工程菌表达
PK2β 的最优诱导条件，即诱导时机为工程菌
OD600=0.50 时，诱导物 IPTG 浓度为 0.11 mmol/L，诱
导时间为 7.73 h。这一结果可以有效提高重组 PK2β
的表达水平，同时大幅度减少 IPTG 用量，降低成本，
有利于后续大量制备该蛋白质以进行进一步机理及
应用研究。
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（责任编辑 马鑫）