全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第7期
α-酮戊二酸是一种重要的有机酸，在代谢中起
着重要的作用，是三羧酸循环的重要中间产物之一，
也是合成多种氨基酸、蛋白质的前体物质［1］。作为
营养强化剂，能有效降低术后患者和病人的机体损
耗，在脑部可以作为酪氨酸和谷氨酸的前体，且能
够用于治疗黄褐斑，清除自由基、延缓衰老［2］，在
医药［3］、食品［4］、化工和化妆品行业有广泛的应用。
随着对 α-酮戊二酸应用价值的研究加深，市场对于
其需求量在不断增大。但是由于传统的化学法合成α-
酮戊二酸过程复杂，且在原料来源和生产过程中存
在严重的安全问题，无法直接用于食品和药品中［5］。
因此，微生物发酵法生产 α-酮戊二酸逐渐成为新的
研究方向。解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）具有
收稿日期 ： 2013-12-25
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31260396），淄博市科学技术发展计划项目（2010GG01124，2011GG01243）
通讯作者 ：巩健，女，硕士，副教授，研究方向 ：工业微生物 ；E-mail ：gongjiansd@126.com
解脂耶氏酵母诱变育种及发酵产 α-酮戊二酸条件优化
巩健1，2
（1. 淄博职业学院制药与生物工程系，淄博 255314 ；2. 山东省曲霉应用工程技术研究中心，淄博 255314）
摘 要 ： 对具有发酵产 α-酮戊二酸能力的解脂耶氏酵母（Yarrowia Lipolytica）ZY-4 进行了紫外诱变和 NTG 诱变育种，筛选
得到产量提高的突变株，并对突变株的发酵培养基进行了优化，结果表明，紫外诱变和 NTG 诱变后筛选到的突变株分别比原始出
发菌株产量提高了 67.8% 和 110%。优化后发酵培养基成分为甘油 8%，氯化铵 5.0 g/L，硫胺素 1.0 μg/L，磷酸二氢钾 1.0 g/L，七
水硫酸镁 0.5 g/L，培养基优化后 α-酮戊二酸产量比原始出发菌株提高了 232.4%。
关键词 ： α-酮戊二酸 解脂耶氏酵母 诱变育种
Mutation Breeding of Yarrowia lipolytica and Optimization of
α-Ketoglutaric Acid Fermentation Conditions
Gong Jian1，2
（1. Pharmaceutical & Biological Engineering Department，Zibo Vocational Institute，Zibo 255314 ；2. Shandong Provincial Engineering
Center on Aspergillus Application，Zibo 255314）
Abstract:  A strain of Yarrowia lipolytica（ZY-4）which producing α-ketoglutaric acid（KGA）was treated for mutation by UV and
NTG. Mutation strains which could accumulate much more KGA were obtained. Culture medium for mutation strain on KGA fermentation was
also studied. The concentration of KGA accumulated by UV mutation strain and NTG mutation strain increased 67.8% and 110% respectively
compared with original strain. The optimal fermentation medium contains glycerol 8%, NH4Cl 5.0 g/L, thiamine 1.0 μg/L, KH2P04 1.0 g/L and
MgSO4·7H2O 0.5 g/L. The production of KGA increased 232.4% after optimization when compared to the original strain.
Key words:  α-ketoglutaric acid Yarrowia lipolytica Mutantion Breeding
过量合成 α-酮戊二酸的能力，并被美国食品药品管
理局认为是安全的生产微生物，因此逐渐成为国内
外发酵法生产 α-酮戊二酸的研究热点［6］。尤其是近
年来，江南大学的陈坚教授及其研究团队在发酵产
α-酮戊二酸的研究取得了重大的突破。2010 年，在
炼油厂附近的土壤中筛选出一株硫胺素营养缺陷型
的解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）WSH-Z06，保
藏编号 CCTCC NO ：M207143，该菌株在以甘油为
碳源发酵条件下能够产生 39.2 g/L 的 α-酮戊二酸［7］。
随后，通过采用在该菌株内过量表达丙酮酸羧化酶
（Pyruvate carboxylase）的方法，改变碳代谢流，降
低了副产物丙酮酸，同时提高了 α-酮戊二酸的产
量［8］。另外，又通过发酵条件的控制优化，补加甘
2014年第7期 191巩健 ：解脂耶氏酵母诱变育种及发酵产 α-酮戊二酸条件优化
油和碳酸钙，实现了 66.2 g/L 的 α-酮戊二酸高产量［9］。
获得具有优良生产性能的菌种，是发酵工业的
核心资源。而诱变育种是进行菌种选育的重要方法，
发酵工业中正在使用的绝大部分高产优良菌株都是
采用诱变育种得到的。然而到目前为止，对于具有
发酵产 α-酮戊二酸能力的解脂耶氏酵母（Yarrowia
lipolytica）诱变育种工作仍未见报道。因此，本研究
以实验室的一株解脂耶氏酵母 ZY-4 作为出发菌株，
通过紫外线诱变和 NTG 化学诱变方法，筛选得到 α-
酮戊二酸产量提高的突变株，并对突变株的发酵培
养基成分进行优化。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌 株 与 培 养 基 解 脂 耶 氏 酵 母（Yarrowia
lipolytica）硫胺素营养缺陷型菌株 ZY-4，本实验室
保存。
种子培养基 ：酵母膏 10 g/L，蛋白胨 20 g/L，葡
萄糖 20 g/L，若制固体培养基，加入 20 g/L 琼脂粉。
初 筛 培 养 基 ：葡 萄 糖 20 g/L， 磷 酸 二 氢 钾
1.0 g/L，七水硫酸镁 0.5 g/L，氯化铵 3.0 g/L，青霉
素 0.05 g/L，制霉菌素 0.08 g/L，硫胺素 10 μg/L，溴
甲酚绿 1.0 g/L，琼脂 20 g/L。
发酵培养基 ：葡萄糖 100 g/L，磷酸二氢钾 1.0
g/L，七水硫酸镁 0.5 g/L，氯化铵 3.0 g/L，硫胺素
5.0 μg/L。
1.1.2 仪器与设备 BS-1E 型振荡培养箱，SWCJ-
2D 型超净工作台，TU-I901 型紫外可见分光光度计，
LDZX-50KBS 型立式压力蒸汽灭菌锅，HC-3018R 型
高速冷冻离心机，SHIMADZU LC-2010AHT 型高效
液相色谱。
1.2 方法
1.2.1 紫外线诱变处理 挑取一环保藏的 Yarrowia
lipolytica ZY-4 接种至种子培养基，在 30℃ 条件下
200 r/min 的恒温摇床上培养 48 h，进行种子的活化。
再以 5% 的接种量转接后，每隔 2 h 测定菌液 OD600
值。取对数生长期菌液，4 500 r/min 离心 10 min 收
集菌体，并用生理盐水洗涤两次，取 5 mL 菌悬液（105
CFU/mL） 加 入 直 径 9 cm 的 无 菌 培 养 皿 中， 开 启
15 W 紫外灯预热 30 min 后距离 30 cm 进行紫外照射，
照射时间分别为 10 s、20 s、30 s、40 s、50 s、60 s、
70 s。在红灯下，取照射后的菌液，用生理盐水梯度
稀释后涂布种子培养基固体平板，同时以未照射的
菌液为对照，置 30℃避光培养 48 h 后，计算致死率。
1.2.2 NTG 诱变处理 将经过紫外诱变筛选出的突
变株培养到对数期，收集菌体并用 pH6.0 磷酸缓冲
液洗涤两次，取一定量的菌悬液（105 CFU/mL），加
入亚硝基胍溶液，使其终浓度为 0.2、0.4、0.6、0.8
以及 1.0 mg/mL，30℃下振荡培养 20 min 后，4 500
r/min 离心 10 min 终止反应，用 pH6.0 磷酸缓冲液洗
涤 3 次并制成合适的稀释度涂布种子培养基固体平
板，30℃恒温培养 48 h 后，计算致死率。
1.2.3 突变菌株筛选 初筛 ：诱变后的菌液经适当
稀释后，涂布于初筛培养基固体平板，30℃恒温培
养后，产 α-酮戊二酸菌落周围形成黄色变色圈，挑
选生长旺盛、产酸快且变色圈与菌落直径之比较大
者作为初筛菌株。
复筛 ：挑取初筛产量较高的菌落，转接至发酵
培养基，30℃条件下 200 r/min 摇床恒温培养 3-5 d，
每个菌落做 3 次平行，用 HPLC 测定发酵液中的 α-
酮戊二酸含量。
1.2.4 发酵培养基优化 碳源优化 ：将筛选到的
突变株培养到对数生长中期，以 5% 的接种量分
别接种至含有不同浓度葡萄糖（100、130、160 及
200 g/L）和甘油（2%、5%、8%、10%）为碳源的摇瓶，
摇瓶中其他培养基成分与发酵培养基相同。
氮源浓度优化 ：以甘油浓度 8% 为碳源，氯化
铵浓度分别为（1.0、3.0、5.0、7.0 及 10 g/L），其他
成分与发酵培养基相同。
硫胺素浓度优化：以甘油浓度 8% 为碳源，5.0 g/L
氯化铵为氮源，硫胺素浓度分别为（1.0、3.0、5.0、7.0
及 9.0 μg/L），其他成分与发酵培养基相同。
发酵条件 ：30℃条件下 200 r/min 摇床恒温培养
3-5 d，期间根据 pH 变化流加 CaCO3。
1.2.5 分析方法 将待测发酵液于 10 000 r/min 条件
下离心 5 min 后，取上清液进行分析检测。葡萄糖
的测定使用 3，5-二硝基水杨酸法［10］。甘油的测定
使用改进的滴定法［11］。α-酮戊二酸的测定采用高效
液相色谱法（HPLC）［12］。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第7期192
2 结果
2.1 紫外线诱变
2.1.1 诱变时间的确定 将解脂耶氏酵母 Yarrowia
lipolytica ZY-4 分别紫外线照射 10 s、20 s、30 s、40 s、
50 s、60 s、70 s 后，30℃避光培养 48 h 计算致死率，
结果如图 1 所示。
2.2 NTG诱变
2.2.1 诱变剂量的确定 为了进一步提高菌株的 α-
酮戊二酸产量，同时减少单一诱变剂产生的疲劳效
应，对经过紫外诱变选育得到的突变株 7 号又进行
了 NTG 诱变。加入亚硝基胍浓度分别为 0.2、0.4、0.6、
0.8 及 1.0 mg/mL，30℃条件下诱变 20 min，去除诱
变剂并培养 48 h 后计算致死率，结果如图 2 所示。
20
30
40
50
60
70
80
90
100
10 20 30 40 50 60 70➗ሴᰦ䰤s㠤↫⦷%
图 1 解脂耶氏酵母 Yarrowia lipolytica ZY-4 紫外线诱变致
死率
由图 1 可知，紫外线对解脂耶氏酵母 Yarrowia
lipolytica ZY-4 的致死效果在前 20 s 内不明显，20 s
时仅达到 37.79%。30 s 后致死率随照射时间的延长
而显著增加，在 50 s 时达到 91.29%，在 60 s 和 70
s 时紫外线的致死率分别为 96.28% 和 99.06%，致
死效果十分明显。本试验紫外线对解脂耶氏酵母
Yarrowia lipolytica ZY-4 菌悬液照射 40 s 时致死率为
76.38%，易于发生提高产量的正向突变，因此，紫
外线诱变的照射时间确定为 40 s。
2.1.2 突变菌株筛选 紫外诱变菌株初筛 ：解脂耶
氏酵母 Yarrowia lipolytica ZY-4 菌悬液经过紫外照射
40 s 后，稀释并涂布于初筛平板培养，经过观察挑
选出 7 株生长较快且变色圈与菌落直径之比较大的
突变菌株，进行复筛试验。
紫外诱变菌株复筛 ：对初筛得到的 7 株突变株
分别进行摇瓶发酵试验，通过 HPLC 测定发酵液中 α-
酮戊二酸产量，结果见表 1。由表 1 可知，突变株 7
号的 α-酮戊二酸产量较高，达到了 18.1g/L，比原始
出发菌株产量提高了 67.8%。
表 1 紫外诱变菌株摇瓶发酵 α-酮戊二酸产量
菌株编号 α-酮戊二酸产量（g/L）
1 17.7
2 17.0
3 14.7
4 15.9
5 17.3
6 14.5
7 18.1
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0.2 0.4 0.6 0.8 1
NTG⎃ᓖmg/mL㠤↫⦷%
图 2 解脂耶氏酵母 ZY-4 紫外线诱变突变株 7 号经亚硝基
胍诱变致死率
由图 2 可知，在亚硝基胍诱变过程中，随着诱
变剂量的增大，解脂耶氏酵母的死亡率明显提高，
NTG 浓度为 0.4 mg/mL 时就达到 67.48%，诱变剂量
为 1.0 mg/mL 时致死率达到了 93.77%。为了提高筛
选效率，本研究采用 1.0 mg/mL 作为诱变剂 NTG 的
最终浓度。
2.2.2 突变菌株筛选 NTG 诱变菌株初筛 ：经过紫
外诱变后的突变株 7 号菌悬液使用浓度为 1.0 mg/mL
的 NTG 处理 20 min，去除诱变剂后，稀释并涂布于
初筛平板培养，经过观察挑选出 4 株变色圈与菌落
2014年第7期 193巩健 ：解脂耶氏酵母诱变育种及发酵产 α-酮戊二酸条件优化
直径之比较大的突变菌株，进行复筛试验。
NTG 诱变菌株复筛 ：对初筛得到的 4 株突变株
分别进行摇瓶发酵试验，通过 HPLC 测定发酵液中
α-酮戊二酸产量，结果见表 2。由表 2 可知，经过亚
硝基胍诱变育种后得到的 4 株突变株 α-酮戊二酸产
量均有提高，其中突变株 2 号的 α-酮戊二酸产量较
高，达到了 22.7g/L，比经过紫外诱变得到的 7 号突
变株产量提高了 25.4%，比原始出发菌株 ZY-4 产量
提高了 110%。将经过亚硝基胍诱变育种后得到的 2
号菌株，命名为解脂耶氏酵母 YB-2。
表 2 NTG 诱变菌株摇瓶发酵 α-酮戊二酸产量
菌株编号 α-酮戊二酸产量（g/L）
1 20.4
2 22.7
3 20.6
4 19.6
2.3 发酵培养基优化
2.3.1 碳源优化结果 分别以不同浓度葡萄糖（100、
130、160 以 及 200 g/L） 和 甘 油（2%、5%、8%、
10%）为碳源进行摇瓶发酵，比较不同碳源对解脂
耶氏酵母突变株 YB-2 的 α-酮戊二酸产量影响，结
果如图 3 所示。
二酸的产量仅由 22.6 g/L 提高至 28.4 g/L，提高了
25.7%。相比之下使用甘油作为碳源，发酵液中积累
的 α-酮戊二酸随着甘油浓度的增大变化明显。当甘
油浓度为 2% 时，α-酮戊二酸产量为 11.9 g/L。甘油
浓度增大至 5% 和 8% 时，α-酮戊二酸产量分别达到
22.4 g/L 和 30.6 g/L。继续增大甘油浓度至 10%，虽
然 α-酮戊二酸产量提高到 32.3 g/L，但解脂耶氏酵母
生长较慢，发酵周期延长。因此，本试验最终确定
使用 8% 浓度的甘油作为培养基碳源。
2.3.2 氮源优化结果 α-酮戊二酸位于细胞碳—氮
代谢的关键节点，培养基中氮源浓度会对 α-酮戊二
酸的积累产生影响。以 8% 浓度的甘油作为碳源，
分别以不同浓度氯化铵（1.0、3.0、5.0、7.0 及 10 g/L）
为氮源进行摇瓶发酵，得到的 α-酮戊二酸产量结果
如图 4 所示。
0
5
10
15
20
25
30
35
Glucose
100g/L
Glucose
130g/L
Glucose
160g/L
Glucose
200g/L
Glycerol
2%
Glycerol
5%
Glycerol
8%
Glycerol
10%
α-
䞞ᠺҼ䞨ӗ䟿g/L
图 3 碳源对解脂耶氏酵母突变株 YB-2 的 α-酮戊二酸产
量影响
由图 3 可知，不同浓度的葡萄糖和甘油作为碳
源对解脂耶氏酵母的 α-酮戊二酸产量均有影响。其
中，以葡萄糖作为碳源时，葡萄糖浓度的增大对发
酵液中 α-酮戊二酸的积累影响较小。培养基中葡
萄糖浓度由 100 g/L 增大一倍至 200 g/L 时，α-酮戊
0
5
10
15
20
25
30
35
1.0 3.0 5.0 7.0 10ษޫสѝ≟ॆ䬥⎃ᓖg/Lα-䞞ᠺҼ䞨ӗ䟿g/L
图 4 氮源氯化铵浓度对解脂耶氏酵母突变株 YB-2 的 α-酮
戊二酸产量影响
由图 4 可知，培养基中过低（1.0 g/L）或过高
（10 g/L）的 NH4Cl 均不利于 α-酮戊二酸的积累，氮
源的添加最佳浓度为 5.0 g/L。当低于 5.0 g/L 时，α-
酮戊二酸浓度随培养基中 NH4Cl 浓度的增加而不断
增加，当 NH4Cl 浓度为 5.0 g/L 时，α-酮戊二酸浓度
达到最大值（32.9 g/L）。但继续增加 NH4Cl 浓度并
不能继续提高产生的 α-酮戊二酸浓度，当 NH4Cl 浓
度高于 5.0 g/L 时，产生的 α-酮戊二酸反而减少。
2.3.3 硫胺素优化结果 由于解脂耶氏酵母突变株
YB-2 仍然是硫胺素营养缺陷型，硫胺素作为限制性
因素对 α-酮戊二酸的积累有较大影响。以 8% 浓度
的甘油作为碳源，5.0 g/L NH4Cl 为氮源，比较不同
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第7期194
硫胺素浓度（1.0、3.0、5.0、7.0 及 9.0 μg/L）条件下
α-酮戊二酸产量影响，结果如图 5 所示。
YB-2 生长速度减慢，积累 α-酮戊二酸的时间延后。
氮源 NH4Cl 浓度为 5.0 g/L 时最有利于 α-酮戊二酸的
的积累，这可能是由于当 NH4Cl 浓度较低时，氮源
成为解脂耶氏酵母生长代谢的限制性因素，此时增
加氮源可以提高 α-酮戊二酸的产量。但当 NH4Cl 浓
度较高时，过量的 NH4
+ 被用来进行氨基酸合成，因
此 TCA 循环中间代谢产物 α-酮戊二酸被用来进行谷
氨酸合成代谢，从而降低了 α-酮戊二酸的产量。较
低的硫胺素浓度有利于 α-酮戊二酸的积累，由于培
养基中硫胺素浓度较低时，以硫胺素为辅因子的 α-
酮戊二酸脱氢酶 KGDH 和丙酮酸脱氢酶 PDH 活力
大幅下降［1］，甘油经过代谢后只能被氧化为丙酮酸
和 α-酮戊二酸，从而实现积累。
4 结论
（1） 对 解 脂 耶 氏 酵 母 进 行 了 紫 外 诱 变 选 育，
筛选到 α-酮戊二酸产量提高的正突变株，达到了
18.1 g/L，比原始出发菌株 ZY-4 产量提高了 67.8%。
（2）对紫外诱变获得的突变株又进行了亚硝
基胍诱变育种，并筛选到产量继续提高的突变株
YB-2，α-酮戊二酸产量达到了 22.7 g/L，比原始出发
菌株 ZY-4 产量提高了 110%。
（3）优化了突变株 YB-2 的培养基成分，优化
后的培养基碳源使用 8% 的甘油，5.0 g/L NH4Cl 为
氮源，硫胺素浓度为 1.0 μg/L，上述条件最有利于 α-
酮戊二酸的积累，优化后 α-酮戊二酸比原始出发菌
株 ZY-4 产量提高了 232.4%。
参 考 文 献
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研究进展［J］. 生物工程学报 , 2013（2）：141-152.
［2］ 许晓鹏 , 刘立明 , 陈坚 . 营养条件对光滑球拟酵母积累 α-酮戊
二酸的影响［J］. 工业微生物 , 2009（6）：6-10.
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acid and 5-hydroxymethylfurfural［J］. Eur J Cardio-Thorac Surg,
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acid or pyridoxal phosphate on proteolyis and quality of Cheddar
0
5
10
15
20
25
30
35
40
α-
䞞ᠺҼ䞨ӗ䟿g/L
1.0 3.0 5.0 7.0 9.0⺛㜪㍐⎃ᓖμg/L
图 5 硫胺素浓度对解脂耶氏酵母突变株 YB-2 的 α-酮戊二
酸产量影响
由图 5 可知，硫胺素浓度为 1.0 μg/L 时最有利
于 α-酮戊二酸的积累。随着硫胺素浓度的增加，α-
酮戊二酸的积累量逐渐减少。硫胺素浓度为 1.0 μg/L
时，能够积累 35.9 g/L 的 α-酮戊二酸，而当培养基
中添加的硫胺素浓度达到 9.0 μg/L 时，产生的 α-酮
戊二酸为 30.5 g/L，仅是添加 1.0 μg/L 硫胺素时的
85%。
3 讨论
多年来，大量的研究者从许多方面对微生物发
酵法生产 α-酮戊二酸进行了探索，例如，优化培养
基成分、优化发酵条件、控制辅因子浓度，或者通
过分子生物学方法过量表达参与代谢的酶等方法，
尝试提高发酵法合成 α-酮戊二酸的产量［5］。这些方
法从根本上来说分为两类，一类是优化发酵条件，
另一类是选育具有更好生产性能的微生物菌种。菌
种选育的方法主要是自然选育、诱变选育、原生质
体融合以及基因工程育种等方法。本研究采用了紫
外线以及亚硝基胍诱变选育的方法，获得了 α-酮戊
二酸的产量提高的解脂耶氏酵母 YB-2，这是目前首
次成功对产 α-酮戊二酸的解脂耶氏酵母进行诱变育
种的报道。
本研究进而对突变株 YB-2 的发酵培养基进行
了初步优化。使用甘油为碳源能够得到比使用葡萄
糖为碳源更高的 α-酮戊二酸产量，最佳碳源确定为
8% 浓度的甘油，继续提高甘油浓度会使得突变株
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（责任编辑 李楠）