全 文 ：第 6 卷 第 l期
1 9 6 6 年 2月
生物化学与生物物理学报
A CT AI EO CH I MI A C
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1 96 6
蚕 氨 基 酸 代 榭 之 研 究
V l
. 家蚕与蓖麻蚕的谷氨酸脱氢酶
王 二 力 爵廷 森
(中国科学院生物化学研究所 ,上海 )
谷氨酸脱氢酶普遍存在于生物界中 〔1] , 在哺乳动物及一些微生物的氨基酸代榭 中起
着极为重要的作用 , 井且 , 它也是氨基酸代榭与糖代谢重要的街接点之一 , 通过它的作用
又可对体内的 N H士起着一定的稠节作用 工` ” , 。 在尾虫界中也有一 些有关 孩酶的 报导 ;
K i lb y 及其同工作者比 “ 〕利用沙漠飞蝗及征头丽蝇的脂肪体通过韵1胞色素 。 还原 系毓 测
定了敲酶的活力 , A g r e l l【G , 7〕在杠头丽蝇 , M o A l l a n 及 Ch e fu r k a 〔s 〕在美洲大镰 , p r o t a Lo了
在黄粉卿体液 , 以及 M il 。 和 C oc h ar n 10[ , 在美洲大慷的肌肉中 , 都分别侧定了谷氨酸脱
氢酶的活力 。
在鳞翅目尾虫 ,尤其是蚕粗撤中 , 仅 B h e m韶w ar 川〕在 1 9良年初步用 甲烯剪的方法
观察到在家蚕蒜腺的匀浆中似乎有敲酶活力外 , 有关敲酶的准确侧定 , 在蚕体内的情况 ,
以及其在氨基酸代甜中的作用 , 几无报导 。 我们观察到在家蚕与蓖麻蚕林腺 , 脂肪体及中
踢中都存在有谷氨酸脱氢酶 。 由于谷氨酸脱氢酶在氨基酸代甜及糖代榭中的重要地位 ,
以及昆虫脂肪体在代谢与变态过程中的作用 ,我俏 尚对蓖麻蚕脂肪体的谷氨酸脱氢酶 , 自
大眠起到蛹后期 ,进行 了系扰的此较观察 。 此外 , 考虑到谷氨酸脱氢酶在蚕蒜腺氨基酸的
分解与合成过程中的作用 ,我们进行了搏氨一脱氨作用的研究 。
材 料 与 方 法
蚕及其他昆虫 家蚕— 五龄四 日之 “ 306 只华十” , 系由中国农业科学院蚕业研究所供拾 。 蓖麻蚕— 五龄四 日之 “ 印白黄 ” , 系由中国科学院华东昆虫研究所及实输生物研究所供拾 。 三化螟一一越冬幼虫 , 系由中国科学院华东昆虫研究所供拾 。 荔枝蜷蜿—成虫 , 系由华南农学院 (广州夕供价 。
拭剂 L一谷氨酸钠盐— 天厨味精厂出品 , 含 9 界 。 L一天阴冬氨酸— 英国 B D H厂出品 。 a 一酮戊二酸 , N A D , N A D P— 均由本所东风献剂厂制备 , 耗度为 80 一 8 5 界。
N A D H ,— 系按 R a几二 等〔周的方法制得 。酶制剂之制备 先剪破上述幼虫腹足 , 以手指鲤压其身 , 迫其体液流出 , 收集备用 。
然后头尾用大头钉固定 , 剖开背面 , 取出林腺后部 , 其余部分及焉氏管全部摘去。 再剖开
中踢 ,将肠内食物速同圃食膜一起用刀刮去 ,摘下中踢 ,丢弃桔踢与直踢 ,再用刀鲤袒将脂
本文于 1 9 65 年 7 月 8 日收到 。
本文筒称如下 : D 工一 C S , D L 一环蒜氨酸 ;谷天辣氨酶 , L一谷氨酸一天阴冬氨酸辣氨酶 ; 谷丙卿氨酶 , 卜谷氨酸-
丙氨酸棘氨酶。
1期 王二力、静廷森 :蚕氨基酸代新之研究 l V .
肪体刮下 。 粗戳取得后 , 立即冰冻保存 。 各种粗戳在 O一4o C 条件下加入三倍的蒸馏水 ,
在玻璃匀浆器中进行匀浆 4 分钟 ,体液按体积加二倍蒸能水稀释 ;将以上的匀浆与稀释后
的体液 , 泳冻 4 小时或过夜 ,然后在 o C 左右以 12 , 5 0 X g 离心 30 分钟 ,取上清液备用 。
谷氨酸脱氢酶的活力测定 系由 N A D 或 N A D P 的还 原及 N A D H : 的 氧化观察
34 0 m户 (D U B ec k m an 分光光度补 ) 处吸收数位改变 (口E 34 0) 而进行测定 。 比色杯光程
为 1 厘米 , 总体积为 3 毫升 。 分解反应系杭中 , 含有 p H 8 . 0 的 tr is 48 灿 m ol 韶 , 谷氨酸
5 0 灿 m o l e 。 , N A D (或 N A D p ) 3 户二o l e s ; 合成反应系抗中含有 p H 8 . 0 七r i s 4 8 户 m o l e 。 ,
a 一酮戊二酸 15 0 ” m o l e s , 氛化鼓 ( PH 7 . 0 ) 9 0 0 灿 m o l e s , N A D H , 0 . 4 ” m o l e , 酶量智为
0
.
3 毫升 (即以上所制备的上清液 ) 。 反应进行时 , 先将酶液与翰酶混合 , 由于内源反应的
存在 , 故形成一定的吸收值 , 因此 , 我仍在反应平衡后 , 再加入底物 , 以此时作为本文内所
表示的酶催化反应活力的开始 。
实墩中除注明者外 ,全部拭剂都稠到 p H 8 . 0 ,温度替在 2 5℃ 下进行 。
桔 果
(一 )家蚕与蓖鹿蚕的谷氨酸脱氢酶
从文献有关昆虫粗横的谷氨酸脱氢酶活力的报导中 , 常常仅着到较小的数值 『8 ,或者
用尚接的方法进行侧定〔 4一 7· 工 1] 。 我们进行了一系列的探索 ,包括酶液的制备 , 底物与辅酶
的淡度 , 以及援冲液的选择 , 用直接测 340 m种 的光吸收值的方法 , 桔果看到相当明显的
蚕粗戳谷氨酸脱氢酶的活力 。
首先 ,我仍侧定了家蚕与蓖麻蚕释腺 、 脂肪体与中踢的谷氨酸脱氢酶活力 , 从图 1 及
图 2 可见 ,以上三种粗揪都具有对谷氨酸的分解与合成反应 。 在体液中 , 光吸收的变化极
微 , 可能不具有敲酶 的活力 。
由以上桔果可晃 , 在家蚕与蓖
麻蚕的一些主要粗戳 ,脂肪体 ,
林腺及中踢 , 都具有活力较强
的谷氨酸脱氢酶 。
为了进一步肯定以上粗戳 书确为谷氨酸脱氢酶所表现的活 粤
力 , 我们在每次分解反应接近
平衡时 , 加入 a 一酮戊二酸 。 由
图 3 可晃 , 当 “ 一酮戊二酸加于
反应系就时 , 34 0 m户 的光吸收
显著下降 。 从而锐明 , a 一酮戊
二酸可使反应系就中已形成的
N A D H
: 重新变成 N A D 与谷
料腺 脂肪体 中踢
一丈 介` \ …1 1 \ 2
/ …厂…户
4 6 0 2 4 6
时简 (芬 )
图 1 蔑麻蚕不同粗撇中谷氨酸脱氢酶的活力
1一N人 D + L一谷氨酸 ; 分一N A D H , + “ 一酮戊二酸 + 氯化涉 。
氨酸 。 这样的反应过程可以作为以后进行各种实敲 (如搏氨一脱氨反应 )前的模式实输。
由于 a 一酮戊二酸是谷氨酸脱氢酶作用的底物之一 , 而蚕内又具有一些氨基酸与 a 一酮
戊二酸所进行的搏氨作用 〔18 一川 , 是否有可能作为底物的谷氨酸一趣加入反应系扰后 , 立
1 6生 物化学与 生物 物理学 报 6卷
林腺 脂肪体 中踢 体液
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尸`尸 `…厂尸一 尹一一了
4 6
时简 (分 )
图 2家蚕不同祖糊中谷氨酸脱氢酶的活力
1一N A+ D卜谷氮酸 ; 2一N A DH : + a 一酮戊二酸十氯化鞍。
厂: 。“ 6。 }宣 ” · , “ Ut
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12 16
时简 (分 )
图 3 家蚕林腺谷氨酸脱氢酶活力
甲 : 系以谷氨酸为底物 ; 待反应趋向干衡时 , 招 分
钟后 , 加入 5召 m ol es “ 一酮戊二酸 (箭头 1) 。
乙 : 系先以酮戊二酸作底物 , 待平衡 5分钟后 , 加
入 2 5 0 召m o l e s 谷氨酸 (箭头 2 ) 。
时简 (分 )
图 4 蓖麻蚕不同祖糊中 “ 一酮戊二酸脱氢酶的活力
:I 系统内以 “ 一酮戊二酸 ( 10 那m ol es )代替卜谷氨
酸作底物 , 其余条件与 L一谷氨酸分解反应相同 。
1一栋腺 ;
丁A D + L一谷
分一脂肪体 ;
工:1 N 氨酸。
3一中踢 。
即与内源的各种 a 一酮酸进行蒋氨作用以形成 a 一酮戊二酸 , 从而进入三搜酸循环继而为
-a 酮戊二酸脱氢酶催化脱氢 , 使 N A D 还原 , 致使反应拮果不能反映谷氨酸脱氢酶的真实
情况 。 我仍在同样的实翁条件下 ,以 a 一酮戊二酸为底物 ,桔果 』E 。 。 非但未兑增加 , 反而
表现下降 。 若以谷氨酸为底物 , 刁E 豁。 lRJ 明显地增加 (图 4 , 5) 。 若在以上的系扰 中 ,加入
D L 一C S (10
一 3
M )以抑制谷丙蒋氨酶等的活力 , 可得到与以上完全相同的拮果 。 以上桔果
斋明 ,在我们的实输条件下所得的数值 ,井没有受到 a 一酮戊二酸脱氢酶的干扰 , 同时也进
一步爵明以上所获得的拮果是谷氨酸脱氢酶的活力表现所致。 我们曹以家蚕林腺的酶制
王二力 、养廷森 : 蚕氨基酸代榭之研究 Vl.
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时·简 (分 )
图 5 家蚕不同粗糊中 a 一酮戊二酸脱氢酶的活力
:1 系扰内以 a 一酮戊二酸 ( 1 0 拜m ol e 的 代替 L 一谷氨酸
作底物 , 其余条件与谷氨酸芬解反 应相 同。
且: N A D + L一谷氨酸。
2一粉腺 ; 分一脂肪体 ; 3一中踢 。
0 1 2 3 4 ,
时简 (芬 )
图 6 N A D ( 1) 与 N A D P (1 ) 对蓖麻蚕及
家蚕脂肪体中谷氨酸脱氢酶的影响 。 其中茸
麻蚕脂肪体反应系在 2 .宁 O条件下进行。
蓖麻蚕以 — . — 表示 ;家 蚕 以 — O— 表示 。
剂等作为材料 , 加入 -a 酮戊二酸 , 使反应到达平衡后 , 再加入谷氨酸眨距 灿m ol se )立即使
刁E 3 4。 迅速增加 (兑图 3 ) 。
在已知的昆虫粗袱中 , 谷氨酸脱氢酶都需要 N A D 为其辅酶 。 家蚕和天蚕蛾科的蓖
麻蚕的谷氨酸脱氢酶及其棘酶专一性尚未报导 , 从以上的桔果可见 , N A D 可作为蚕粗戳
敲酶的翰酶 ,我们以 N A D P 代替 N A D ,观察到 乙E 3 4。 只有较少的增加 (见图 6) 。
(二 )翰氨一脱氨作用
BP ay 丑 m eT 加 2[, “ , 1曰们总桔了哺乳动物中存在各种氨基酸与 “ 一酮戊二酸 的搏 氨作 用
以及在这些生物中普遍存在着谷氨酸脱氢酶 , 从而提出了谷氨酸在氨基酸的分解与合成
过程中处于重要的 中心地位之学爵。
K n b y 4t, 侧 虽然也曾提出蒋氨作用与谷氨酸脱氢酶在氨基酸的分解与合成过程中的
重要作用 , 但未能直接用实敲敲明蒋氨
作用与脱氨作用之周的直接联系 。 在家
蚕与蓖麻蚕的林腺中都存在活力甚 强的
谷天搏氨酶 13[ , ,从本文以上拮果中可兑 ,
谷氨酸脱氢酶在以上这两种蚕的林腺中
也都表现校高的活力 。 为了肯定搏氨作
用与脱氨作用的联系 , 我们进行一系列
的探索 ;首先 ,我们通过双相概层析的方
法 , 观察到在家蚕与蓖麻蚕林腺中含有
相当量的丙氨酸 , 它的含量仅次于谷氨
酸 ; 由于 D L 一C创 10 一 3万 )可以抑制谷丙
屠
勺
、 _ _
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飞晰尸产 ’
时简 (分 )
图 7 蓖麻蚕林腺的棘氨一脱氨作用
反应系扰内含有 t r i s ( P H 8 . 0 ) 4 8 那m o le日 ; 酶液 0 . 3
毫升 ,卜天阴冬氨酸 50 月m o l e s : D L 一 C 3 3 拜m o l e s ;
N A D 3 召m o l e s 。 在 反应平衡 时加入 0 . 5 召m o l e
“ 一酮戊二酸 (箭头所示 o)
生物化学与 生物物 理学报 6卷
搏氨酶 0 9多左右1 2 [一胭 , 而对谷天蒋氨酶 lRJ 几无抑制 ;因此我们将蓖麻蚕与家蚕 的酶液
分别和 D L 一C S 混合以抑制谷丙搏氨酶的活力 ,然后加入 N A D 与 卜天阴冬氨酸 。 (图 7 中
所示 , 在反应开始时 , 先出现 」E 34 。 的降低 ;然后稍有增加 , 这种增加现象可能与棘腺中含
导
心口匆勺 讼 _ , _厂、卜屯一丫 -时,简 (分 )
图 8 家蚕耕腺的褥氨一脱氨作用
(条件同图 7)
有相当量的 a 一酮戊二酸哪 ,有关 ) 。 待反
应达到平衡后 , 再拾以一定量的 。 一酮戊
二酸 , 郎可侧出 口E 、 。 的增加 (图 7 和
图 8) 。 在以上实酚中 , a 一酮戊二酸量过
小 lHJ 侧得 口E 34 。 较小 , 而过大亦反而使
刁刀、 。 下降。 L一天阴冬氨酸的量过大也
不能表现 口E 34 。 的增加 。 由此 , a 一酮戊二
酸与 L 一天阴冬氨酸的量在反应 系挑 中
似乎具有一定的稠节控制作用 。 从以上
的拮果可晃 , L一天阴冬氨酸可以通过与 a 一酮戊二酸的蒋氨作用 , 先形成谷氨酸与草酞乙
酸 , 谷氨酸在谷氨酸脱氢酶的催化下 , 可形成 “ 一酮戊二酸与 N H才。 从而由以上的模式实
盼中锐明搏氨一脱氨作用的存在 。
(三 )蓖麻蚕个体发育效程中脂肪体谷氨酸脱氢酶活力的变化
考虑到谷氨酸脱氢酶在蚕的氨基酸代榭中的作用 ,而脂肪休又为各种代榭的中心 , 因
此 ,我们比较了自四龄眠以前到蛹期桔束时 , 谷氨酸脱氢酶的活力 。 自图 9 可兑 , 谷氨酸
脱氢酶在五龄期简表现的活力为最大 , 井以五龄第 4 天的活力 (以每克粗戳在 1 分钟内形
成的 N A D H , 的 户m ol e 量升算 )为最高 。 当蚕进人五龄时 ,食量增加很大 , 体内开始积累
大量的脂肪 ,体重嵘增 ,此外 ,在五龄盛食期同林蛋白的合成又最旺盛 , 蚕体内氨基酸的搏
化必然极为重要 , 而五龄期简谷氨酸脱氢酶所以表现最大的活力与以上的生理现象是相
适应的 , 更进一步表明谷氨酸脱氢酶在氨某酸代谢中所起着的重要作用 。 在上簇拮茧到
吐林完的 3 天左右的时固内 ,蚕的生理功能主要是营茧 , 此外一般代榭都降低 ;因此 ,谷氨
酸脱氢酶的活力也相应地降低 ; 而进入蛹期后 , 谷氨酸脱氢酶的活力又有明显的增加 , 到
化蛹 2 夭后 , 开始下降 , 而最后趋于一定的水平 。 由以上的桔果可兑 , 谷氨酸脱氢酶的活
力与蚕的不同发育阶段的生理过程具有甚为紧密的联系 ; 目前我们虽肯无法全部解释谷
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图 9 蓖麻蚕个体发育过程中脂肪体谷氨酸脱氢酶活力的变化
酶的活力乃以反应到达平衡后 ,加入底物谷氮酸 , 观察 1 芬钟内的 刁凡 40 宝
井以克粗搬箭算 N人 D H Z 的生成量。
1 期 王二力 、 齐廷森: 蚕氨基酸代榭之研究 Vl.
氨酸脱氢酶的活力与不同发育阶段的关系 , 尤其是蛹后期敲酶活力为什么逐撕下降的原
因 ,这些周题尚待进一步研究 。
封 愉
在蚕的各种粗揪中都普温存在静多氨基酸对 a 一酮戊二酸的搏氨作用 〔芝3一均 , 以 形成
谷氨酸 , 通过这些搏氨作用的逆向反应又可形成相应的氨基酸与 a 一酮戊二酸 , 在林腺中
又存在谷氨酸一酮丙二酸以及谷氨酸一乙醛酸的斡氨作用饰 一 28 , ; 而由本文中可兑 , 谷氨酸
脱氢酶又存在于蚕体的一些主要粗掀之中 。 因此 , 这些氨基酸的分解与合成 , 以及它们的
相互搏化 ,极可能通过以谷氨酸为中心的搏氨一脱氨作用与搏氨一加氨作用 , 即斡氨酶与谷
氨酸脱氢酶的共同作用 。 最近 , 我们观察到在蓖麻蚕与家蚕的脂肪体与林腺的游离氨基
酸中 , 谷氨酸占 30 一6 0多 , 而在体液中谷氨酸的含量却极低。 此外 ,在最近 2 年的系就观
察中 ,我们肯发现在各种蚕的脂肪体 , 中踢 , 焉氏管 , 及三化螟等各目昆虫中均存在活力很
弧的 L一扁氨酸一a 一酮戊二酸 尔搏氨酶 , 以形成谷氨酸与谷氨醛酸 , 后者在蚕体内又可形成
脯氨酸〔” 一肚 , ( L一息氨酸在以上这些尾虫粗揪中尚可以与乙醛酸 , 丙酮酸 ,草酞乙酸等 a 一酮
酸进行搏氨作用 ) 。这些都支持谷氨酸在蚕体氨基酸代榭中的重要地位 。
过去 , 在昆虫中曾认为存在精氨酸一-a 酮戊二酸蒋氨酶 t41 , 我们观察到在家蚕与蓖麻
蚕的脂肪体中均存在活力甚强的精氨酸酶 〔31] , 其在五龄幼虫盛食期与成虫期固的活力为
最高 , 因此 , 精氨酸一“ 一酮戊二酸的搏氨作用 , 实际上极可能是精氨酸酶与 L一息氨酸书一搏
氨酶相继作用的桔果 〔80] 。
我们在棘腺粗掀中以 卜天阴冬氨酸作为 -a 氨基的供拾体 ,在 N A D 及 a 一酮戊二酸的
存在下 , 观察到搏氨一脱氨作用 , 而其中 a 一酮戊二酸与 L一天阴冬氨酸的量在反应系杭中 ,
甚为重要 , 它们似乎起着一定 的稠节作用 。 在被研究蚕的粗棍中 , 谷氨酸脱氢酶是 N A D
专一的 , N A D P 仅有较小的作用 ;这可能由于在我们的 N A D P 中含有 N A D 或者在蚕粗
掀中具有 N A D H : 蒋氢酶的椽故 。
我们比较了蓖麻蚕在不同的个体发育过程中脂肪体谷氨酸脱氢酶活力的变化 , 观察
到 , 在不同的生理状态下 , 所表现的活力有显著的差异 , 这一方面反映了谷氨酸脱氢酶与
昆虫的不同生理状态及变态过程之简的联系 , 而这些变化极可能与昆虫的生理现象如蛋
白质 ,脂肪的合成有密切的关系 。
此外 , 我们尚对一些害虫 (三化螟及荔枝蜷嫉 )的脂肪体中的谷氨酸脱氢酶进行了侧
定 , 也均表现有明显的谷氨酸脱氢酶的活力 ,并且也需要 N A D 为其辅酶。
摘 要
在家蚕与蓖麻蚕的脂肪体 , 林腺后部和 中踢粗揪中 , 利用分光光度法 , 都观察到谷氨
酸脱氢酶 。 将 a 一酮戊二酸与 N H才加于以上各种粗撤的酶液中 , 侧定 N A D H : 的氧化 , 敲
实了其逆向反应的存在 。 蚕粗掀中的谷氨酸脱氢酶需要 N A D 为其辅酶 。
在家蚕与蓖麻蚕的林腺后部 中 , 我们利用 直接侧 定 的 方 法 , 观察 到 B p ay H m eT fl
所提出的搏氨一脱氨作用的存在 、 , 从而进一步靛明谷氨酸脱氢酶在氨基酸代榭中 的 重要
地位 。
2 0生物化 学 与 生 物物理 学 报 6卷
此外 ,我们尚发现在不同发育阶段 ,蓖麻蚕脂肪体中谷氨酸脱氢酶的活力表现显著的
变化 。
本文工作承沈昭文先生提供宝食意见 , 本所朱嚼蓉同志供拾我俩乙醇脱氨酶 ;朱菊杠同志协助进行解剖等工作 ;
中国农业科学院蚕业研究所吕漓声 、 蔡幼民和在大桓同志供拾我丁四家蚕 ; 中国科学院华东尾虫研究所周鹤雄和朋秀
芳同志为我酒的养蓖麻蚕 ; 中国科学院实毅生物研突所蒋天骥先生和陈守德同志供拾我啊蓖麻蚕 ;麓此致谢。
参 考 文 献
[ 」〕
〔 2 〕
〔 3 」
[ 4 〕
[ 石 〕
[ 6 〕
[ 7 〕
[ 8 〕
〔 9 〕
[ 10〕
[ 11〕
[ 1 2 ]
[ 1 3〕
[ 14〕
【1石〕
[ 16〕
〔17〕
[ 1 8」
[ 1 9〕
〔2 0〕
[ 2 1」
[ 22 ]
〔2 3〕
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B P a y 且班子e众且 A . E . 厂J a 口托 b ` e 冷 y饥肠 a e e “ 湘肠朋对“ , 祝 d肠 e e酷湘 1“ 月材“ 肠 a a o饥 a y 沁“ 口。饥” 乞`念 . 1 2 . e E不 e r o及u o e
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B p a y H班 , e众且 A· E . H e R o T o P班 e 可 e P TH x 江、 z : e e R o众 z H T e r p a只 n玫 n P o叹e e e o o a o o T宜 c T o r o o 6M o o a . 仄o R兀 . o a
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P r o P o r t土e日 o f t r a n 日a m 主n a 日e s a n d g l u 七a 功 je d e il y d r og e n a 日e l n 士h e
e o c k r o a e h P e r ` p la几 e t a a饥 ` 犷` e a 九 a . C o饥夕. 刀`o 口 h`饥 . P h到` 乞o乙. , 1 9 6 1 , 3 , 1·
P r o七a , C . D . E n z y m e s i n t h e h e m o l y m P h o f th e m e a l w o r m , 少。乳 e b 犷` o 饥 0 1乞云o r . J . N e w Y o ,,无
E 外 t o 饥0 1 . 名o c . , 1 9 6 1 , 6 9 , 5 9 .
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e n z y m e s fr o m e o c k r o a o h m u s c l e m i七o c h o n d r i a . B 乞o c h落饥 . B 艺叩h y s . A c云a , 1 9 6 3 , 7 3 , 2工3 .
B h e e m e s w a r
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1期 王二力、静廷森 :蚕氨基酸代黝之研究 V L
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