全 文 ：广 西 植 物 , G u i l飞a l a Z ( 2 ) : 8 1一 8 7 . 19 8 2
通气状况 、 某些呼吸中阎产物和抑制剂对
甘蔗幼叶原生质体酶解释离的影响
何若天
( 广西农学院林学分院 )
罗 科
( 广西农学院热带作物分院 )
摘 要 : 甘蔗幼叶原生质体酶解释离期间呼吸速率逐渐降低 。 通气良好者原生质体
产量高 , 但各处理原生质体存活率差异不大 。 以无机盐为稳压列 者 , 苹果酸 、 a 一酮戊
二酸 、 丙酮酸钠 、 琉拍酸钠 、 柠檬酸钠等呼吸中间产物均能提高原生质休产量 , 尤以唬
拍酸钠和丙酮酸钠效果最好 。 而 以糖醇为稳压 剂者 , 苹果酸 、 a 一酮戊二酸 、 丙酮酸钠
和琉拍酸钠等有促进作用 , 柠檬酸钠却有严重抑制效应 , 产物几全部为具壁细胞 。
呼吸抑制剂如碘乙酸 、 氟化钠 、 丙二酸 、 叠氮化钠 和 2 , 4 一 二硝基酚等对原生质体
产量和存活率均有抑制作用 。 随抑制剂浓度增加 , 呼吸受抑制越甚 , 原生质体产量和存
活率的降低也越甚 。 玻泊酸能消除丙二酸对呼吸的抑制 , 并减轻丙二酸对原 生质体释离
的不利影响 。
用酶法从具壁细胞中分离原生质体是既受细胞的代谢水平所调控 , 又受组成酶液的
稳压剂的组分所影响 。 其原因需进 一步研究 。
自C o c k i。 g ( 1 9 6。 ) 发展了酶注分禽植朴细舫原登后休跳技术 〔 “ 〕 , 解决了 去 壁 困难以
来 , 高等植物原生质休的分离 、 培养和融合等研究发展相当快 。 迄今已有三十多种植物 ( 大
部分属于茄科 ) 原生质体培养成植株或胚状物 〔 ` “ 〕 。 游宫的原生质休不仅被用作植物杂交育
种的有希望的重要材料 , 且已成为现代植物学研究的一个良好的实验系统 , 被用于许多研究
领域中 。 如何获得高产优质的原生质体是利用原生质体进行各项研究的首要条件 。 为此 , 不
少研究者曾对试验植株的栽培条件 ` 4 〕 、 植株年龄 〔” 〕 、 生长季节 ’ 〕 、 培养物的培养条件 〔 ’ 2 〕
和试材的预处理 “ , ” , 。 〕 等与原生质休产量和活力的关系作过研究 。 但有关酶解释离原生质
体过程中通气状况对原生质休产量的影响 , 只在微生物研究中有所报导 绝’ 、 ,在高等植物中未
见有关报告 。 至于试材细胞的呼吸代谢状况与原生质休产量和活力的关系很少加以考虑 。 通
常分离原生质休时都采用通气不良的密闭容器 。 M a r e 行 ik 等 曾发现酶解释离原生质体期间
呼吸速率逐渐下降的现象 〔“ 〕 。 本文报导了了气妙况 、 某些呼吸中间产物与呼吸抑制 剂对细
胞呼吸代谢和原生质体酶解释离的影响 。
材 料 与 方 法
试材为田间栽培的甘蔗 ( S a C c h ar u m of if c i。 a : u o L 如 n .品种为台糖 1 34 ) 近 茎 端 的
梢部幼叶。 剥去外层老叶 , 取长约 5 一 7 厘米的内部叶段 , 置70 %乙醉中浸 1 分钟 , 用无菌
蒸馏水冲洗三遍 。 再剥去外部 1 ~ 2层叶片 , 留下内部呈黄色的嫩叶供试验用 。
用手术刀将嫩叶纵切成四部分 , 再横切成细条状碎片 , 称重后置酶液 内 。 酶 液 由 1 %
( 或 0 . 5% ) E A 3 一 。 。 7纤维素酶 ( 上海植物生理研究所 产品 ) 溶于稳 压剂 ( 2 . 5 % K CI 十 1 %
M g S O
` · 7 H : O , 或。 . 69 M甘露醉 + 5 m M磷酸盐缓冲液或再加 9 m M C a 1C 2 , 个别试验用
3
.
5% K CI 十 0
.
5% C a CI
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) 内所组成 。 p H值为 5 . 6~ 5 . 8 。 经孔径 0 . 45 微米滤膜过滤灭菌 。 置
30 ℃黑暗处保温酶解 1 . 5一 2小时 。
不同通气条件采用开 口大小不同的容器和附加不同的障碍物所组成 。
呼吸中间产物采用止梭酸环中的苹果酸 、 a 一酮戊二酸 、 丙酮酸钠 、 唬拍酸钠 、 柠檬酸钠
和乌头酸等 。
呼吸抑制剂用丙二酸 、 碘乙酸 ` 叠氮化钠 、 氟化钠和 2 , 4 一二硝从酚等 。
原生质体产量用血球计数板测定 。 在酶解结束后 , 置 5 ℃冰箱内降温半小时后轻轻摇匀 ,
取样测定 。 为消除取样误差 , 经反复多次取样计数取,平均值外 , 均作 3 ~ 5 次重复试验 , 结
果均一致 ·
死活原生质休用 0 . 1%酚藏花红 ( p h e n os a fr a in n e )染色法检定 。
呼吸速率用 W ar b u r g微量呼吸计于 29 . 5℃中测定 。
试 验 结 果
一 、 甘蔗幼叶原生质体酶解释离期间呼吸速率的变化
酶解释离甘蔗幼叶原生质体期间 , 呼吸速率逐步下降 。 若以酶解 20 分钟的呼吸水平为基
点 , 酶解 1 小时 , 呼吸速率下降了 21 . 5 % , 酶解 1 小时 40 分便降低 58 % ( 表 1 ) 。 七要原因
可能是酶液的毒害作用 〔 ” 〕和原生质体在高渗溶液中遭受渗透冲击所致 。
表 1 甘蔗幼叶原生质体酶解释离期间呼吸速率的变化
〔对照为 0 . 1克鲜重叶片 + M S培养液 ( 无蔗糖和激素 , 下同 ) + O . S M廿露醇 ; 处理为
0
.
1克鲜重叶 片 十 0 . 5% 纤维素酶 十 M S培养掖 + 。 . S M 甘露醇 。 p H值为 5 . 6 一 5 . 8〕
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。一”ìó匕保温时间 ( 分 ) 一一.678一ù八了一·一对一;!、一一一一à一一一一
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注 : 表中括号 内数值为以酶解 2。分的呼吸速率为基点时的呼吸下降百分率
二 、 通气状况对原生质体释离的影响
第一组试验结果 ( 表 2 ) 表明 , 不管采用那种稳压剂 , 半开 口培养皿内原生质体产量较
高 , 具玻塞试管内产量较低 。 以无机盐为稳压剂者 , 具塞试管内原生质体平均产量只为半开
口培养皿内的 25 一 37 % ; 以甘露醇为稳压剂者 , 则为64 %左右 。 即采用无机盐为稳压剂者差
异较大 , 以糖醉为稳压剂者差异较小 。 这在酶解不同期间内原生质体产量变化中亦有类似反
映 ( 图 i ) 。
第二组试验以K C I和 M g S O ` · 7 H : O 为稳压剂 , 均以 10 毫升锥形瓶为容器 , 唯瓶门采用
通气程度不同的纱布 、 棉花塞或木塞封 口 , 或复盖以石蜡油 。 结果表明以瓶 口完全敞开者 ,
原生质体产量较高 。 次为用二层纱布封 口的 。 复盖以石蜡油隔绝空气者产量最低 ( 表 3 ) 。
表 2稳压剂类型和通气状况与甘蔗幼叶原生质体产量的关系 ④
{ 容器 2) r氯 生 质 体 产 量
稳压剂类型 功 又 0 1“ / 1
.一 %x 10 . / %克鲜重砰牙一!一下一 克鲜重克鲜重 { 25 %K C I 半开 口培养皿 1 70 3… 1。 。 岁 _ _ 6 1. 6 2} :二: 15 1 0 1 70+ i %M gSO ` · , H : O 具玻塞试竹 6 . 3 2 { : 6 . 5 6 18 5 . 88 3 7 . 43 . 5% K C I + o , 5 % C a C 1 2 半开 口培养皿 斗 . 20 1 0 0 2 . 0 4 ;』. : ; :: } , 0 。 2 ,巨` 1 0 0具` 塞试管 …。 9 ` 2 2 . 4 0 . 5 3 { 3 2 . 3 0 b 3 2 5 . 1如 口菇养 一皿{一ha Z - 1 0 0 7 . 2 8 { 1 ” “0 . 6 g M 甘露醉 十 s m M 具玻塞试管 …3 . 4 3 5 1 . 8 4 5 9 ;里: c 6 8 1} 7 9 · 3 : . :: ;里:磷酸盐缓冲液 5 . 3 0
2 8
.
C
, 酶解 1 . 5小时
小目ó J吸
这与图 1所示结果很一致 。
两组试验结果均表明 , 通气是否良好对
原生质体产量有显著影响 , 但原比质休存活
率差异不大 ( 表 3 ) 。 很显然 , 氧的供应是
否充足 , 直接影响细胞的呼吸速率 , 从而以
尚不了解的原因影响原生质体的酶解释禽 。
三 、 某些呼吸中间产物对原 生 质 休 释
离的影响
为验证细胞呼吸强弱与原生质休配解释
离的关系 , 我们饲以对呼吸速率有促进作用
的某些呼吸中间产物如苹果 酸 、 a 一酮戊二
酸 、 丙酮酸钠 、 珑拍酸钠 、 柠檬酸钠和鸟头
酸等 。 结果表明 , 在以 2 . 5% K CI + 1%
M g S O
` · 7 H : 0 为稳压剂者 , 这些三欺酸环
中的中间产物 , 阶乌头酸稍有抑制作用外 ,
其余均不同程度地提高原生质休产量 , 其中
尤以琉拍酸钠和丙酮酸钠的促进作用最显著
( 分别为对照的 1 72 鲜 和 1 5 2 . 7% ) 。 这与以
o
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SM 甘露醇 十 g m M C a C I: 十 s m M 磷酸盐缓
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酶解时间 ( 分 )
图 1 通气状况与甘蔗幼叶原生质体
酶解释离的关系
I 为 1%纤 维素酶溶于 2 . 5 % K C I + 1 % M gOS ` . 7H 2 0
榕液 中 , 盛于通气正常的 1 5毫升锥形瓶内 , I 醉液同
上 , 但表层盖 以石蜡油隔绝空气。 I 为 1% 纤维素辞
溶于 o . 6 9M甘露醇 + s m M 磷酸盐缓冲液中 , 置通气正常
的 1 5毫升锥形瓶 内 , M 酶液同上 , 但表层盖以石蜡油
隔绝空气。 p H值均为 5 . 6。 30 ’ C 中酶解 2 小时
表 3 通气状况对甘蔗幼叶原生质休释离的影响
( 1 0毫升锥形瓶 , 内感 1 毫升酶混合 液和 0 . 1克叶片 , 3 0 ’ C , 酶解 1 . 5小 时 )
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开塞敞棉木
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二 层 纱 布 包 口
掖层上复盖 石蜡油 1 . 1 3 5 3 _ 1 0 _ 9 1
8 3
冲液为稳压剂者所得结果一致 ( 表 4 ) 。 但在后者 , 柠檬酸钠却有严垂抑制作用 , 所得产物
J毛全为未去壁细胞 , 多次重复试验结果均同 。
表 4 某些呼吸中间产物对甘蔗幼叶原生质体产量的影响
( 基质浓度均为 0 . o OSM , 纤维素酶浓度 1% , 30 “ C , 酶解 1 . 5小时 )
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1 ) p H值均为 5 . 衍 2 ) 四次试验结 果的平均值 ; 3 ) 五次试验结果的平均值 。
四 、 呼吸抑制剂对原生质体释离的影响
我们还从抑制呼吸的角度进一步验泪_细胞呼吸强弱与原生质体释离的关系 。 所用抑制剂
有糖酵解阶段抑制剂碘乙酸和氟化钠 , 三竣酸环抑制剂丙二酸 , 末端氧化阶段抑制剂叠氮化
钠和氧化磷酸化解偶联剂 2 , 4一二硝基酚等 。 试验分二组 : 第一组试验是把抑制剂和酶液与试
材等一道保温 , 或先用抑制剂真空渗入试材组织后 , 弃去抑制剂 , 改用无抑制剂酶液 。 结果
表明 , 上述两种处理均对原生质体产量和存活率有显著抑制作用 ( 表 5 ) 。
表 5 呼吸抑制剂对甘蔗幼叶原生质体产量 和存活率的影响
试 验 1签 试 验 3签签
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肠为含呼吸抑制剂的酶混合液 ( 1% 纤维素酶 十 2 , 5 % K C I 十 1 % M g SO ` · 7 H Z O ) 和材料一道保温 , 未真空 渗入 ;
. 锌先用抑制剂 ( 对照 用蒸馏水 ) 真空渗入组织 内 10 分钟后吸 去抑制剂 , 改加无抑制剂酶液 。
均在 3 0 “ C 暗处保温 x . 5小时 。
第二组试验是采用不同浓度抑制剂真空渗入试材组织后改用无抑制剂酶液释离原生质体 。
结果表明 , 不同浓度呼吸抑制剂对试材的呼吸速率和原生质体释离有明显策异 。 随抑制剂浓
度增高 ,植物组织呼吸速率受抑制百分率随之增高 ,而原生质体产量和存活率相应 一 f 降 (表6 ) 。
表 6 不同浓度呼吸抑制剂对甘蔗幼叶呼吸速率和原生质体酶解释离的影响
(试材经不同浓度抑制剂真空渗入 5分钟后弃去抑制剂 , 用无菌水洗涤后加入
1 %纤维索酶 + 2 . 5% K C I + 1 % M g S O 、 · 7 H : O 棍合液 , 3 0 0 C ,暗处保温 1 . 5小时 )
抑制剂种类
和浓度 ( M )
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五 、 琉拍酸钠对丙二酸抑制作用的解除
鉴于丙二酸为三梭酸环中唬拍酸脱氢酶的竞争性抑制剂 , 于是测定了丙二酸 、 琉拍酸钠
和二者等浓度混合液对试材呼吸速率和原生质体产量的影响 。 结果表明 , 唬拍酸钠可解除丙
二酸对细胞呼吸的抑制作用 , 并相应地在一定程度上减轻了丙二醉对原生质休产量的不利影
响 ( 表 7 ) 。
表 7 丙二酸和唬拍酸钠对 甘蔗幼叶呼吸速率与原生质体产量的影 响
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母呀
论我们的试叭结果初步证明了细胞呼吸代 i李`}水业与嚎生质体酶解释离有密切关系 。 通气良
好和某些能提高呼吸水平自、 呼吸中间产物的加 入对原 t 质休产最有明显促 进 作 用 。 通气不
良 , 呼吸受抑制均明 显地降低原生质休产量 一与存活率 。 至于这科;关系的实质是什么? 是否细
胸的代谢活力有可能影响胞壁物质的降解 ? 迄今雍无听知 。 联系到在其他方而 , 不少研究者
发现杭株年龄 、 ’匕理状况和预处理等对原件质休分离的难易关系甚大 。 例如 X a c : ” : 。 、 等 了 “ ,
发现 1。一犯天苗龄的棉苗子叶原生质体产量最高 , 过幼和过长均低 。 K a r ht : 等 〔 4 一发现采用
低温 ( 飞9一 2 1℃ ) 较干旱 ( 相对涅度 40 一 45 % ) 条件下生长的芸苔叶片才能获得 产歇和存活
本均较高的原生质休 。 这表明栽培条件和杭株年龄着一先影响植株的生理状态 , 从而影响原生
质休释离的难易 。 Y u k io F u k u n雌 a 等 t ’ “ · 发现小麦和水稻等细胞培养物经氮饥饿三夭后 ,
原什质体产量显著提高。 S飞a h诵等 厂” 、 把木薯叶子预漂浮在含 lm M C a 1C 2 、 1。 飞M N H ` N O 3 、
lp l〕 。 : 羊乙酣和 s p p m 芋基氨基嚓吟的蒸馏水溶浓上 , 置暗处温育 48 小时后 , 获得高产量和高
度活 力的原牛质休 。 C o n s at cb l等 产 ” ” 把切下的豌豆枝条置于维持一定湿度 的 哈 室 中 1 ~ 2
夭 , 所得 原生质休存活率较高 , 并能继参分裂 。 K r is h an 二 、 士ih r “ 认 为把生长旺盛 的甘蔗
植株只于陪处培养 1 2小时后再切取茎尖分离原生质体 , 对嗣后原生质体生长有利 。 _ L述实例
均表明 , 通过预处理改变试材的生理状况 , 对原生质休的分离和活力有明显影响 。 据上述作
者和我们的试骄结果 , 可 以认为细胞的代谢水平是决定原生质体酶解释离难 易和存活力的基
本因素 。 其机理尚有待进一步研究 。
在我们的试验中 , 采用无糖醉的无机欲稳压剂时 , 柠檬酸钠能促进细胞壁降解过程 , 果
用含书一武醉的稳 压荆时 , 结果完全相 反 , 所得产物绝大部分为未去壁的细脸 , 为数机少的原
价后休脱雌和不完个 。 结合我们在别的试验中发现高浓度 C a 牛 千 离子会抑制胞壁的酶促降解
等邢伪不文 , 科压剂的成分和各组分问的相互作用对响壁的酶促降解有很大影响 。 其原因也
有待进 一 少研宁 。
纷 卜述可 见 , 用酶法从具壁细胞中分离原生质休是个既受细胞的代谢水平所调控 , 又受
组成酶液的稳压剂的组分所左右 。
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THE E E C O T F F FV E N I TL A TI V E C O N D I 0 N A N D O 1 T SM E
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d u r i n g e 习 z j m a t i e i s o l a t i o n o f p r o t o p l a s 士s , i t f o l l o w s t }〕 a t n o r n 。 a l l : v c l o f e e l l
r e s p i r a t i o n 15 m a i n t a i , l o d t h a t i s a , 、 i , : p o r t a n t f a e t o r f o r o b 生a i n i n g h i g h e r
y i e l d s a n d v i t a l p r o t o p l a s t s
.
T h 于5 p a p e r r e p o r t s :
1
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T h e y i e l d o f p r o t o p l a s t、 i“ h i g li e r b一, t t h e v i t a l i t y 15 n o d i f f e r c n 士. i n
s p i t e o f o r g a n i e o r i n o r g a l ] i e o s m o s i s s亡a b i l i z i n g a g e n t w a s u s e d , w }一。 n 、 一 。 n t i -
l a t i v e e o n d i t i o n 15 w e l l
。
2
.
S o m e r e s p i r a t o r y i n t o r m e d i a t e s s u e h a s m a l a t e
, a 一 k e t o g l u 士a r 至e a e 是d ,
P y r u v a t e , 。 u e e i n a t 护 a n d e i t r a t e m a y i n e r o a s , y i e l d o f p r o t o p l a s t“ , a m o n g
t h e m u s e f u l n e s s o f s u e e i n a t e a n d p ) r u 、 a 士`全 15 b e s t , w h e n i卫 o r g a 打 i e 0 5翔 0 5 15
s t a b i l i z i n g a g o n t w a s u s e d
.
O n t }z e o t h c r l z a n d
, o n l y m a l a t e
, a 一 k o t o g l u t a r i e
a e i d
, p y r u v a t e a n d s lt e e i n a t c h a v e p r o n l o t { o n o n t卜e y i e l d o f p : o t o p l a 、 t s ,
a n d e i t r a t e h a v e g r a v c i n h i b i t j o t]
, a l l p , o ( l u e ! 5 o b t a i n (
·
d a r o a l m o s t e e l l s w h i e h
a r e n o t s e p a r a t e d f r o m t h e e o l l w a l l
,
w h e l l o r g a n 主e m a n n i t o l w a s u s o d . T h i s
i n d i e a t e d t 五a t m u t u a l F r e 灯 o t , o n a , d r 。 : t r a ; : t 卜、 t w 〔 。 卫 t l o e o 川 p o r 。 刀 t s o f
o s m o s i s s t a b i l i
z i: 9 a g e : t 五。 v e r 。郑 。 r 上。 b l e e f f e e t o n e n z y 抒 a t i e i s o l a t i o n
o f p r o t o p l a s t s
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3
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T h e r e s p i r a t o r y i n h i b i t o r s s u e h a s i o d o a e e t i e a e i d
, s o d i u m f l
u o r i d e
,
m a l o n i e a e i d
, s o d i u m a z i d e a n d Z
, 4 一 d i n i t r o p h
e n o l 五a 、 e r e川 a r k a b l e i n h i b i t i o n
o n t h e y i e l d a n d v i t a l i t y o f p r o t o p l o s t :
.
T上e y i e l d a : d v i t a l i t y o f p r o t o p -
l
a s t s g r a d u a l ly r e d u e e d w i t h : e s p i r a t o r y r a 土e w e r e i n h ib i t e d f o l l o w i n g t h e
e o n e e n t r a t i o n o f i n h i b i t o r s i n e r e a s e d
。
4
.
I t m a y r e d u e e h a r m f u 】 e f f e e t s o n y i e l d o f p r o t o p l a s t s w i t h e l i m i n a t e
i n h ib i t i o 刀 o f m a l o n i e a e i d o n r e o P i r a t室o n , w h e n 你 a l o n i e a e id 15 e o e x i s t w i t h
s u e e i n a t e
。
T o s u m u p a b o v e o x P (: r i n l (: n t a l r e s u l t s
, w e e o zz s i d e d 七h a t * 0 i s o l a t e p r o t o -
p l a s t s f r o m p l a n t e c l l b y e n z y m a t i e
r zl e t h o d 15 r c g u l a t c d b y t h e m e t a b o l i e l o v e l
o f e e l l a n d i n f l u e : e e d b y 土h e e o m l一 o n o n t s o f c s n o : i : s l o b i l i Z i n g a g e n 士. T l l e i r
r e a s o n s a r e n e e d e d t o b e S t u d y i e d i n t h e f u t t z r e
,
邵