全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第4期
油菜目前已成为全球第二大油料作物［1-3］，也
是我国重要的油料作物，在农业生产上占重要地位。
油菜的 3 个重要的栽培品种为 ：甘蓝型油菜、白菜
型油菜和芥菜型油菜。由于甘蓝型油菜产量高、适
应性广，因而在世界各地都广泛种植，是最主要的
油菜栽培品种。菜籽油可以作为食用油供人们食用，
同时，优质的油菜饼粕还是重要的蛋白质饲料 ；另
外，菜籽油在工业上也有着广泛的用途，如可以用
来生产生物柴油［4］，市场需求量巨大。但是，油菜
收稿日期 ：2012-11-05
基金项目 ：国家自然科学基金项目（30860031，31260339），农业部转基因重大专项（2009ZX08005-027B）
作者简介 ：郝晓云，女，硕士研究生，研究方向 ：可再生能源开发利用与新能源工程 ；E-mail ：hxy7630346@126.com
通讯作者 ：李鸿彬，男，博士，副教授，硕士生导师，研究方向 ：植物分子生物学与基因工程 ；E-mail ：lihb@shzu.edu.cn
甘蓝型油菜下胚轴和带柄子叶再生体系研究
郝晓云1  沈海涛1，2  李鸿彬1，2
（1. 石河子大学生命科学学院，石河子 832003 ；2. 石河子大学 农业生物技术重点实验室，石河子 832003）
摘 要 ： 以甘蓝型油菜野油 19 号的下胚轴和带柄子叶为外植体，研究其下胚轴和带柄子叶在不同浓度激素配比下的分化率
及再生频率的变化。该品系的油菜下胚轴和带柄子叶在 1.5 mg/L 的 2，4-D 中预培养 4 d 后，转入分化培养基中，其愈伤组织形成早，
发生快，再生频率和分化频率均较高。其中，下胚轴转入 MS+3 mg/L 6-BA +0.1 mg/L NAA 培养基中的分化率和再生频率最高，再
生频率达到 86.67% ；带柄子叶外植体的再生频率要比下胚轴的再生频率低，在 MS+4 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA 的分化培养基中芽
的再生频率为 46.67%。本研究初步建立了甘蓝型油菜野油 19 号的高频率再生体系。
关键词 ： 甘蓝型油菜 下胚轴 带柄子叶 再生频率 分化频率
Research on the Regeneration System from Hypocotyls and Cotyledon of
Brassica napus L.
Hao Xiaoyun1 Shen Haitao1，2 Li Hongbin1，2
（1. College of Life Science of Shihezi Universtiy，Shihezi 832003 ；2. Key Laboratory of Agrobiotechnology
of Shihezi University，Shihezi 832003）
Abstract:  To study the changes in the hypocotyls and quizzing cotyledon differentiated and plant regeneration frequency under different
concentrations of hormone combinations, hypocotyls and cotyledons with petiole of Brassica napus L.（wild-oil 19）were taken as explants. The
results showed that, after pre-cultured for 4 days using 1.5 mg/L 2, 4-D and transferred to differentiated medium of hypocotyls and cotyledons
with Petiole, the derived callus initiated earlier and developed faster with a higher induced frequency. Among them, the hypocotyls transferred
to the MS +3 mg/L 6-BA +0.1 mg/L NAA as differentiated medium reached the highest regeneration frequency of 86.67% ；However, the
regeneration frequency of cotyledon explants was much lower than hypocotyls with a final regernation frequency of 46.67% using MS with 4 mg/L
6-BA and 0.3 mg/L NAA as differentiated medium. In this study, the high frequency regeneration system of Brassica napus L.（wild-oil 19）was
established.
Key words:  Brassica napus L. Hypocotyl Cotyledons with petiole Regeneration frequency Differentiation frequency
作为食用油和工业用油原料的同时也存在着一些缺
点，如产量不高、品质不好等。因此，大力发展油
菜生产，努力提高油菜产油量、改良油菜品质，是
满足我国油料需求的有效途径。
随着基因工程技术的发展，人们越来越重视通
过基因工程技术的方法来改良油菜品种。自 1974 年
Kartha［5］首次从甘蓝型油菜的茎切片诱导出小植株
以来，国内外对甘蓝型油菜的体细胞和组织培养技
术相继开展了研究，从甘蓝型油菜的幼茎、叶片、
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第4期70
叶柄、根、子叶和下胚轴以及单细胞诱导出了植株［6］。
但是其再生能力均不太高，油菜遗传转化的效率也
不太高。影响外植体再生的因素也非常多，如激素
的浓度配比、植株的苗龄、外植体的选择等［7-9］，因此，
建立高效的甘蓝型油菜再生体系显得尤为必要。
本研究在前人研究的基础上，对甘蓝型油菜野
油 19 号的下胚轴和带柄子叶的再生体系进行探索，
初步建立该品系油菜的下胚轴和带柄子叶的再生体
系，旨在进一步为油菜遗传转化提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
材料为甘蓝型油菜野油 19 号。
培养基的组成（1）基本培养基 ：MS（含 3% 蔗
糖 +0.7% 琼脂，pH5.8）；（2）预培养培养基 ：MS+
1.0 mg/L 2，4-D 与 MS+1.5 mg/L 2，4-D 以 及 MS+
2.0 mg/L 2，4-D ；（3）分化培养基 ：MS+ 不同浓度的
6-BA 和 NAA ；（4）增殖与壮苗培养基 ：下胚轴 MS+
3.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA，带柄子叶 MS+4.0 mg/L
6-BA+0.3 mg/L NAA（5）生根培养基 ：MS+0.5 mg/L
IBA［10］和 MS+0.2 mg/L NAA［11］。
1.2 方法
1.2.1 种子消毒与无菌苗的获得 选取籽粒饱满、
大小均一的油菜种子，用无菌水浸泡并在摇床上摇
30 min 后，用 75% 酒精消毒 2 min，期间不停的震
荡；再用 10% H2O2 处理 10 min，期间不断剧烈震荡，
最后用无菌水洗 8-10 次，播种于 MS 培养基中。在
25±1℃、16 h 光照 /8 h 黑暗条件下培养 4-8 d，光
照强度为 2 000-3 000 lx。
1.2.2 不同苗龄的幼苗对下胚轴和带柄子叶外植体
生芽的影响 分别切取培养 4、5、6、7 和 8 d 的幼
苗的下胚轴和子叶，接种到预培养基 MS+1.0 mg/L
2，4-D 中 培 养 4 d， 参 考 唐 桂 香［12］ 的 生 长 素 配
比，转到分化培养基（MS+3.0 mg/L 6-BA+0.15 mg/L
NAA）中培养。35 d 后统计芽的再生和分化频率，
研究苗龄对下胚轴和子叶外植体芽再生频率和分化
频率的影响。
1.2.3 不同预处理下外植体芽的分化 切取 4 d 苗
龄的下胚轴和子叶外植体，下胚轴切成 0.5-1.0 cm
的小段，子叶带柄切下。然后分别接种于含 1.0、1.5
和 2.0 mg/L 2，4-D 的 MS 预培养基中，分别预培养 0、
2、4、6 和 8 d 后，接种于分化培养基 MS+3.0 mg/L 6-BA
+ 0.15 mg/L NAA 上，研究不同时间的预培养对下胚
轴和带柄子叶外植体芽再生的影响，35 d 统计芽的
再生频率和分化频率。
1.2.4 不同分化培养基中外植体芽的分化 取预培
养 4 d 的下胚轴和带柄子叶外植体于不同生长调节
剂的 MS 培养基上，每个培养皿（12 cm）接种 10
个外植体，每处理至少接种 30 个外植体，重复 3 次。
设 6-BA（0、2.0、3.0 和 4.0 mg/L）与 NAA（0、0.05、
0.1、0.15、0.2、0.3 和 0.4 mg/L） 组 配 28 个 处 理，
在 25±1℃、16 h 光照 /8 h 黑暗条件下培养，35 d
统计芽苗分化情况。
芽再生频率（%）= 生芽的外植体数 / 接种的总
外植体数 ×100%
分化频率（%）= 生芽总数 / 接种的总外植体
数 ×100%
1.2.5 增殖和壮苗 将在分化培养基中已经分化
出芽的外植体转入增殖和壮苗培养基，把分化出
的芽苗连同愈伤一起切下转入继代增殖培养基中
培 养， 已 生 芽 的 下 胚 轴 外 植 体 转 入 MS+3.0 mg/L
6-BA+0.1 mg/L NAA 中 ；已生芽的带柄子叶外植体转
入 MS+4.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA 中，待愈伤组织
继续分化，使已分化的芽苗长的更粗壮。
1.2.6 生根及移栽 当芽长到 2-3 cm 时，小心切下，
接种到生根培养基［13］：MS+0.5 mg/L IBA 和 MS+0.2
mg/L NAA 中进行生根诱导。20 d 后统计生根率，并
将已生根的苗开瓶炼苗 2 d，然后转入土壤中栽培，
土壤的配比为草炭土∶珍珠岩 =3∶1，覆膜 2 d 后，
揭膜，之后正常管理［12］。
2 结果
2.1 苗龄对下胚轴和带柄子叶生芽的影响
苗龄对甘蓝型油菜下胚轴和带柄子叶的分化有
显著影响，低龄幼苗的下胚轴和带柄子叶分化效果
好。其中，4 d 苗龄的再生频率最高，分别为 40%
和 33.33%。随着苗龄的增加，在 7 d 时再生频率仅
为 26.67% 和 13.33%，与 4 d 苗龄时的分化率相比逐
渐降低 ；到 8 d 苗龄时，下胚轴和带柄子叶的再生
频率分别降低到了 16.67% 和 6.67%（表 1）。
2013年第4期 71郝晓云等 ：甘蓝型油菜下胚轴和带柄子叶再生体系研究
2.2 预培养时间及培养浓度对下胚轴和带柄子叶
愈伤组织诱导和分化率的影响
研究结果（表 2）表明，经 2，4-D 预培养的下
胚轴和带柄子叶外植体均能形成愈伤组织。同时，
预培养时间对甘蓝型油菜野油 19 号的带柄子叶和下
胚轴芽的分化有很大影响，不经预培养（0 d）的带
柄子叶和下胚轴，其再生频率较低，分别为 13.33%
和 23.33%，而且分化速率也较慢，子叶需 2 周左右，
下胚轴需 3 周左右才可分化出不定芽 ；经过 2-8 d
的预培养后，带柄子叶和下胚轴的分化速率快且再
生频率均高于对照（0 d），其中以预培养 4-6 d 的效
果最好，8 d 后，再生频率下降。
表 1 苗龄对再生和分化的影响
苗龄（d）
下胚轴 带柄子叶
芽再生频率（%） 分化频率（%） 芽再生频率（%） 分化频率（%）
4 40 80 33.33 33.33
5 36.67 73.33 26.67 26.67
6 33.33 66.66 23.33 23.33
7 26.67 26.67 13.33 13.33
8 16.67 16.67 6.67 6.67
表 2 预培养时间及培养浓度对愈伤组织诱导的影响
2.3 经预培养后不同配比浓度生长调节剂对下胚
轴和子叶外植体再生的影响
研究结果（表 3）表明，甘蓝型油菜野油 19 号
的下胚轴外植体在 MS+3.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA
的培养基中芽的再生频率最高，分化率也较高 ；而
带柄子叶在 MS+4.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA 的培养
基中芽的再生频率最高。从总体来看，甘蓝型油菜
野油 19 号的下胚轴外植体比带柄子叶外植体的分化
率高，下胚轴外植体的分化数一般为 3-5 个，而带
柄子叶外植体的分化数一般为 1-2 个。另外，部分
带柄子叶在不同的分化培养基培养 1 周左右时开始
形成不定根，影响再生频率和分化频率。
2.4 增殖与壮苗
将在分化培养基中已经分化出芽的外植体转入
增殖和壮苗培养基中后，20 d 后，可以观察到愈伤
组织又分化出了一些芽，已分化的芽长的更加粗壮
（图 1）。
2.5 生根与移栽
将 分 化 出 的 芽 在 MS+0.5 mg/L IBA 和 MS+0.2
mg/L NAA 培养基中培养，15 d 左右开始生根，且均
2，4-D 浓度（mg/L） 预培养时间（d）
下胚轴 带柄子叶
芽再生频率（%） 分化频率（%） 芽再生频率（%） 分化频率（%）
0 0 23.33 23.33 13.33 13.33
1.0 2 40 40 26.67 26.67
1.0 4 46.67 70.05 30 30
1.0 6 43.33 65 20 20
1.0 8 33.33 33.33 16.67 16.67
1.5 2 50 50 36.67 36.67
1.5 4 80 160 40 60
1.5 6 56.67 113.34 30 45
1.5 8 36.67 36.67 26.67 26.67
2.0 2 43.33 65 26.67 26.67
2.0 4 50 75 36.67 36.67
2.0 6 33.33 50 33.33 33.33
2.0 8 30 30 23.33 23.33
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第4期72
能诱导根的生成（图 2）。但是添加 NAA 的培养基中
的苗生根情况没有添加 IBA 的培养基中的苗生根
粗壮，并且在生根的同时还有愈伤生成，移栽后，
成活率很低 ；添加 IBA 的培养基的苗移栽后成活
率 100%。
3 讨论
许多研究表明，油菜的高效再生体系的建立，
与苗龄、预培养时间、生长调节剂浓度等有关。万
萌等［14］报道，以甘蓝型油菜子叶柄为外植体时，
苗龄 <4 d 或 >5 d 的生长情况均不好，4-5 d 的材料
较为适宜；秦明辉等［15］对芥菜型油菜的研究也表明，
4 d 的子叶分化能力最强。其机理可能是 4-6 d 的子
叶柄切面薄壁细胞具有较高的再生能力，而苗龄较
高的子叶柄，其切面细胞已开始分化，细胞分裂能
力逐渐降低，故不定芽再生能力较低［16］。本研究中，
对 4-8 d 苗龄的甘蓝型油菜野油 19 号的下胚轴外植
体和带柄子叶外植体的再生情况进行了研究，4-6 d
表 3 不同生长调节剂浓度配比对外植体再生的影响
图 1 外植体的增殖
序号
生长素浓度 下胚轴 带柄子叶
6-BA（mg/L） NAA（mg/L） 芽再生频率（%） 分化频率（%） 芽再生频率（%） 分化频率（%）
1 0 0 0 0 0 0
2 0 0.05 10 10 6.67 6.67
3 0 0.1 13.33 13.33 10 10
4 0 0.15 16.67 16.67 13.33 13.33
5 0 0.2 13.33 13.33 16.67 16.67
6 0 0.3 10 10 13.33 13.33
7 0 0.4 6.67 6.67 6.67 6.67
8 2 0 16.67 16.67 10 10
9 2 0.05 50 100 16.67 16.67
10 2 0.1 30 60 20 20
11 2 0.15 23.33 35 23.33 23.33
12 2 0.2 20 30 16.67 33.34
13 2 0.3 16.67 50.01 13.33 13.33
14 2 0.4 13.33 26.67 20 20
15 3 0 36.67 36.67 10 10
16 3 0.05 70 210 13.33 13.33
17 3 0.1 86.67 260.01 16.67 16.67
18 3 0.15 76.67 230 20 20
19 3 0.2 60 120 23.33 23.33
20 3 0.3 40 80 26.67 26.67
21 3 0.4 26.67 40 40 40
22 4 0 20 30 13.33 13.33
23 4 0.05 36.67 55 16.67 16.67
24 4 0.1 30 45 30 30
25 4 0.15 25 37.5 33.33 50
26 4 0.2 40 60 40 60
27 4 0.3 33.33 33.33 46.67 93.33
28 4 0.4 16.67 16.67 43.33 65
2013年第4期 73郝晓云等 ：甘蓝型油菜下胚轴和带柄子叶再生体系研究
的再生频率较高，其中 4 d 苗龄的外植体的再生频
率和分化频率最高。
预培养时间对外植体的分化作用也有很大影
响。石淑稳［17］、万萌等［14］的研究认为 2，4-D 能提
高愈伤分化率、质量和时间，对诱导油菜愈伤组织
是必需的。石淑稳等［17］认为在预培养中，2，4-D 对
器官的发生具有很强的启动和诱导作用，凡是接触
预培养基的一端首先产生硬实、绿色、颗粒状的愈
伤组织。Miki 等［18］的研究也证明了 2，4-D 对芽器
官具有很强的诱导作用。赵云等［19］比较了 2，4-D、
IAA、ZT、6-BA 的浓度对不同基因型甘蓝型油菜子
叶愈伤组织分化的影响，结果表明，2，4-D 更能诱
导外植体长出愈伤组织，分化率也较高。王艳等［10］
认为，甘蓝型油菜下胚轴于 MS+1.0 mg/L 2，4-D 中
预培养 3 d，最有利于芽苗的再生。本研究中，将外
植体分别置于不同浓度的 2，4-D 中预培养 0-8 d，经
过预培养的外植体均能诱导愈伤生成，预培养 4-6
d 后的外植体再生和分化情况较好，其中在 1.5 mg/L
2，4-D 中预培养 4 d 后的外植体再生频率和分化频率
最高。
植物生长调节剂是影响外植体再生的一个重
要因素，在组织培养中一般都是采用 6-BA 和 NAA
的组合。李会珍等［20］、石淑稳和周永明［21］认为
高浓度的 6-BA 与低浓度的 NAA 配合使用能够促
进油菜子叶和下胚轴的分化出芽。王艳等［10］研究
表明，甘蓝型油菜 912 品系的带柄子叶在 4.0 mg/L
6-BA+0.02 mg/L NAA 的分化培养基中，其芽苗再生
频率较高 ；当浓度超过 0.2 mg/L 时，下胚轴所形成
的愈伤会产生大量的毛状根，芽的再生频率也会显
著下降 ；当浓度超过 0.5 mg/L 时，则会明显抑制不
定芽的分化，并且随着 NAA 的浓度升高，玻璃化现
象越明显。唐桂香 ［12］认为，子叶外植体在 3.0 mg/L
6-BA+0.15 mg/L NAA 的培养基中分化频率较高，下
胚轴外植体在 4.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA 的培养
基中分化频率较高。本研究中，将下胚轴和带柄
子 叶 分 别 接 种 于 MS+3.0 mg/L 6-BA +0.1 mg/L NAA
和 MS+4.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA 的 分 化 培 养 基
中，外植体的再生频率达到最高，分别为 86.67% 和
46.67%。虽然，下胚轴外植体的出芽时间比带柄子
叶外植体的慢，但是其再生频率和分化率均比带柄
子叶的高。同时，带柄子叶外植体在转入分化培养
基 1 周左右时，各种激素浓度配比下的带柄子叶外
植体都有不定根产生。而下胚轴外植体在 NAA 浓度
小于 0.1 mg/L 时，外植体所形成的愈伤也会产生大
量不定根 ；当 NAA 浓度高于 0.2 mg/L 时，仍然会有
部分不定根生成，从而影响了生芽频率，这与王艳
等［10］的研究结果不尽一致，可能是由于油菜的基
因型不同所致。
目前，油菜的基因转化和再生频率等仍然比较
低，这是因为不同基因型、不同品种的油菜分化频
率差异较大，同时，基因型对油菜再生频率也有很
大的影响［22-24］。因此，研究的重点不仅要放在探索
合适的外植体分化及转化条件，还要放在研究形成
这些差异的分子机理，从而从根本上提高油菜的再
生和分化频率［6］。
4 结论
甘蓝型油菜野油 19 号的再生体系研究，结果表
明，下胚轴外植体的下胚轴是建立野油 19 号再生体
系较为理想的材料。
A B
图 2 再生苗的生根（A）和移栽（B）
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第4期74
参 考 文 献
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（责任编辑 狄艳红）