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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第12期
苏云金芽胞杆菌是一种革兰氏阳性芽胞杆菌，
由于其对目标害虫高效专一，对非目标生物安全而
广泛用于对鳞翅目（Lepidoptera）、双翅目（Diptera）、
鞘翅目（Coleoptera）等农林害虫的防治［1］。Bt 杀
虫蛋白主要有 Cry 蛋白、Vip 蛋白和 Sip 蛋白。其中
Cry 蛋白和 Vip 蛋白研究较为深入，已发掘种类较
多［2］。截至 2012 年 4 月 16 日，国内外共有 764 个
杀虫晶体蛋白基因被命名，ICPs 按其核苷酸序列的
同源性被分为 cry1-cry70、cyt1、cyt2、cyt3 共 73 类
661 个。其中 cry 基因 624 个 ；cyt 基因 37 个 ；vip 基
因分为 vip1，vip2，vip3，vip4，4 类 103 个（http：//www.
lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/toxins2.
html）。 而 Sip 蛋 白 除 Sip1A 外， 国 内 外 均 未 见 报
收稿日期 : 2012-05-28
基金项目 : 国家“863”子项目（2011AA10A203），国家“863”项目（2010RCB54）
作者简介 : 刘艳杰 , 女 , 硕士研究生 , 研究方向 : 生物化学与分子生物学 ; E-mail: liuyanjie0307@163.com
通讯作者 : 高继国 , 男 , 博士生导师 , 研究方向 : 生物化学与分子生物学 ; E-mail: gaojiguo1961@hotmail. com
Bt 新型基因 sip 的克隆、表达和生物信息学分析
刘艳杰  李海涛  刘荣梅  高继国
（东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030）
摘 要 ： 苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）杀虫晶体蛋白对农业害虫有特异的杀虫活性，对环境无污染、对人畜
无害，成为目前为止研究和应用最为广泛的生物杀虫剂。其中内毒素（insecticidal crystal proteins，ICPs）和营养期杀虫蛋白（vegetative
insecticidal protein，VIP）研究范围广、技术成熟，而分泌期杀虫蛋白（Secreted insecticidal protein，Sip）相关报道较少。为进一步
发掘我国苏云金芽胞杆菌的菌株资源和新型基因资源，从不同生态环境中分离出 400 株 Bt 野生菌株进行 sip 基因的克隆鉴定，其
中 Bt 野生菌株 QZL26 扩增得到 1 038 bp 的碱基的序列，编码 345 个氨基酸，与 Sip1A 蛋白氨基酸序列同源性为 91.83%。测序结
果提交 GenBank 注册，登录号为 JQ965994。
关键词 ： 苏云金芽胞杆菌 sip 基因 克隆 表达 生物信息学分析
Bt New Gene sip Cloning, Expression and Bioinformatics Analysis
Liu Yanjie Li Haitao Liu Rongmei Gao Jiguo
( Life Science College of Northeast Agricultural University, Harbin 150030 )
Abstract:  Bacillus thuringiensis is the most widely applied type of microbial pesticides because of its high specificity and environmental
safety. There is a wide range of researchs about ICPs and Vip, but little was known about Sip. To further explore novel Bacillus thuringiensis
strains and the new gene resources in our country, we isolated 400 wild strains from different entironment for sip gene cloning and identification,
of which amplification from QZL26 isolate got a sequence of 1 038 bp which codes 345 amino acids and the similarity of the amino acid sequence
with the Sip1A is 91.83%. Sequencing result was submitted to GenBank, and the registration number is JQ965994.
Key words:  Bacillus thuringiensis sip gene Cloning Expression Bioinformatics analysis
道。2006 年，Donovan 等［3］ 从 含 有 cry3A 基 因 的
EG2158D 菌株基因组文库中克隆得到对鞘翅目昆
虫有活性的 Bt 新型分泌蛋白 Sip1A。Sip1A 序列由
1 104 个碱基组成，编码 367 个氨基酸。Sip1A 与杀
蚊蛋白 Mtx3［4］的相似性为 46%。主要对美国科罗
拉多州马铃薯甲虫（CPB）幼虫有杀虫活性，半致
死量为 0.12（0.09-0.15）μg/mL， 可导致烟芽夜蛾、
棉铃虫 he 玉米根叶甲虫萎缩体重明显下降［3］。为
了进一步发掘我国的苏云金芽胞杆菌的菌株资源
和新型基因资源，本研究从几种不同生境中采集
土样进行野生菌株分离。从分离到的菌株中选取
400 株晶体形状为球形或类似球形的菌株进行深入
研究。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第12期102
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品采集和菌株来源 分离菌株所用土样分
别采自吉林龙潭山、辽宁千山、黑龙江五常等地。
在样品采集区内大致按均匀分布采集了 30 000 份土
样，分别装入灭菌处理的样品袋并密封送回实验室，
于低温、干燥处保存。本研究从中挑取 3 500 份样品，
用醋酸钠 - 抗生素筛选法［5］进行菌株分离，共分离
出 400 株非菱形晶体 Bt 野生菌。
转化受体菌 E. coli JM109、E. coli Rosetta 由本
实验室保存。
1.1.2 主要试剂和仪器 Taq DNA 聚合酶、KOD 酶、
pMD19-T Simple Vector、Amp、X-Gal、IPTG、DNA
Marker 及蛋白质分子量标准均购自 TaKaRa 公司。质
粒 DNA 提取试剂盒、胶回收试剂盒购自美国 Axygen
公司。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。
主 要 仪 器 包 括 ：Labnet PCR 仪 ：Multigene Gradi-
ent（TC9600-G-230V）、蛋白电泳仪 ：BIO-RAD MiNi-
PROTEAN Tetra system、离心机 Beckman ：AllegraTM
64R Centrifuge、北京赛智创业科技有限公司（SAGE-
CREATION）ChampGel 6000 全 自 动 凝 胶 成 像 系 统
Gel Documentation And Image Analysis System 等。
1.1.3 其他试剂和药品 培养基、SDS - PAGE 试剂
采用常规配方。DNA Marker DM2000 ：5000、3000、
2000、1000、750、500、250 和 100 bp 。蛋白质分
子 量 标 准（ 低 ）：97.2、66.4、44.3、29.0、20.1 和
14.3 kD。其他试剂为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 从土壤中分离 Bt 菌 Bt 菌分离纯化方法，见
吴丽云等［6］。
1.2.2 sip 基 因 的 克 隆 利 用 NCBI BLAST 在 线 工
具比对 sip1A 的氨基酸序列［3］，发现其与 cry3Aa1/
cry3Bb 氨基酸序列有重叠区域，根据此重叠保守区
域用 primer 5 软件设计出用于 sip 基因鉴定的引物
对 sq5/sq3。根据 sip1A 基因的全长序列设计全长引
物 sqc5/sqc3 备用。引物序列如下（上海生工合成）
sq5：5-CTGGTAAACCAATAAATATGCAAG-3，sqc5：
5-ATGAAAAATAGATTTTCAAAAGTGGC-3，sq3 ：
5-GTTGCTCTATAATATGGATTAGCAC-3，sqc3 ：5-
CAATTTAAAGTTTTCACTTAATACCTTTG-3。 提 取
Bt 总 DNA 为模板进行 PCR 扩增。PCR 反应为 20 μL
体系［7］。PCR 反应程序 ：95℃预变性 8 min ；95℃
变性 1 min，54℃复性 1 min，74℃延伸 1.5 min，30
个循环 ；74℃后延伸 10 min。PCR 产物用 0.7% 琼
脂糖进行电泳检测，北京赛智创业科技有限公司
（SAGECREATION）ChampGel6000 全 自 动 凝 胶 成
像系统 Gel Documenta-tion And Image Analysis System
成像。
扩 增 产 物 的 回 收 纯 化 参 照 Axygen 公 司 的 胶
回收试剂盒说明书进行。将回收的 PCR 产物连接
pMD19-T Simple Vector 克隆载体并转入 E. coli JM109
中，筛选阳性克隆进行 PCR 验证，以便确认其是否
连有目的片段。提取连接正确的重组细菌的质粒送
往上海生工生物工程有限公司，进行序列测定。用
Clone Manager、NCBI Blast、DNAMAN 等软件拼接、
分析测序结果、进行氨基酸序列同源性比对。
1.2.3 sip 基因在大肠杆菌中的表达 以 sqc5/sqc3
为引物，用 KOD 酶对 sip 基因进行克隆，胶回收产
物连接 pEB 表达载体、转化到 E. coli JM109 中［8］。
以载体表达区正向引物 pEBF 和全长基因反向引物
进行 PCR 鉴定，筛选出方向正确的阳性转化子送上
海生工测序，测序结果分析同上。提取阳性转化子
重组质粒转入 E. coli Rosetta 中，进行诱导表达。采
用 IPTG 诱导表达法，具体条件见李长友等［7］的报
道。收集诱导物离心弃上清，用 10 mmol/L Tris-HCl
（pH8.0）缓冲液悬浮细胞并进行超声波破碎，取样
进行 SDS-PAGE 分析［9］。大肠杆菌质粒 DNA 提取、
酶切、连接、转化及 Bt 质粒提取参照刘晶晶等［10， 11］
的方法，杀虫晶体蛋白样品制备和 SDS-PAGE 电泳
检测方法参见苏旭东等［12］的方法。
2 结果
2.1 菌株分离
将分离得到的菌株接种于 LB 固体培养基上，
30℃培养 72 h 后，进行涂片、烘干、固定、镜检。
菌株 QZL26 镜检结果，如图 1 所示。通过显微镜镜
观察菌体均为长杆状，芽胞为长圆棒状，晶体为球形。
2.2 苏云金芽胞杆菌sip基因的克隆
提取分离得到的 400 株 Bt 野生菌株的基因组作
2012年第12期 103刘艳杰等 ：Bt 新型基因 sip 的克隆、表达和生物信息学分析
模板，以引物对 sq5/sq3 对分离得到的 400 株 Bt 野
生菌株进行 PCR 鉴定，其中 Bt 野生菌株 QZL26 扩
增得到约 826 bp 的目的条带。与设计引物时所用基
因片段的大小一致。再以引物对 sqc5/sqc3 对 QZL26
进行进一步扩增，得到 1 038 bp PCR 产物，结果如
图 2 所示 。
M. DNA Marker ；1. 引物对 sq5/sq3 扩增产物 ；2. 引物对 sqc5/sqc3 扩增产物
图 2 PCR 产物
M. 蛋白质 Marker ；1. sip 表达蛋白 ；2. 空白对照
图 3 QZL26 表达蛋白
图 1 QZL26 的晶体形态
㣭㜎
Ღփ Ღփ
㣭㜎
M 1 2
1038
bpbp
5000
3000
2000
1000
750
500
250
100
826
将引物对 sqc5/sqc3 扩增产物回收、连接、转
化后经蓝白斑筛选，挑取阳性克隆进行测序，用
DNAMAN 分析测序结果并翻译为氨基酸序列。测序
结果显示，QZL26 菌株中的 sip 基因长 1 038 bp，其
中 A 为 415 个、C 为 145 个、G 为 173 个、T 为 305 个，
分别占总数的 39.98%、13.97%、16.67% 和 29.38%。
该基因编码 345 个氨基酸，与 sip1A 蛋白氨基酸序
列同源性为 91.83%，相差 30 个氨基酸。
2.3 sip基因在大肠杆菌中的表达
sip 基 因 在 E. coli 中 的 诱 导 表 达 产 物 的 SDS-
PAGE 分析结果（图 3）表明，该 sip 基因编码的杀
虫晶体蛋白为 39 kD，与推测的蛋白大小一致。
M 1 2
Sip㳻ⲭ
99.7
kD
66.4
44.3
29.0
20.1
2.4 生物信息学分析
2.4.1 氨基酸序列分析 应用 DNAMAN软件根据sip
基因序列推测出其氨基酸序列并进行序列分析。分
析结果显示，该蛋白由 345 个氨基酸组成，蛋白质
分子质量约为 38.86 kD，亲水性氨基酸占 42.32％，
疏水性氨基酸占 33.62％，酸性氨基酸占 10.43％，
碱性氨基酸占 13.62％，等电点为 9.36，为弱碱性蛋
白质。氨基酸组分分别为 ：丙氨酸、半胱氨酸、天
冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异
亮氨酸、赖氨酸及苏氨酸等。其中苏氨酸、赖氨酸
和异亮氨酸数量最多，分别为 32 个、31 个和 26 个，
所占比例分别为 8.46%、10.06% 和 7.57%。
2.4.2 蛋 白 质 功 能 区 的 预 测 运 用 www.cbs.dtu.
dk/services/TMHMMM 网站的在线工具 TMHMMM 分
析蛋白的跨膜区［13］，Sip 蛋白的跨膜区分析结果（图
4）显示，其跨膜区大约由 25 个疏水氨基酸组成。
在线工具 http ：//www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan 网站
的 Conserved Domain Search 进行功能区预测［14］，预
图 4 蛋白的跨膜区
1.2
0.8
0.6
0.4
0.2
0
1
pr
ob
ab
ili
ty
50 100 200 300250150
transmembrane inside
inside
outside
outside
transmembrane
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第12期104
测结果显示，该蛋白有一个 Domain，此 Domain 与
球形芽胞杆菌的 ETX-MTX 2［4，15］Super family 杀蚊
基因蛋白的 Domain 相似。因此，估计该 Sip 蛋白与
ETX-MTX 2 蛋白的活性相近。
3 讨论
自 2004 年 9 月 11 日，美国能源部的 Brettin 等
在 NCBI 上公布了 Bt97-27 的基因组全序列以来，各
国科学家加强了对这一细菌的深入研究［16］，使 Bt
的研究进入了基因组时代。Bt 杀虫晶体蛋白广泛应
用于鳞翅目、双翅目、鞘翅目、膜翅目（Hymenoptera）、
同翅目（Homoptera）、直翅目（Orthoptera）、食毛目
（Mallophaga）以及线虫、螨类和原生动物等 16 个
目 3 000 多种重要的农林害虫的防治［17］。而目前能
够用于转基因植物的 Bt 基因种类单一，具有自主知
识产权的新型基因较少，用于转基因抗虫作物开发
的基因十分有限［18］。基于生物信息学比对和聚类技
术开发起来的 PCR-RFLP 快速鉴定分型系统［19］、杀
虫晶体蛋白基因的基因芯片的快速鉴定检测系统［20］
等的应用，促进了高分类等级的杀虫晶体蛋白基因
和具有自主知识产权的模式基因的分离。
本研究从几种不同生境中采集土样进行 Bt 野生
菌株分离，得出 Bt 菌的分布具有一定的规律性 ：森
林生态条件稳定，直射阳光少，昆虫种群丰富，土
壤表面腐质层厚，土壤所含腐殖质丰富，植被覆盖
率高，原始植被保存完好的地区，Bt 出菌率高。本
研究以从我国不同地区分离出的 400 株苏云金芽胞
杆菌进行基因的鉴定，其中 Bt 野生菌株 QZL26 获得
图 5 二级结构图
2.4.3 蛋白质二级结构预测 用 ANTHEPROT V5.0
中 Carnier 方法对 Sip 蛋白进行二级结构预测，结果
（图 5）表明，在蛋白质二级结构中 16.52% 为 α-螺旋，
31.02% 为 β-折叠，52.46% 为无规则卷曲。
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
9.0
10.0
ਟ㜭
1 87 173 259 345
≘ส䞨ս㖞
㷪᯻ᣈਐᰐ㿴ࡉধᴢ
1 038 个碱基的完整序列并提交 GenBank 注册，登
录号为 JQ965994。通过氨基酸序列分析得知该 Sip
蛋白与 Sip1A 氨基酸序列一致性为 91.83%，相差 30
个氨基酸。sip 基因的克隆充分证明了我国地域辽阔、
生境类型多样、生物多样性丰富，是生物物种的天
然基因库［18］。
随着 Bt 基因在抗虫转基因植物中应用的不断扩
大，Bt 抗虫基因在田间应用过程中毒力不强、杀虫
谱窄、持效期短、害虫易产生抗性等缺点和局限性
问题逐渐凸显［21］，cry 基因编码的晶体蛋白均在不
同程度上引起昆虫抗药性的产生［16］。不同的 Bt cry
基因表达的蛋白有着不同的毒力和杀虫谱［18］，因此，
从不同生态环境下进行菌株资源及其基因的发掘、
筛选和克隆毒力高、杀虫谱广、不易产生抗性和交
互抗性的新型基因或基因组合以及新型 sip 基因的
进一步研究对于扩大杀虫谱、延缓害虫抗药性的产
生具有重要的理论意义和实用价值。sip 基因的研究
进一步发掘了我国丰富的生物物种优势，丰富和完
善了我国 Bt 抗虫基因库。新型基因 sip 的克隆为 Bt
基础研究及转基因植物、Bt 工程菌的构建提供了新
材料。
4 结论
通过对吉林龙潭山、辽宁千山、黑龙江五常等
2012年第12期 105刘艳杰等 ：Bt 新型基因 sip 的克隆、表达和生物信息学分析
地采集到的 3 000 份土样进行分离，得到 400 株野
生菌株，平均出土率为 13.33%。对这 400 株菌进行
PCR 鉴定，成功克隆了一个与 sip1A 相似性为 91.83%
的 sip 基因，序列已提交 GenBank 注册，登录号为
JQ965994。在大肠杆菌 Rosetta（DE3）中表达了新
型杀虫蛋白基因 sip，Sip 蛋白为 39 kD 左右。运用
生物信息学软件分析了 Sip 蛋白氨基酸序列、跨膜区、
二级结构等。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）