全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第4期
收稿日期 : 2011-10-14
基金项目 : 广东省科技计划项目（2006B20730008）
作者简介 : 罗芳 , 女 , 硕士 , 研究方向 : 植物学 ; E-mail: akidreams@hotmail.com
通讯作者 : 谢致平 , 女 , 博士 , 副教授 , 研究方向 : 植物学 ; E-mail: xiezping@mail.sysu.edu.cn
纳米器件对叶蛋白提取的影响
罗芳 熊劲松 谢致平
（中山大学生命科学学院 植物与微生物互作分子机制实验室，广州 510006）
摘 要： 从植物中提取蛋白质包括机械破碎和离心等一系列步骤，蛋白质在提取液中的溶解度直接影响蛋白提取率和产量。
结果表明，用纳米器件处理过的提取液能显著提高叶蛋白的提取率，提升幅度为 10%-30%。利用正交试验研究不同提取条件下纳
米器件对蛋白可溶性的影响，结果显示浸泡时长（纳米器件浸泡在提取液中的时长）是最关键的已测因素。此外，植物样品的破
碎程度也是影响叶蛋白提取率的关键因素之一。
关键词： 纳米器件 叶蛋白 提取率 可溶性
Effects of Nanomaterials on Extraction of Leaf Proteins
Luo Fang Xiong Jinsong Xie Zhiping
（Laboratory of Molecular Plant-Microbe Interactions, School of Life Sciences, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510006）
Abstract: The solubility of proteins in the extraction buffer has a significant impact on the extraction rate and protein yield. In this
study, we investigated effects of different nanomaterials on extraction of leaf proteins by quantification the yield of soluble proteins. The results
indicate that extraction buffers, when soaked with nanomaterials, significantly increased the content of soluble proteins during the extraction
process （increased yields in the range between 10% and 30%）. Orthogonal experiments were performed in order to investigate the effects of
nanomaterials on protein solubility during different leaf protein extraction procedures. The results suggest that the soaking time （incubation time
of extraction buffer with nanomaterials） is the most crucial factor. Furthermore, the particle size of crushed leaf material strongly affected the
yield of extracted proteins.
Key words: Nanomaterials Leaf proteins Extraction rate Solubility
叶蛋白亦称植物浓缩蛋白或绿色蛋白浓缩物
（leaf protein concentrates，简称 LPC）［1］，是以植物
的生长组织绿叶为原料，通过榨汁并且离心之后，
在汁液中提取得到的植物蛋白质［2］，属于“功能
蛋白质”［3］。叶蛋白作为一种天然蛋白质，不仅储
藏量大，而且氨基酸组成齐全、含量丰富、配比合
理［4］，可以广泛应用在保健食品、饲料工业等方面。
通过人工提取获得的叶蛋白为可溶性蛋白，包括叶
绿体基质蛋白、细胞质蛋白和可溶性部分的线粒体
蛋白［1］。组成植物叶片蛋白的另外一类蛋白是不可
溶的固态蛋白，存在于榨汁后分离的绿色沉淀物中，
包括不可溶的线粒体与叶绿体构造蛋白、细胞壁蛋
白和核蛋白。在提取叶蛋白的过程中，植物原料经
过匀浆、研磨和压榨等机械破碎之后，再经过离心，
不可溶的固态蛋白与残渣被分离出去，余下的可溶
性蛋白分散在上清液中［1］。目前对提取叶蛋白的研
究主要集中在利用蛋白质等电点的性质，通过加热
法、酸碱度法及有机溶剂法等方法，从叶蛋白提取
的上清液中获得絮凝的叶蛋白［5］。由此可见，叶蛋
白在提取液中的溶解程度直接影响到叶蛋白的提取
率和最终产量。
纳米科学诞生于 20 世纪 80 年代，是现代物理
与工程技术的结晶，并与物理、化学、生物、材料
等学科形成相互渗透的交叉学科［6］，产生了许多
新的研究领域［7］。纳米科学以纳米为研究对象，在
1-100 nm 的体系内通过直接操纵和安排原子、分子
2012年第4期 99罗芳等 ：纳米器件对叶蛋白提取的影响
创造新物质，研究其力、光、电磁、热、声等方面特性，
揭示物质的组成、运动规律与相互作用。根据纳米
的定义，纳米材料是指粒径在 1-100 nm 范围内的物
质颗粒以及它们所构成的纳米材料，诸如纳米微粒、
纳米固体和纳米薄膜，这些材料在三维空间里至少
有一维处于纳米尺度范围或由它们作为基本单元构
成。纳米级的物质具有比表面积大、量子效应和宏
观量子隧道效应等几种特性。纳米材料在催化效
应［8］、光、电、热力学性质［9, 10］等方面都出现了与
本体物质有显著差异的现象，称之为“纳米效应”［11］。
进入 21 世纪以来，纳米科技不断涌现新的应用方向，
在计算机、化工、光学以及军事等领域带动了诸多
研究热点。随着纳米科技的发展，它也开始在环保［8］、
医学和生物领域发挥作用［12］。研究表明，纳米材料
能够发射出远红外光［13］，具有光催化的作用，该特
性被应用在环保领域，例如利用纳米级 TiO2 降解难
溶的有机化合物多氯联苯，是一种新兴的光催化氧
化水处理技术［14］。此外，纳米材料的光催化作用还
应用在农业生产上。据报道，用纳米材料处理水后，
通过能态的改变使得水分子簇变小，处理后的水对
其他物质的作用发生改变，可以加快作物的生长发
育［15, 16］，增加磷在水中的溶解能力［13］。
本研究采用几种纳米器件研究水葫芦、番茄和
菠菜叶片经过不同处理后的叶蛋白溶解性，通过可
溶性蛋白的定量测定，研究纳米器件在对上述植物
进行叶蛋白提取的过程中，对提取液中可溶性蛋白
含量的影响。同时，通过设计正交试验，对叶蛋白
的提取条件进行优化组合。
1 材料与方法
1.1 材料
本研究所用纳米器件为：纳米高能片，购自广州
市晟源环保生态科技有限公司（专利号 200610036-
397.5）；强 863 助长器，购自江西南昌纳米高新技
术开发有限公司（专利号 ZL01329943.3）。
1.2 方法
1.2.1 纳米高能片提取番茄叶茎匀浆液中的叶蛋
白 用超纯水 （aquaMAX Ultra）配制浓度为 2%
（W/V）的偏重亚硫酸钠溶液作为番茄叶蛋白提取
液。纳米高能片在提取液中分别浸泡 3 h 和 6 h 作为
处理Ⅰ和处理Ⅱ，另取未经纳米高能片浸泡过的提
取液作为处理Ⅲ。快速称取在 -20℃下冻存的蕃茄
叶茎 140 g，与 3 种不同处理的提取液混合（质量比
为 1 1.2）并在烧杯中压实，浸泡 30 min。然后用匀
浆机 （WARIN G，800S）在室温下匀浆 4 min，用纱
布将汁液挤出，收集滤出液离心（4 200 r/min，4℃，
20 min），收集离心后的上清液用 Bradford 法作蛋白
定量分析。以上各处理均设置 3 个重复，所得数据
用 SPSS 软件进行单因素方差分析和多重比较。
1.2.2 纳米高能片提取新鲜菠菜叶茎匀浆液中的叶
蛋白 用超纯水（aquaMAX Ultra）作为菠菜叶蛋白
提取液。纳米高能片在超纯水中浸泡 3 h 作为处理
Ⅰ，未经纳米高能片浸泡的超纯水作为处理Ⅱ。取
新鲜菠菜叶茎 100 g，剪碎放置于烧杯中，加入
120 mL 提取液浸泡 30 min。用匀浆机（WARIN G，
800S）在室温下匀浆 4 min，用纱布将汁液挤出，收
集滤出液离心（4 200 r/min，4℃，20 min），收集离
心后的上清液用 Bradford 法作蛋白定量分析。以上
各处理均设置 3 个重复，所得数据用 SPSS 软件进行
t检验分析。
1.2.3 正交设计试验提取水葫芦粉末中的叶蛋
白 为了对影响提取叶蛋白的因素进行综合比较，
优化叶蛋白提取条件，本研究设计了三因素三水平
的正交试验 L9（33）。叶蛋白提取的影响因素分别是
提取液 pH 值（A），提取液中 NaCl 浓度（B）以及
纳米高能片在提取液中浸泡的时间（C）。3 个因素
对应的不同水平见表 1。
表 1 正交试验的 3个因素及其水平
因素 编号 水平 1 水平 2 水平 3
提取液pH A 5.0 8.0 7.0
NaCl浓度（mmol/L） B 50 100 200
纳米高能片的浸泡时间（h） C 6 0 3
用 3 种不同的缓冲液使提取液的 pH 值保持在
一定水平，这 3 种缓冲液分别是 ：50 mmol/L Tris-Cl
（pH8.0），50 mmol/L CH3COONa/CH3COOH（pH5.0）
和 50 mmol/L Na2HPO4/NaH2PO4（pH7.0）。用 SPSS 软
件设计试验分组，共制定了 9 组试验组合。
液氮研磨水葫芦叶片成精细的粉末，快速混匀
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第4期100
后各取 0.1 g 放入 2 mL Eppendorf 管中，按照正交试
验设计加入不同组合的提取液（质量比为 1 10）并
于室温静置 30 min［17］。然后离心（4 200 r/min、4℃、
20 min）并收集上清液，用 Bradford 法作蛋白定量
分析。所得结果用 SPSS 软件进行方差分析。
1.2.4 强的助长器湿法提取菠菜叶茎冻干粉中的叶
蛋白 新鲜菠菜叶茎在 -70℃冰箱里冻存过夜后，在
冻干机中冻干，再用中药研磨机研磨成 200 目的
细粉。用超纯水（aquaMAX Ultra）配制 50 mmol/L
Tris-Cl（pH8.0）缓冲液，作为菠菜叶茎冻干粉叶蛋
白的提取液。用强的助长器浸泡提取液 3 h 作为处
理Ⅰ，未经助长器浸泡过的提取液作为处理Ⅱ。取
菠菜叶茎冻干粉 1 g 置于 50 mL 离心管，加入 30 mL
提取液并在摇床里水平晃动 30 min（约 100 r/min）。
然后离心（4 200 r/min，4℃，20 min）并收集上清液，
用 Bradford 法作蛋白定量分析。以上各处理均设置
4 个重复，所得数据用 SPSS 软件进行 t检验分析。
1.2.5 Bradford 法蛋白定量 上述所有叶蛋白提取
试验所得上清液中的蛋白质含量采用 Bradford 法测
定［18］。待测样品和作为标准曲线测绘的牛血清蛋白
（bovine serum albumin，简称 BSA）与 Bradford 试剂
（上海申能博彩生物科技公司）按照 1 10 的比例混
合，10 min 之后使用分光光度计或者酶标仪分别在
595 nm 或 570 nm 处测定 OD 值。根据样品的 OD 值
计算其蛋白质含量。
2 结果
2.1 纳米高能片对冷冻番茄叶茎匀浆液上清中可
溶性蛋白含量的影响
经纳米高能片浸泡 3 h 后的 2%（W/V）偏重亚
硫酸钠溶液能显著地提高番茄叶茎 LPC 的提取率，
浸泡 6 h 的溶液提取效果并不明显（表 2）。
2.2 纳米高能片对新鲜菠菜叶茎匀浆液上清中可
溶性蛋白含量的影响
如表 3 所示，经过纳米高能片浸泡 3 h 的超纯
水提取的新鲜菠菜叶蛋白明显比未经纳米高能片浸
泡的超纯水提取的 LPC 含量高，提升幅度为 20%。
表 2 纳米高能片对番茄叶茎匀浆液上清中可溶性
蛋白含量的影响
纳米高能片的浸泡时间（h） 蛋白提取率（mg/g 鲜重）
3 1.114±0.205a
6 0.169±0.020b
9 0.055±0.049b
Tukey HSD 检验，a、b 代表差异性（P<0.05），（x±s，n=3）
2.3 正交设计试验提取水葫芦叶蛋白结果分析
表 4 为正交试验提取水葫芦叶蛋白的结果。通
过直观分析，根据各试验因子的总计数或平均数可
以看出 ：经纳米高能片处理的提取液比未经纳米高
能片处理的提取液提取水葫芦叶蛋白的效果明显要
好，处理6 h略好于处理3 h；提取液中NaCl浓度越高，
提取效果越好，但差别较小 ；提取液 pH 对叶蛋白
提取效果基本没有影响。从 SPSS 软件的方差分析
结果（表 5）可以看出，pH 和 NaCl 浓度对提取水
葫芦叶蛋白的影响较小，纳米高能片处理时间对叶
蛋白在提取液中的溶解性影响较大，但未达到显著
水平。综上，提取水葫芦叶蛋白的最优组合为提取
液用纳米高能片处理 6 h，NaCl 浓度取 200 mmol/L，
pH 取任何一个值均可。
2.4 强助长器对菠菜叶茎冻干粉稀释液可溶性蛋
白含量的影响
如表 6 所示，用经过强的助长器浸泡 3 h 的 50
mmol/L Tris-Cl（pH8.0）缓冲液提取的菠菜冻干粉叶
蛋白明显比用未经助长器浸泡的 Tris-Cl 缓冲液提取
的叶蛋白含量高，提升幅度为 15%。
3 讨论
LPC 在饲料工业中具有重要的地位，因此 LPC
的提取研究一直以来得到了科研界的广泛关注。之
前对 LPC 提取的研究多集中在植物叶茎匀浆液中
LPC 凝聚沉淀的条件优化［19, 20］，较少关注如何提高
匀浆液中可溶性蛋白质的含量，从而增加叶蛋白的
提取效率。本研究采用湿法提取，研究纳米材料对
叶蛋白提取效率的影响。从试验结果可以发现，经
表 3 纳米高能片对新鲜菠菜叶茎蛋白提取率的影响
t检验，P<0.05，（x±s，n=3）
纳米高能片的浸泡时间（h） 蛋白提取率（mg/g 鲜重）
3 9.43±0.32*
0 7.85±0.66
2012年第4期 101罗芳等 ：纳米器件对叶蛋白提取的影响
过纳米器件浸泡的提取液，包括超纯水和各种盐溶
液，能够显著提高叶蛋白的可溶解性，平均提升幅
度为 10%-30%。
不同植物叶茎中所能提取的可溶性蛋白含量有
较大差异，这和植物的种类、所取叶茎的生长期和
部位、植物样品预处理的和叶茎磨碎的方法有一定
关系。前期研究表明，不同种植物的叶蛋白含量一
般在 10%-30% 之间［21, 22］。同时，同种植物在不同
生长期的叶蛋白含量也存在较大差别，在营养生长
表 4 L9 （33）正交试验湿提法提取水葫芦粉末
叶蛋白的结果 （x±s）
编号 A B C 蛋白提取率（mg/g 鲜重）
1
2
3
4
5
6
7
8
9
5.0
7.0
8.0
5.0
8.0
7.0
5.0
8.0
7.0
50
50
50
100
100
100
200
200
200
6
0
3
3
6
0
0
3
6
8.04
5.00
7.55
7.43
7.93
5.61
6.76
8.16
7.55
T1 22.23 20.59 23.52
T2 21.09 20.97 17.37
T3 20.71 22.47 23.14
X1 7.41 6.86 7.84
X2 7.03 6.99 5.79
X3 6.90 7.49 7.71
表 5 SPSS16.0对正交试验结果的方差分析
变异来源 平方和 df 均方 F F0.05 F0.01
pH 0.417 2 0.209 0.434 19.00 99.00
NaCl 浓度 0.659 2 0.329 0.686 19.00 99.00
浸泡时间 7.918 2 3.959 8.246 19.00 99.00
试验误差 0.960 2 0.480
总计 9.954 8
早期收割的植物样品含有的叶蛋白更高。以苜蓿为
例，其含水率和叶蛋白含量均随着植物原料生长期
的延长而下降，使得在同样提取条件下进行的同种
植物叶蛋白提取率也随之降低［23］。植物原料的破碎
也是提取叶蛋白的关键步骤之一，在相同含水量的
条件下，若增强对植物原料的粉碎程度，便可提高
细胞壁的破碎率、从细胞中释放出更多的蛋白质，
从而提高叶蛋白的提取率。工业上叶蛋白的大规模
生产，正在逐步实现机器打浆来替代切碎与碾磨两
道工序［24］。
在本研究中，所用的番茄叶茎为结实之后的叶
茎，其纤维素含量高，叶蛋白含量低，故提取出来
的可溶性蛋白含量低。研究所用菠菜叶茎为幼嫩叶
茎，叶蛋白含量高，经冻干研磨后的菠菜叶茎其细
胞壁被破碎得更充分，细胞内蛋白质大量释放到细
胞外，故其提取液中的可溶性叶蛋白含量很高。
从正交设计试验的结果可以看出，对水葫芦叶
蛋白提取效率影响最大的因素是提取液是否经过纳
米器件处理，这和提取菠菜叶茎叶蛋白的试验结果
一致。提取液经纳米器件浸泡 3 h 和 6 h 对水葫芦叶
蛋白提取结果影响差别不大，但在番茄叶叶蛋白提
取试验中，经纳米器件浸泡 3 h 的效果要明显好于
6 h，这可能是因为番茄叶中的可溶性蛋白含量少，
用 Bradford 法测定的蛋白含量结果靠近阈值，误差
较大。提取液 pH 对水葫芦叶蛋白提取的效率影响
不大，但也有报道表明中性或偏碱性是叶蛋白提取
的适宜 pH［25］。利用蛋白质等电点原理提取榨汁上
清液中的蛋白，通过调节的 pH 值和加温等方法使
蛋白质絮凝［26］。
提取液中高浓度 NaCl 溶液能提高水葫芦叶蛋白
的提取效率，但提升的幅度较小。水葫芦叶片和番
茄叶片作为农业废弃物，选用纳米器件提取叶蛋白，
不仅保护环境，也创造了新的经济价值，值得应用
和推广。
目前，纳米颗粒以其比表面积大所产生的新物
理特性得到了众多研究者的关注。纳米的光催化作
用在环保领域得到了初步的验证和应用［14］。前期的
试验也表明水被纳米器件处理后，通过测定核磁共
振半峰宽和化学位移的变化证明水分子簇变小，从
而增加了矿物质的溶解性［13, 14］。以上结果为研究利
表 6 强助长器对菠菜叶茎冻干粉稀释液上清中可溶性蛋
白含量的影响
纳米高能片的浸泡时间（h） 蛋白提取率（mg/g 干重）
3 314.68±5.24*
0 273.63±20.08
t检验，P<0.05，（x±s，n=4）
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第4期102
用纳米器件提取叶蛋白的机理提供了参考。另外值
得探讨的是，尽管有试验证明水分子簇在常温常压
下能够保持稳定，但是水分子簇大小的稳定仍然需
要极高的洁净条件来维持［27］，这需要进一步在纳米
器件提取叶蛋白的理论基础和可重复性上探索。
4 结论
用纳米器件处理过的提取液能提高蛋白质在提
取液中的溶解度，进而影响蛋白提取率和产量，提
升幅度为 10%-30%。试验结果表明，浸泡时长（纳
米器件浸泡在提取液中的时长）是最关键的已测因
素，植物样品的破碎程度也是影响叶蛋白提取率的
关键因素之一。纳米器件能显著提高植物可溶性叶
蛋白的提取效率，利用纳米器件提高工业化条件下
植物叶蛋白的生产效率是可行的。针对不同种类的
植物，在叶蛋白生产中其最佳提取工艺组合需要深
入研究。
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（责任编辑 马鑫）