全 文 ：·研究报告· 2011年第12期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
收稿日期 ：2011-05-31
基金项目 ：国家自然科学基金项目（30970055）
作者简介 ：李照熙，男，硕士研究生，研究方向 ：真核基因表达调控 ；E-mail:lizhaoxi2003@yahoo.com.cn
通讯作者 ：王天云，男，博士，硕士生导师，研究方向 ：真核基因表达调控 ；E-mail:wangtianyun@xxmu.edu.cn
盐藻酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活鉴定
李照熙1 杨瑞1 林艳2 杨保胜2 王天云2
（1新乡医学院生命科学技术系，新乡 453003 ；2新乡医学院生物化学与分子生物学教研室，新乡 453003）
摘 要: 构建用于杜氏盐藻核基质结合区结合蛋白（matrix attachment region binding protein，MBP）酵母双杂交试验的诱饵
载体，进行自激活及毒性验证。以含有盐藻 MBP 质粒为模板，经 PCR 扩增后连接 pMD18-T 载体，经测序鉴定正确后，EcoR
Nde 双酶切获得目的基因 MBP，克隆入经同样双酶切的酵母载体 pGBKT7，转化酵母菌株 AH109 及 Y187，检测其自激活以及毒性。
结果显示，成功扩增出盐藻 MBP 基因，重组质粒 pGBKT7-MBP 经酶切、测序表明序列正确，转化酵母菌株无自激活，无毒性。
关键词: 核基质结合区结合蛋白 酵母双杂交 诱饵载体 自激活
Construction of Dunaliella salina Two-hybrid System Bait Vector and
Detection of Its Self-activation
Li Zhaoxi1 Yang Rui1 Lin Yan2 Yang Baosheng2 Wang Tianyun2
（1Department of Life Science and Technology，Xinxiang Medical University，Xinxiang 453003 ；2Department of Biochemistry and Molecular
Biology，Xinxiang Medical University，Xinxiang 453003）
Abstract: It was to construct the yeast bait plasmid containing Dunaliella salina MBP（matrix attachment region binding protein）
gene for yeast two-hybrid system and verify the self-activation and toxicity. MBP gene was amplified from pGEX-6P-1-MBP plasmid and then
subcloned into pMD18-T vector. After verified with DNA sequencing，the MBP gene and pGBKT7 vector were digested with EcoR /Nde Ⅰ，
and then ligated and transformed into yeast AH109 and Y187. Further, the self-activation and toxicity were detected. MBP gene was successfully
amplified，the recombinant pGBKT7-MBP vector was correct by using restriction endonuclease analysis and DNA sequencing，and the
transformed yeast cells had no self-activation and toxicity.
Key words: MAR binding protein Yeast two-hybrid system Bait vector Self-activation
核基质（nuclear matrix）是将细胞核经核酸酶
和去垢剂处理后剩余的水不溶性纤维网络，核基质
结合区（matrix attachment region，MAR）是真核细
胞染色质上一段能与核基质特异性结合的区域。近
年研究发现，作为一种边界元件，MAR 具有提高外
源基因表达水平，降低转基因沉默现象等功能 [1-3]。
MAR 通过与其结合的蛋白相互作用行使其功能，因
此研究 MAR 结合蛋白对于阐明 MAR 的调控机制
具有重要意义。目前已发现的 MAR 结合蛋白，主
要有以下几种 ：核基质组分、核仁蛋白（nucleolar
protein）家族、组蛋白和叶绿体蛋白等 [4]，这些蛋白
质功能主要涉及基因表达调控和染色体包装等方面。
在本研究前期以杜氏盐藻（Dunaliella salina）
为研究对象，发现一种杜氏盐藻核基质结合区结合
蛋白（GenBank 登录号 DQ124215）[5]。为研究 MBP
蛋白的作用及其在 MAR 调控作用中的功能，构建
了含 MBP 基因的诱饵载体并进行毒性及自激活验
证，旨在为进一步利用酵母双杂交方法从杜氏盐藻
cDNA 文库筛选与 MBP 相互作用的蛋白质提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌 株 和 质 粒 酵 母 菌 株 AH109 及 Y187 购
自 Clonetech 公 司 ；E.coli DH5α 由 本 室 保 存 ；重
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组 pGEX-6P-1-MBP 载体由郑州大学河南省分子医
学重点实验室薛乐勋教授惠赠 ；pGBKT7 载体购自
Clonetech 公司。
1.1.2 试剂 各种限制性内切酶、pMD18-T 载体、
Ex Taq 酶、琼脂糖凝胶回收试剂盒、T4 DNA 连接酶
购自 TaKaRa 公司 ；酵母转化试剂盒、YPD 及各种
SD 缺陷培养基购自上海睿星公司 ；酵母质粒小提试
剂盒购自天根公司 ；其他试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 PCR 引物设计及扩增条件 根据 GenBank 杜
氏盐藻 MBP cDNA 序列设计一对引物。上游引物 ：
5-CGGCATATGATGGTTCTCGTCTTGTTCGAGAC-3 含
有 Nde Ⅰ酶切位点 ；下游引物 ：5-CGGGAATTCCTC
AGCGGCCTTCTTCTT-3 含有 EcoR Ⅰ酶切位点 ；引
物由上海英骏生物有限公司合成。
PCR 扩增条件：以 pGEX-6P-1-MBP 质粒为模板，
加入dNTP Mix、上下游引物、Ex Taq 酶、PCR Buffer等，
反应程序为 ：预变性 95℃ 5 min ；95℃ 1 min，59℃
1 min，72℃ 90 s，30 个循环 ；72℃延伸 10 min。
1.2.2 重组质粒 pMD18-T-MBP 载体构建 PCR 扩增
产物进行 1% 琼脂糖凝胶电泳，回收目的基因并与
pMD18-T 载体连接，CaCl2 法转化大肠杆菌 DH5α，
涂布含有 50 µg/mL 氨苄青霉素 LB 平板，37℃过夜
培养后挑取单克隆扩增并提取质粒，EcoR /Nde 双
酶切鉴定连接片段的插入方向以及片段大小，将阳
性克隆送上海生工测序。
1.2.3 诱 饵 重 组 质 粒 pGBKT7-MBP 的 构 建 及 鉴
定 EcoR /Nde 分 别 双 酶 切 重 组 质 粒 pMD18-T-
MBP 及 pGBKT7 空载体，电泳回收目的基因和载
体片段后用 T4 DNA 连接酶连接，产物转化大肠杆
菌 DH5α，卡那霉素抗性平板筛选单克隆。将经过
限制性内切酶分析，含正确插入片段的克隆命名为
pGBKT7-MBP。
1.2.4 重组质粒 pGBKT7-MBP 转化酿酒酵母菌株
AH109 及 Y187 醋酸锂法制备酵母菌感受态细胞，
按照 Clonetech 公司酵母手册操作。取转化产物按
1 10 和 1 100 倍稀释涂布 SD/-Trp 平板，30℃倒置
培养 72 h 至单菌落长出。从 SD/-Trp 平板挑取单菌
落于 SD/-Trp 液体培养基中，30℃震荡过夜培养，提
取酵母质粒并以质粒为模板进行 PCR 扩增鉴定 [6]。
1.2.5 重组质粒 pGBKT7-MBP 对酵母菌株 AH109 及
Y187 毒性检测 从平板挑取 1 个较大的单克隆菌落
（2-3 mm）接种于含有 50 mL SD/-Trp/Kan（20 µg/mL）
液体培养基的锥形瓶中，30℃过夜培养（16-24 h），
用紫外分光光度计检测 OD600 值。
1.2.6 重 组 质 粒 的 自 激 活 活 性 检 测 将 含 有
pGBKT7-MBP 重组质粒的酵母菌株 AH109 及 Y187
分别涂布 SD/-Trp、SD/-Trp/-His 及 SD/-Trp/-Ade 平板，
30℃倒置培养一周，观察平板菌落生长情况。
2 结果
2.1 盐藻MBP基因PCR扩增结果
PCR 产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果（图
1）显示，成功扩增出一条约 1 600 bp 的条带，将目
的基因克隆到 pMD18-T 载体上，经测序表明该基因
序列与预期结果一致 [7]。
李照熙等 ：盐藻酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活鉴定
1.PCR 产物 ；M. 分子量标准 DL2000
图 1 盐藻 MBP 基因 PCR 产物鉴定
2.2 重组质粒pMD18-T-MBP酶切鉴定
重组质粒经 Nde 单酶切获得约 4 300 bp 条带，
EcoR /Nde 双酶切获得 2 500 bp 和 1 600 bp 条带，
酶切结果如图 2 所示。
2.3 酵母穿梭载体pGBKT7-MBP酶切鉴定
穿梭质粒经 Nde 酶切获得约 9 000 bp 条带，
Hind Ⅲ单切获得 5 000、2 500 和 1 500 bp 条带，酶
切结果如图 3 所示。
2.4 PCR鉴定阳性酵母菌
用酵母小提试剂盒提取酵母质粒并作 PCR 鉴
定，PCR 产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳检测，结果（图
4）显示，在 1 600 bp 处存在明显条带。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011年第12期190
2.5 酵母穿梭质粒自激活检测
pGBKT7-MBP 质 粒 同 时 转 化 酵 母 菌 株 AH109
和 Y187，结果显示在 SD/-Trp 平板上正常生长，在
SD/-Trp/-His 及 SD/-Trp/-Ade 平板上不能生长，表明
重组穿梭质粒自身不能激活报告基因 His 及 Ade 的
表达，无自激活效应。
2.6 毒性测试
取过夜震荡培养的 AH109 及 Y187 转化菌，检
测 OD600 吸光度值。检测结果均大于 0.8，表明重组
质粒对酵母细胞无毒性。
3 讨论
MAR 结合蛋白是在研究 MAR 的过程中陆续发
现的一类蛋白质，此类蛋白质可以特异性地识别、
结合 MAR 序列，在真核基因表达调控、染色体结构
包装等方面发挥作用。在目前已知的 MAR 结合蛋白
中，大部分属于核基质组分，如拓扑异构酶Ⅱ、组
织特异性蛋白 SATB1 等 [8]，少部分属于核仁蛋白、
组蛋白、叶绿体蛋白，如组蛋白 H1。虽然对 MAR
结合蛋白的类型已有部分了解，但对其功能的研究
还有待进一步深入。
目前，关于 MAR 结合蛋白的研究主要集中于
动物、昆虫以及植物中的番茄、烟草等，而真核藻
类少有报道 [4,9]。高等动植物细胞存在器官分化问
题，不同的分化组织细胞基因表达的方式及种类不
同，MAR 序列及其结合蛋白也可能存在差别。因
此，以单细胞的真核生物研究 MAR 结合蛋白的调
控机制更具有特点及优势。其次，目前分离的 MAR
结合蛋白往往从某一试验材料分离单一结合蛋白进
而研究其功能，忽视了反式作用蛋白往往是由不同
蛋白质组成的一个蛋白质簇。已有的研究表明，反
式作用蛋白往往不止一种，它们只有相互作用时才
能发挥调控作用，如目前纯化和鉴定的转录作用因
子已有几百种。鉴于上述原因，我们提出了从单细
胞真核生物——杜氏盐藻（Dunalilla salina）分离纯
化 MAR 结合蛋白质簇进而研究 MAR 调控机制的设
想。杜氏盐藻（D. salina）是一种比较独特的单细胞
绿藻 ：无细胞壁，含有一个大的杯状叶绿体能进行
光合作用，具有鞭毛，能游动 ；可在高盐培养液中
生长，抗逆性极佳，是一种较为理想的抗逆境生存
的生物。我们在前期研究中，分离出 3 个具备典型
MAR 特征的 DNA 序列，并证实在转基因盐藻中分
离的 MAR 能明显提高外源基因的表达（GenBank 登
录号 AY583586、AY623056 和 AY629412）[10,11]。用
分离的 MAR 作为探针，筛选构建的盐藻 λgt11 表
达 文 库， 筛 选 出 1 个 MBP 基 因（GenBank 登 录 号
DQ124215，AAZ31075），原核表达及其功能研究证
实该蛋白能与 MAR 结合，蛋白定位于细胞核。
酵母双杂交是一种灵敏度较高的研究蛋白质相
互作用的技术，最早由 Fields 等 [12] 在研究真核基因
转录调控中建立，目前应用该技术已经发现了大量
的蛋白质相互作用 [13-16]。其基本原理是通过两个杂
交蛋白在酵母细胞中对报告基因的转录激活来探测
蛋白 - 蛋白的相互作用 [17]。本试验从质粒 pGEX-6P-
1.pMD18-T-MBP 质粒 ；2.Nde 单酶切 ；3.EcoR /Nde 双
酶切 ；M. 分子量标准 DL5000
图 2 重组质粒 pMD18-T-MBP 酶切鉴定
1.pGBKT7-MBP 质粒 ；2,3. 分别为 Nde I、Hind Ⅲ
单酶切 ；M. 分子量标准 1 kb
图 3 穿梭载体 pGBKT7-MBP 酶切鉴定
1-4.PCR 产物 ；5. 阳性对照 ；M. 分子量标准 DL2000
图 4 PCR 鉴定阳性酵母菌
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1-MBP 扩增得到 MBP 基因全长并将其与含有 DNA
结合域的 pGBKT7 载体重组，通过对重组载体酶切
鉴定及基因序列测定证实 MBP 基因读码框正确无
误。诱饵质粒转化酵母菌通过 SD/-Trp 缺陷型培养
基筛选阳性克隆并用 PCR 进一步验证，结果证实重
组质粒成功转化酵母菌，且无毒性。在酵母双杂交
系统中，诱饵载体本身不能对报告基因有激活作用，
否则在 cDNA 文库筛选时会出现假阳性。本试验将
盐藻 MBP 蛋白基因与含有 DNA 结合域的 pGBKT7
载体重组，通过基因序列测定保证基因的完整性、
自激活试验及毒性测试试验验证载体能否行使其功
能。通过以上试验，成功构建了含有 MBP 蛋白基
因的 pGBKT7 融合质粒，为从盐藻 cDNA 文库筛选
MBP 相互作用蛋白提供了基础。
在构建诱饵载体 pGBKT7-MBP 的基础上，成功
转化酵母菌株 AH109 及 Y187，将转化了诱饵质粒
的菌落分别涂布 SD/-Trp、SD/-Trp/-His 及 SD/-Trp/-
Ade 平板，结果显示仅在 SD/-Trp 平板有菌落生长，
而在其余营养缺陷型平板无菌落生长，此结果说明
诱饵质粒无激活报告基因 His 及 Ade 表达，提示诱
饵质粒不存在自激活作用。诱饵质粒转化酵母菌株
AH109 及 Y187 后，涂布 SD/-Trp 平板，经提取酵母
质粒，PCR 鉴定结果显示扩增出目的条带，表明转
化成功。在毒性试验中，挑取单菌落于 SD/-Trp 液
体培养基，经过夜摇菌后检测 OD600 ＞ 0.8，提示诱
饵载体对酵母菌株无毒性。
4 结论
本试验将杜氏盐藻 MBP 基因克隆入酵母诱饵
载体 pGBKT7 中，结果证实诱饵质粒对酵母菌株无
毒性，同时也不能激活报告基因表达，符合筛选盐
藻 cDNA 文库的要求。我们已将此载体应用于后续
试验，与 MBP 相互作用蛋白的筛选及分析工作正在
进行中。
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（责任编辑 马鑫）
李照熙等 ：盐藻酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活鉴定