全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第12期
无论是在人为条件下还是在湖泊、河流等自然
环境中，要使人工筛选菌发挥一定的生态功能，一
个重要前提是微生物能够生长和繁殖，达到一定的
数量或生物量。在生产实践中接种种子群体处于生
命力最旺盛、生理状态一致、细胞数量较大的对数
生长期中后期的种子可以促进微生物在新的环境下
快速繁殖，短时间内达到较大数量。因此培养出高
浓度的强壮而整齐的降解有机氮细菌种子液是成功
收稿日期 ： 2013-05-16
基金项目 ：河南省科技攻关重点项目（092102310069）
作者简介 ：郭端强，男，讲师，硕士，研究方向 ：环境微生物学 ；E-mail ：gdqlyh@hncj.edu.cn
通讯作者 ：单林娜，女，教授，博士，研究方向 ：环境生物技术 ；E-mail ：lnashan@hncj.edu.cn
响应面法优化降解有机氮细菌 N24 的种子培养基
郭端强1 李轶徽2 陈艳艳1 单林娜1
（1. 河南城建学院生命科学与工程学院，平顶山 467036 ；2. 平顶山市第一高级中学数学教研组，平顶山 467000）
摘 要 ： 优化降解有机氮细菌 N24 的种子培养基来提高发酵液对数期末期的细菌浓度。首先用 Plackett-Burman 设计对影响
降解有机氮细菌 N24 菌体浓度的因素进行评估并筛选出具有显著效应的 3 个因素蛋白胨、K2HPO4 和 FeSO4·7H2O，接着用最陡爬
坡试验法逼近以上 3 个因素的最大响应区域后，采用 Box-Behnken 设计以及响应面分析法确定 3 个因素的最优水平。优化后的种
子培养基 ：蛋白胨 6.55 g，K2HPO4 0.66 g，FeSO4·7H2O 0.024 g，NaC1 0.3g，MgSO4 ·7H2O 0.6 g，蒸馏水 1 000 mL，初始 pH 值 7.2。
优化后发酵液对数期末期细菌浓度达到 2.4440×1010 CFU/mL，比优化前 6.2467×109 CFU/mL 提高了 2.91 倍。Plackett-Burman 设计
和响应面相结合的试验方法优化了菌株 N24 的种子培养基，可大大提高菌株 N24 的细菌浓度，有望用于大规模生产。
关键词 ： 降解有机氮细菌 响应面法 优化 种子培养基
Optimization of Seed Culture Medium of Aerobic Denitrification
Bacteria Bacillus flexus N24 Through Response Surface Methodology
Guo Duanqiang1 Li Yihui2 Chen Yanyan1 Shan Linna1
（1. College of Life Science and Engineering，Henan University of Urban Construction，Pingdingshan 467036 ；2. Mathematics Teaching and
Research Group，Pingdingshan NO.1 Senior High School，Pingdingshan 467000）
Abstract: The seed culture medium was optimized to improve the cell density of strain N24. Firstly, Plackett-Burman design was used to
investigate the effects of different factors on cell density in the seed culture medium, three statistically significant factors are ：peptone, K2HPO4
and FeSO4·7H2O, and then a steepest ascent procedure were employed to define optimal response region for these three factors. Finally, Box-
Behnken design and RSM were employed to define the optimal level of these three factors. The optimal seed culture medium is ：peptone
6.55 g, K2HPO4 0.66 g, FeSO4·7H2O 0.024 g, NaC1 0.3g, MgSO4 ·7H2O 0.6 g, distilled water 1 000 mL, initial pH value 7.2. The bacteria
concentration reached 2.4440×1010 CFU/mL at the telophase of logarithmic phase after optimization, which increased 291% than before. The cell
density of strain N24 can be increased by the optimized seed culture medium through Plackett-Burman design combined with response surface
analysis, which can be used industrially.
Key words: Aerobic denitrifier Response surface methodology Optimization Seed culture medium
除去水体中有机氮的关键因素之一。
在前期研究的基础上，本试验采用响应面法
（RSM）优化了降解有机氮细菌 N24 的种子培养基，
运用 Plackett-Burman 设计［1，2］、最陡爬坡试验［3］以
及 Box-Behnken 设 计［4-6］ 和 RSM 法［7，8］ 优 化 得 到
降解有机氮细菌 N24 最适种子培养基，以期为河流、
湖泊等开放水体的投放菌剂试验提供生命力旺盛的
种子液。所有试验设计和结果的统计分析采用 SAS
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第12期168
9.1 统计软件辅助完成。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种 河南城建学院生命科学与工程学院微
生物实验室保藏菌种 Bacillus flexus N24。
1.1.2 培养基 基础培养基 ：牛肉膏 3 g，蛋白胨 10
g，NaC1 5 g，琼脂 20 g，蒸馏水 1 000 mL，pH7.2。
以 2%（质量分数）的琼脂作平板活化、计数和斜面
培养支持物。Plackett-Burman 试验和 RSM 试验种子
培养基（g/L）：按照试验设计配制培养基。所有培
养基 1×105 Pa 灭菌 20 min。
1.2 方法
1.2.1 培养条件 将平板上菌落接种至试管斜面上，
30℃恒温培养 24 h，取灭菌蒸馏水加入到斜面培养
物上，用接种环刮下菌体，转入装有玻璃珠的无菌
三角瓶中，打碎菌体团块。按照 10% 的接种量接入
装有 50 mL 种子培养基的 250 mL 三角瓶中，30℃，
120 r/min 振荡培养至 23 h。
1.2.2 细菌浓度测定方法 采用平板菌落计数法测
定 23 h 发酵液中细菌浓度［9］。
2 结果
2.1 Plackett-Burman设计筛选影响细菌浓度因素
采用 Plackett-Burman 设计从 8 个影响因素中筛
选出具有显著影响的因素。每个因素取两个水平 ：
即高水平和低水平，如表 1 和表 2 所示。
表 1 Plackett-Burman 试验设计各因素水平
因素
名称 单位
水平
代码 低（-1） （高 +1）
X1 虚拟项 — — —
X2 蛋白胨 g/L 5.00 7.00
X3 NaC1 g/L 0.25 0.35
X4 虚拟项 — — —
X5 K2HPO4 g/L 0.50 0.70
X6 MgSO4 ·7H2O g/L 0.50 0.70
X7 虚拟项 — — —
X8 FeSO4·7H2O g/L 0.01 0.03
针对以上结果采用 SAS 9.1 软件进行分析，结
果见表 3。得到一次拟合回归方程 ：
Y = 13.65555 - 0.727783*X1 + 4.322217*X2 +
0.34445*X3 - 1.74445*X4 + 3.30555*X5 - 0.188917*X6 -
0.777783*X7 + 2.777783*X8。
从表 3 可以发现，蛋白胨（X2）、K2HPO4（X5）、
FeSO4·7H2O（X8）这 3 个因素的可信度都在 90％以
上，是影响最为显著的因素，因此对这 3 个因素进
行下一步的优化。
表 3 Plackett-Burman 各因素的主效应分析结果
因素
名称 单位 t 值 Pr > |t| 重要性
代码
X1 虚拟项 — -0.980 19 0.3992 74 6
X2 蛋白胨 g/L 5.8212 38 0.0100 95 1
X3 NaC1 g/L 0.4639 11 0.6743 00 7
X4 虚拟项 — -2.349 46 0.1003 55 4
X5 K2HPO4 g/L 4.4519 73 0.0210 89 2
X6 MgSO4 ·7H2O g/L -0.254 44 0.8156 02 8
X7 虚拟项 — -1.047 53 0.3718 11 5
X8 FeSO4·7H2O g/L 3.7411 68 0.0333 18 3
R2 = 96.18% ；R2Adj = 86.00% ；RMSE = 2.572064 ；CV = 18.8353
2.2 最陡爬坡试验设计及其结果
最陡爬坡试验的方向可由上述方程及回归分析
确定，X2 因素（蛋白胨）、 X5 因素（K2HPO4）和 X8
因素（FeSO4·7H2O）在 90% 的概率水平上差异显著，
且系数都为正。这说明适当增加蛋白胨、K2HPO4 和
FeSO4·7H2O 的用量，对细菌浓度的提高有促进作用，
其他因素选用 Plackett-Burman 试验中“1”和“-1”
水平的平均值。本试验采用 Plackett-Burman 法的 1/4
步长进行试验设计，试验设计及结果见表 4，从表 4
表 2 Plackett-Burman 试验设计结果
试验号 （X1） X2 X3 （X4） X5 X6 （X7） X8
细菌浓度
（109 CFU/mL）
1 1 -1 1 -1 -1 -1 1 1 8.4667
2 1 1 -1 1 -1 -1 -1 1 14.6667
3 -1 1 1 -1 1 -1 -1 -1 22.3667
4 1 -1 1 1 -1 1 -1 -1 3.8333
5 1 1 -1 1 1 -1 1 -1 16.0333
6 1 1 1 -1 1 1 -1 1 25.9333
7 -1 1 1 1 -1 1 1 -1 8.1333
8 -1 -1 1 1 1 -1 1 1 15.2667
9 -1 -1 -1 1 1 1 -1 1 13.5333
10 1 -1 -1 -1 1 1 1 -1 8.6333
11 -1 1 -1 -1 -1 1 1 1 20.7333
12 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 6.2667
2013年第12期 169郭端强等 ：响应面法优化降解有机氮细菌 N24 的种子培养基
中可以看出，第 4 组试验中细菌浓度最高，这说明
最优点在第 4 组试验附近，故选其作为中心点，蛋
白胨、K2HPO4 和 FeSO4·7H2O 取值分别为 6.5 g/L、0.65
g/L 和 0.025 g/L，进行下一步优化。
表 4 最陡爬坡试验设计及结果
试验号
X2 蛋白胨
（g/L）
X5 K2HPO4
（g/L）
X8 FeSO4·7H2O
（g/L）
细菌浓度
（1010 CFU/mL）
1 5.0 0.50 0.010 1.8567
2 5.5 0.55 0.015 2.0467
3 6.0 0.60 0.020 2.2333
4 6.5 0.65 0.025 2.4700
5 7.0 0.70 0.030 2.2033
6 7.5 0.75 0.035 1.9667
7 8.0 0.80 0.040 1.7167
2.3 响应面设计确定显著影响因子的最佳值
根据最陡爬坡试验确定的试验因素中心点，设
计的响应面因素及水平如表 5 所示，本文采用 Box-
Behnken 设计，试验结果如表 6 所示。
表 5 响应面设计的因素和水平
编码 因素
水平
-1 0 +1
X2 蛋白胨（g/L） 6.00 6.50 7.00
X5 K2HPO4（g/L） 0.60 0.65 0.70
X8 FeSO4·7H2O（g/L） 0.02 0.025 0.03
表 6 Box-Behnken 试验设计及结果
试验号 X2 X5 X8
Y 细菌浓度（1010 CFU/mL）
试测值 拟合值
1 -1 -1 0 2.200 0 2.206 0
2 -1 1 0 2.3033 2.279 0
3 1 -1 0 2.2633 2.287 0
4 1 1 0 2.3433 2.337 0
5 0 -1 -1 2.3733 2.352 0
6 0 -1 1 2.3333 2.324 0
7 0 1 -1 2.4167 2.426 0
8 0 1 1 2.3533 2.374 0
9 -1 0 -1 2.270 0 2.285 0
10 1 0 -1 2.3033 2.300 0
11 -1 0 1 2.1867 2.190 0
12 1 0 1 2.330 0 2.315 0
13 0 0 0 2.510 0 2.486 0
14 0 0 0 2.4867 2.486 0
15 0 0 0 2.460 0 2.486 0
利用软件 SAS9.1 对试验结果进行分析，得到二
次线性回归方程如下 ：
Y = 2.485567 + 0.034988*X2 + 0.030838*X5 -
0.02*X8 - 0.152371*X2*X2 - 0.005825*X2*X5 + 0.0275
*X2*X8 - 0.055721*X5*X5 - 0.00585*X5*X8 - 0.060696*
X8*X8。
回归方程的方差分析及模型可信度分析结果见
表 7。模型（P< 0.01）具有极显著性，失拟项（P
＝ 0.431107> 0.05）差异不显著，因此模型选择正确。
模型校正后的 R2Adj ＝ 91.31%，说明模型可以解释
91.31% 试验结果的变化，表明方程拟合度良好，试
验误差较小。这主要是因为未计入方程的变量与回
归方程的变量之间总会有交互作用，由于未计入方
程的变量较多，故交互作用的累积对回归方程造成
一定影响 ；另一方面是由于试验的过程中总会有不
可避免的随机误差。CV（Y 的变异系数）表示试验
的精确度，CV 值越低，试验的可靠性越高，本试验
中 CV = 1.20673，较低，说明试验操作可信。因此
可用该模型对降解有机氮细菌的细菌浓度进行分析
预测。
由表 7 可以看出，在 α = 0.05 的显著水平上，
X2、X5、X2
2、X5
5、X8
8
是显著的，X2*X8 有一定的交
互作用，但不显著。通过 SAS 9.1 软件对上述回归
方程绘制响应曲面图，考察所拟合响应曲面的形状，
分 析 蛋 白 胨，K2HPO4 和 FeSO4·7H2O 对 菌 株 N24
生长繁殖的影响。响应曲面立体分析图及相应等高
线图，见图 1- 图 6。等高线图的圆心越接近椭圆表
示交互作用越强，等高线的稀疏表示响应面图形的
平陡。
通过岭脊分析后，得出回归模型存在最大值点，
细菌浓度 Y 的最大估计值为 2.4931×1010 CFU/mL，
各因素取值分别为：蛋白胨 6.55 g/L，K2HPO4 0.66 g/L，
FeSO4·7H2O 0.024 g/L，在以上优化条件下进行 5 次
验证试验，得到试验值为 2.444×1010 CFU/mL，说明
该试验选用的模型是合理的，模型验证及与优化前
的培养基比较见表 8。
3 讨论
目 前 国 内 外 有 关 有 机 氮 的 氨 化 过 程 研 究 相
对 较 少［10］， 未 见 到 进 行 氨 化 细 菌 种 子 培 养 基 优
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第12期170
表 7 回归方程的方差分析
方差来源 自由度 总偏差平方和 平均偏差平方和 F 值 P 值 >F 显著性
X2 1 0.009793 0.009793 12.25866 0.017262 *
X5 1 0.007608 0.007608 9.523039 0.027285 *
X8 1 0.003200 0.003200 4.005689 0.101755
X2*X2 1 0.085724 0.085724 107.3072 0.000144 **
X2*X5 1 0.000136 0.000136 0.169894 0.697282
X2*X8 1 0.003025 0.003025 3.786628 0.109239
X5*X5 1 0.011464 0.011464 14.35028 0.012782 *
X5*X8 1 0.000137 0.000137 0.171356 0.696068
X8*X8 1 0.013602 0.013602 17.02719 0.009117 **
模型 9 0.124655 0.013851 17.33783 0.002925 **
（一次项） 3 0.020601 0.006867 8.595796 0.020355 *
（二次项） 3 0.100757 0.033586 42.04174 0.00057 **
（交叉乘积项） 3 0.003298 0.001099 1.375959 0.351426
误差项 5 0.003994 0.000799
（失拟项） 3 0.002742 0.000914 1.460358 0.431107
（纯误差） 2 0.001252 0.000626
所有项 14 0.128649
R2 = 96.90% ；R2Adj = 91.31% ；RMSE = 0.028264 ；CV = 1.20673
** 差异极显著，P < 0.01 ；* 差异显著，P < 0.05
2.45
2.25
Y
0.9 0.90.9
0.9
X5
Fixed levels: x8=0
X2
X2
X
5
Fixed levels: x8=0
0.9
0.6
0.3
0
0.90.60.30
0.3
0.3
0.6
0.6
0.9
0.9
图 1 Y = f（x2、x5）响应面立体分析图 图 2 Y = f（x2、x5）等高图
2.45
2.2
Y
0.9 0.90.9
0.9
X5
Fixed levels: x5=0
X2
X2
X
5
Fixed levels: x5=0
0.9
0.6
0.3
0
0.90.60.30
0.3
0.3
0.6
0.6
0.9
0.9
图 3 Y = f（x2、x8）响应面立体分析图 图 4 Y = f（x2、x8）等高图
2013年第12期 171郭端强等 ：响应面法优化降解有机氮细菌 N24 的种子培养基
2.49
2.34
Y
0.9
0.9
0.9 0.9X5
Fixed levels: x2=0
X5
X5
X
5
Fixed levels: x2=0
0.9
0.6
0.3
0
0.90.60.30
0.3
0.3
0.6
0.6
0.9
0.9
图 5 Y = f（x5、x8）响应面立体分析图 图 6 Y = f（x5、x8）等高图
表 8 模型验证结果
对比 1 2 3 4 5 平均细菌浓度（109 CFU/mL） 优化后提高率（%）
优化前 5.400 0 6.066 7 6.566 7 6.333 3 6.866 7 6.246 7
优化后 23.366 7 24.966 7 24.4 24.933 3 24.533 3 24.440 291
化 的 报 道。 在 微 生 物 生 长 繁 殖 过 程 中， 需 要 碳
源、 氮 源、 能 源、 无 机 盐、 生 长 因 子 等 营 养 元
素，不同的菌株对环境条件及营养条件的要求不
同，因此，有必要对所得的菌株进行培养基的优
化试验。目前微生物发酵过程优化常用的方法有
单因子试验设计、正交试验设计和响应面法试验
设计。其中单因子试验设计主要讨论一种因素的
影响，不能考查因素间的交互作用，不能总是获
得最佳的优化条件 ；正交试验设计可以合理安排
试验，同时考虑多个因素，寻找最佳因素水平组
合，但是无法找到因素和响应值的回归方程，无法
找到因素的最佳组合和响应值的最优值 ；响应面
法（Response surface methodology，RSM）试验次数少、
周期短，能够研究几个因素间交互作用，求得的因
素与响应值间二次回归方程精确度高，是优化工艺
条件、降低生产成本、解决科学研究和生产过程中
实际问题的一种有效办法。目前，响应面法已广泛
应用于生物、食品、农业、建筑等领域［11，12］。
本试验首次对降解有机氮细菌 N24 的种子培养
基进行了研究，利用响应面法得出降解有机氮细菌
N24 最适种子培养基为 ：蛋白胨 6.55 g，K2HPO40.66
g，FeSO4·7H2O 0.024 g，NaC1 0.3g，MgSO4 ·7H2O
0.6 g，蒸馏水 1 000 mL，初始 pH 值 7.2。优化后发
酵液对数期末期细菌浓度达到 2.444×1010 CFU/mL，
比优化前 6.2467×109 CFU/mL 提高了 2.91 倍。说明
Plackett-Burman 设计、最陡爬坡试验与响应面分析
方法（RSM）相结合可以快速、有效地从众多影响
细菌浓度的因素中筛选出比较重要的影响因素并得
到重要影响因素的最优水平，优化结果与实际发酵
情况吻合较好，但是研究仅限于摇瓶发酵，仍需上
罐分批发酵进一步验证。
目前，有关本课题降解有机氮细菌的研究还处
在实验室阶段。下一步将采用响应面等优化方法，
进行菌剂剂型选择及水体现场投放试验，并将本实
验室筛选得到的降解可溶性有机氮细菌、反硝化细
菌和溶藻细菌等微生物制成水质净化复合菌剂，进
行水体的现场投菌试验，把它们应用到水体净化工
程实践当中。
4 结论
经 Plackett-Burman 设计得到影响降解有机氮
细菌 N24 对数期末期细菌浓度的 3 个重要因素 ：蛋
白 胨，K2HPO4 和 FeSO4·7H2O ；Box-Behnken 设 计
进一步优化后 N24 种子培养基为 ：蛋白胨 6.55 g，
K2HPO4 0.66 g，FeSO4·7H2O 0.024 g，NaC1 0.3 g，
MgSO4 ·7H2O 0.6 g，蒸馏水 1 000 mL，初始 pH 值 7.2。
优化后菌体浓度达到 2.444 0×1010 CFU/mL，比优化
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第12期172
前提高 2.91 倍。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）