全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第9期
收稿日期 : 2012-02-22
基金项目 : 国家自然科学基金项目（81070614）
作者简介 : 王小莉 , 女 , 助教 , 研究方向 : 人胚胎干细胞的诱导分化 ; E-mail: xiaolitina@126.com
通讯作者 : 李东升 , 男 , 博士 , 教授 , 研究方向 : 人胚胎干细胞 ; E-mail: dsli1698@yahoo.com
Pdx1（Pancreatic duodenum homeobox protein-1）
在胰腺发育过程中起决定性作用［1，2］，敲除 Pdx1 基
因会导致小鼠胰腺组织缺失，在发育成熟后，Pdx1
只在 β 细胞和 20% 的 δ 细胞中表达，并且控制胰岛
素的表达。在人体中，Pdx1 基因突变可导致胰腺组
织发育不良［3］，主要是因为 Pdx1 可以调节很多与
维持 β 细胞正常功能相关的基因的表达［4］。已有大
量的研究证实 Pdx1 在大鼠肝干细胞向胰腺内分泌
细胞转化分化的过程中可激活大量胰腺特异转录因
子的表达［5］，但对 Pdx1 蛋白在人胚胎干细胞向胰
岛分泌细胞分化过程中作用机制方面的研究还未见
报道。
不含穿透肽的蛋白不能直接穿过细胞膜进入细
胞内，但 hPdx1 蛋白中含有内源性的蛋白转导域可
不需外源穿透肽的介导就能进入细胞内［6］。目前在
体外利用 Pdx1 诱导转化分化生成胰岛分泌细胞的研
究报道很多［5，7］，但大多是用质粒、腺病毒、慢病
毒等转染的方式将外源的 Pdx1 基因转入细胞内，用
这些方法得到的胰岛分泌细胞存在严重的安全隐患
因而不能用于临床治疗，利用穿透蛋白诱导细胞分
化比较安全。
本研究通过构建 hPdx1 和△-hPdx1 蛋白表达系
统，以△-hPdx1 蛋白作为对照，旨在为研究 hPdx1
蛋白在诱导人胚胎干细胞向胰岛分泌细胞分化过程
hPdx1和△-hPdx1蛋白表达系统的构建及功能鉴定
王小莉 梁清乐 李东升
（湖北医药学院附属太和医院 胚胎干细胞研究湖北省重点实验室，十堰 442000）
摘 要： 经鉴定成功构建了 hPdx1和△-hPdx1蛋白表达系统，IPTG诱导蛋白表达后Western blot检测在 37.2-52.3 kD之间出
现了与两种目的蛋白理论分子量相符的蛋白条带。诱导后破碎菌体上清液，经分离纯化最终得到的目的蛋白纯度可达到 95%以上。
纯化的蛋白加入人胚胎干细胞培养基中 1 h后通过细胞免疫荧光检测发现，hPdx1蛋白可进入细胞而△-hPdx1不能进入细胞，表明
表达得到的蛋白具有生物活性。
关键词： 构建 蛋白表达 鉴定 hPdx1 △-hPdx1
Construction the Expression System for Human Pdx1 Protein and
△-hPdx1 Protein and Identification the Function of the Proteins
Wang Xiaoli Liang Qingle Li Dongsheng
（Key Laboratory of Embryonic Stem Cell Research of Hubei Province，Department of Taihe Hospital，
Hubei University of Medicine，Shiyan 442000）
Abstract: hPdx1 and △-hPdx1 protein expression systems were identified and successfully constructed. The proteins expression were
induced by IPTG and detected by Western blot，the result showed that the molecular weight of the proteins were between 37.2-52.3 kD which
agreed with theories. The target proteins in the supernatant were purified and the purity could get more than 95%. The purified proteins were
added into the human stem cell culture medium，respectively. The proteins were detected by the cell immunofluorescence after 1 hour，the
result showed that the hPdx1 protein could enter the cells but the △-hPdx1 can’t，the proteins had bioactivity.
Key words: Construction Expression Identification hPdx1 △-hPdx1
2012年第9期 121王小莉等 ：hPdx1 和△-hPdx1 蛋白表达系统的构建及功能鉴定
中的作用机制奠定基础。通过分离纯化得到目的蛋
白，旨在为人胚胎干细胞向胰岛分泌细胞分化的临
床运用研究提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种与载体 表达载体 pET-16b 及表达宿主
菌 E. coli BL21（DE3）购自 Invitrogen 公司。
1.1.2 工具酶和主要的试剂 连接酶、Taq DNA 聚
合酶，NEB 公司 ；小量质粒提取试剂盒和 BamH I、
Nde I 酶，TaKaRa 公司 ；DNA ladder，北京华夏远
洋科技有限公司 ；Marker Ⅳ，天根生化技术有限公
司 ；胶回收试剂盒，Ni-NTA 填料，Qiagen 公司 ；蛋
白胨、酵母粉，OXOID 公司 ；IPTG，咪唑，丙烯酰
胺，N，N’-甲叉双丙烯酰胺，TEMED，BBI 公司。
DMEM/F-12、血清替代品（SR）、谷氨酰胺、β-巯
基乙醇、非必需氨基酸、碱性成纤维细胞生长因子
（bFGF），GIBCO。
1.1.3 主要仪器 PCR 仪，Eppendof 公司 ；超声波
破碎仪（VC×600），Sonics & Materials 公司 ；凝胶
成像系统和 Bio-Rad 小型垂直电泳槽及电泳仪，Bio-
Rad 公司。
1.1.4 基因序列 hPdx1 基因序列由 NCBI-GenBank
中 查 得，△-hPdx1 序 列 是 hPdx1 序 列 中 去 除 第
188-203 位的氨基酸序列后所剩的序列，这两个序
列根据大肠杆菌密码子的偏爱性做适当调整，由上
海生工生物工程技术服务有限公司合成并克隆至
pBluescrip SKII（+）载体上保存。
1.1.5 培养基 人胚胎干细胞培养基 ：DMEM/F-12
添加 20% 血清替代品（SR）、1 mmol/L 谷氨酰胺、0.1
mmol/L β-巯基乙醇，1% 非必需氨基酸，4 ng/mL 碱
性成纤维细胞生长因子（bFGF）。
人胚胎干细胞条件培养基 ：将不含 bFGF 的人
胚胎干细胞培养基加到铺有已用丝裂霉素处理好的
MEF 的 T75 培养瓶中 24 h 后收集的培养基即为条件
培养基。
1.2 方法
1.2.1 重组质粒构建及鉴定 采用基因工程常规
方法将含有目的基因的克隆载体 pBluescript SKII
（+）-Pdx1，pBluescript SKII（+）-Mut-Pdx1 和 表 达
载体pET-16b分别经过BamH I和Nde I酶切，胶回收，
T4 DNA 连接酶连接，转入大肠杆菌 BL21（DE3）中
并筛选重组子。重组质粒经双酶切、PCR及测序鉴定。
1.2.2 蛋白诱导表达 挑取经鉴定正确的重组子接
种至 5 mL 含 50 mg/L Amp 的 LB 培养基中，37℃，
250 r/min 培养过夜后，再按 1% 接种量转接至 100
mL含50 mg/L Amp的LB培养基的500 mL锥形瓶中，
37℃ 250 r/min，培养至 OD600 为 0.8 时，加 IPTG 至
终浓度 0.5 mmol/L，18℃诱导 18-20 h。
1.2.3 Western blot 取 1 mL 诱导后的菌液离心得菌
体，加入50 μL 1×PBS重悬，再加50 μL 2×SDS-PAGE
上样缓冲液等体积混合，沸水浴 5 min，取 15 μL 进
行SDS-PAGE电泳后转膜，PBST漂洗封闭液封闭1 h，
加入按 1 1 000 稀释的鼠抗 Pdx1 一抗，混匀 37℃孵
育 2 h，PBS 洗 3 遍，再加入按 1 5 000 稀释的碱性
磷酸酶标记的山羊抗小鼠二抗，混匀 37℃孵育 1 h，
PBS 洗 3 次，最后采用 AP-NBT 显色法鉴定。
1.2.4 蛋白的分离纯化 将诱导后的菌液离心每克
湿菌体重悬于 3 mL 5 mmol/L 咪唑缓冲液中，加入溶
菌酶至终浓度为 20 000 U/mL，37℃放置 30 min 后超
声破碎 30 s，4℃ 10 000 r/min 离心 10 min 收集上清
液。将上清液加入预先用 5 mmol/L 咪唑缓冲液平衡
的 Ni-NTA 层析柱内，分别用 50、100、200、300 和
400 mmol/L 咪唑缓冲液洗脱，并收集洗脱液用 SDS-
PAGE 电泳检测目的蛋白分离纯化效果，将收集较
纯的洗脱液装入透析袋在 DPBS 溶液中透析过夜，
透析后蛋白冷冻干燥保存于 -80℃。
1.2.5 细胞培养 人胚胎干细胞系 H1 细胞由本实
验室保存，细胞复苏后接种在 Matrigel 上添加人胚
胎干细胞条件培养基放入 37℃，5% CO2 的培养箱中
培养。
1.2.6 免疫荧光检测 4% 多聚甲醛固定人胚胎干细
胞 10 min，PBS 洗 3 遍加入 0.5% Triton 穿孔 15 min，
PBS 洗 3 遍后加入 1% BSA 封闭 30 min，再加入按
1 100 稀释的鼠抗 Pdx1，混匀后 37℃孵育 2 h，孵
育结束后 PBS 洗 3 遍，加入按 1 100 稀释的 FITC
标记的山羊抗小鼠 IgG，混匀后 37℃孵育 1 h，PBS
洗 3 次，用 5 μg/mL DAPI 染色 2 min，加入抗淬灭
封片剂 ［2.5% DABCO（W/V）、50 mmol/L Tris（pH8.0）、
90% 甘油］封片后荧光显微镜下观察。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第9期122
2 结果
2.1 重组质粒构建及鉴定
按 1.2.1 的方法构建人基因组序列编码的 hPdx1
和△-hPdx1 的重组蛋白表达系统。经酶切、连接的
重组质粒转入大肠杆菌 BL21（DE3）感受态细胞
中，在含 50 mg/L Amp 的 LB 抗性平板上筛选出阳性
克隆，并通过酶切、PCR 鉴定。理论上，重组质粒
经 BamH I/Nde I 双酶切应得到约为 864 bp 的 hPdx1
基因片段和 816 bp 的△-hPdx1 基因片段，实际酶切
后电泳结果（图 1-a）显示片段大小与理论相符。采
用 T7 通用引物进行 PCR 鉴定，扩增后的产物经电
泳检测在约 1 000 bp 的位置可见条带如图 1-b 所示，
这与理论 PCR 产物大小一致。酶切和 PCR 的鉴定
结果表明，hPdx1 和△-hPdx1 片段已插入到 pET-16b
的多克隆位点。将鉴定结果正确的质粒送生工生物
工程（上海）有限公司测序，通过比对构建的质粒
序列完全正确。
的方法进行分离纯化，并收集每一步的洗脱液进行
SDS-PAGE 电泳。蛋白经梯度洗脱后电泳结果（图
3）显示，用 50 mmol/L 咪唑缓冲液洗脱可除去大部
分非目的蛋白，再经 100、200 和 300 mmol/L 咪唑
缓冲液洗脱可基本去除全部的非目的蛋白，用 400
mmol/L 咪唑缓冲液洗脱下的目的蛋白中基本无非目
的蛋白，并用相同的方法也分离纯化得到了较纯的
△-hPdx1 蛋白。将 400 mmol/L 咪唑洗脱得到的洗脱
液装入透析袋中透析除去混在目的蛋白中的盐份和
极少量小分子的非目的蛋白，经透析目的蛋白的纯
度可达 95% 以上。
图 1 重组质粒的酶切鉴定（a）及 PCR鉴定（b）结果
M1. DNA ladder ；1. 重组质粒 hPdx1 经 BamH I 及 Nde I 酶切 ；2. 重
组质粒△-hPdx1 经 BamH I 及 Nde I 酶切 ；M2. Marker Ⅳ ；3. 重组质
粒 hPdx1 PCR 产物 ；4. 重组质粒△-hPdx1 PCR 产物
2.2 诱导表达的重组蛋白鉴定
将分别含有 hPdx1 和△-hPdx1 重组质粒的大肠
杆菌 BL21（DE3）按 1.2.2 的方法诱导后，取菌液
进行 Western blot 检测目的蛋白的表达情况。检测结
果（图 2）显示，在 37.2-52.3 kD 之间出现的两种
目的蛋白条带与 hPdx1 和△-hPdx1 蛋白的理论分子
量的大小相符。
2.3 重组蛋白的分离纯化
将IPTG诱导的hPdx1菌体的破碎上清液按1.2.4
图 2 Western blot检测诱导蛋白的表达
图 3 SDS-PAGE电泳检测蛋白的纯化效果
M. 蛋白分子量 Marker ；1. hPdx1 上清液 ；2. hPdx1 上清穿透液 ；3-7. 分
别为 hPdx1 上清 50、100、200、300、400 mmol/L 咪唑洗脱液；8.△-hPdx1
上清 400 mmol/L 咪唑洗脱液
2.4 重组蛋白进入人胚胎干细胞（hES细胞）
为了研究分离纯化得到的 hPdx1 蛋白能否穿透
细胞膜进入 hES 细胞，用 hPdx1 序列中已去除具有
穿透功能的多肽序列的△-hPdx1 蛋白为对照来研究
hPdx1 蛋白对 hES 细胞的穿透能力。将分离纯化得
M. 蛋白质 Marker; 1. hPdx1; 2. △-hPdx1
2012年第9期 123王小莉等 ：hPdx1 和△-hPdx1 蛋白表达系统的构建及功能鉴定
到的 hPdx1 蛋白和△-hPdx1 蛋白分别以终浓度为 10
nmol/L 添加到在 Matrigel 上培养的 hES 细胞的条件
培养基中，1 h 后去除培养基，细胞用 PBS 洗 3 遍
后对细胞进行免疫荧光检测。试验结果（图 4）表明，
hPdx1 蛋白可高效地进入 hES 细胞，而△-hPdx1 蛋
白不能进入细胞内，△-hPdx1 蛋白可作为对照为更
好的研究 hPdx1 蛋白诱导 hES 细胞向胰岛分泌细胞
分化提供基础。
图 4 细胞免疫荧光检测蛋白进入 hES细胞的情况
a. hES 细胞形态 ；b. hES 细胞中加入 hPdx1 蛋白 1 h 后细胞免疫荧光 ；c. DAPI 染色 ；d. b&c 合并 ；e. hES 细胞形态 ；
f. hES 细胞中加入△-hPdx1 蛋白 1 h 后细胞免疫荧光 ；g. DAPI 染色 ；h. f &g 合并
3 讨论
Pdx1 在胰腺早期发育、较晚期 β 细胞的分化及
β 细胞维持正常功能中起着重要作用，它决定着胰
岛素基因的启动、表达和增强效应，同时也调控着
胰岛素的成熟和分泌过程。由于 Pdx1 在胰腺发育过
程中的重要性，已有许多研究者用 Pdx1 在体内或体
外诱导其他类型的细胞转化分化为胰岛素分泌细胞
用来治疗糖尿病小鼠［8，9］。本研究通过构建蛋白表
达系统得到了 hPdx1 和△-hPdx1 蛋白，为后期利用
hPdx1 蛋白诱导人胚胎干细胞分化成胰岛分泌细胞
提供基础。已有研究表明 hPdx1 中含有 PTD，目前
对 PTD 能穿透细胞膜的机制还不是很清楚，但有些
研究认为 PTD 是通过胞饮的内吞作用从胞饮体内将
其释放到胞浆中［10，11］。PTD 虽可穿过生物膜提高蛋
白的运送效率，但不同的 PTD 序列穿透的效率存在
很大的差别［12］。含有 PTD 的 hPdx1 蛋白能否有效
的运送到人胚胎干细胞中还不太清楚，通过本研究
的试验结果可看出，含 PTD 的 hPdx1 蛋白可高效的
进入人胚胎干细胞，而去除 PTD 的△-hPdx1 蛋白则
不能进入细胞。Pdx1 可启动非 β 细胞中与胰腺发育
相关的基因表达，使这些非 β 细胞转化成为胰岛素
分泌细胞代替 β 细胞分泌胰岛素稳定患者的血糖是
糖尿病治疗的策略之一。利用△-hPdx1 蛋白做对照
可准确的研究 hPdx1 蛋白在将人胚胎干细胞分化为
胰岛素分泌细胞过程中的作用机理，并且分化得到
胰岛素分泌细胞更加安全可靠，为今后的临床运用
奠定基础。
4 结论
本研究成功构建了 hPdx1 和△-hPdx1 的蛋白表
达系统，并分离纯化得到了纯度大于 95% 的目的蛋
白，且含蛋白转导域的 hPdx1 蛋白可高效的进入人
胚胎干细胞，而去除蛋白转导域的△-hPdx1 蛋白则
不能进入细胞，表明表达得到的蛋白具有生物活性。
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（责任编辑 马鑫）