全 文 ：分子生物学技术的发展为植物育种提供了一种
基于 DNA 变异的新型遗传标记， 已广泛应用于遗
传多样性分析、 基因等位、 目标性状基因连锁图绘
制等领域， 大幅度加快了育种进程。 胡椒（Piper
nigrum L.）是世界最重要的香辛作物之一， 具有药
用价值和工业利用价值， 在医学领域可被用作健胃
剂、 解热剂和支气管粘膜刺激剂等 [1-2]， 在食品工
业上也可用作抗氧化剂、 防腐剂和保鲜剂等 [3]。 胡
椒属（Piper L.）为胡椒科（Piperaceae）重要的泛热带
组成成分， 有 1 000 多个植物种类[4-5]， 为胡椒育种
工作提供了丰富的性状基因资源 。 海南蒟 （Piper
hainanense）是胡椒属植物的一个典型代表， 分布于
热带作物学报 2013， 34（4）： 636-640
Chinese Journal of Tropical Crops
收稿日期 2012-11-19 修回日期 2013-03-20
基金项目 外专局引智项目（No. 20124600010）； 热带香料饮料种质资源圃（No. 12R22-20）。
作者简介 范 睿（1983 年—）， 女， 研究实习员 ， 硕士 ； 研究方向： 热带作物种质资源与遗传育种 。 *通讯作者 ： 邬华松， E-mail：
13807622912@163.com。
海南蒟 cDNA文库的构建及评价
范 睿1，2，3， 凌 鹏1，4， 顾文亮1，2，3， 李付鹏1，2，3，
郝朝运1，2，3， 闫 林1，2，3， 黄丽芳1，2，3， 邬华松1，2，3 *
1 中国热带农业科学院香料饮料研究所， 海南万宁 571533
2 农业部香辛饮料作物遗传资源利用重点实验室， 海南万宁 571533
3 海南省热带香辛饮料作物遗传改良与品质调控重点实验室， 海南万宁 571533
4 佛罗里达大学柑桔研究与教育中心， 美国佛罗里达 33850
摘 要 全长cDNA 文库构建是改良胡椒性状的分子机理研究基础， 有助于重要相关基因的克隆、 功能分析、
调控及其利用。 以性状优良并具代表性的海南蒟（Piper hainanense）为试材， 采用优化的 In-Fusion SMARTerTM
Directional cDNA Library Construction Kit 技术 ， 构建叶片材料的全长 cDNA 文库 。 结果表明 ： 文库的滴度为
2.0×106 cfu/mL， 文库容量为 1.3×106 cfu。 从文库中随机挑取 20 个克隆进行质粒 DNA 提取、 PCR 及酶切鉴定，
结果显示： 插入片段大小为 1.0~2.0 kb， 重组率为 100％， 表明该文库质量较高， 可满足后续研究需要。
关键词 海南蒟； 叶片； cDNA 文库； 构建
中图分类号 Q949.732.3 文献标识码 A
Construction and Evaluation of cDNA Library of Piper hainanense
FAN Rui1，2，3， LING Peng1，4， GU Wenliang1，2，3， LI Fupeng1，2，3， HAO Chaoyun1，2，3，
YAN Lin1，2，3， HUANG Lifang1，2，3， WU Huasong1，2，3
1 Spice and Beverage Research Institute, Chinese Academy of Tropical AgricuLtural Sciences,
Wanning, Hainan 571533, China
2 Key Laboratory of Genetic Resources Utilization of Spice and Beverage Crops，
Ministry of AgricuLture， Wanning， Hainan 571533, China
3 Hainan Provincial Key Laboratory of Genetic Improvement and Quality Regulation for
Tropical Spice and Beverage Crops, Wanning, Hainan 571533, China
4 University of Florida, Citrus Research and Education Center, Florida 33850, USA
Abstract Piper nigrum L. is an economically important crop in the world． The construction of the full-length
cDNA library of the leaf is the importantly fundamental work for the study on the molecular mechanism of P.
nigrum L.， in which it can facilitate the cloning， characterization and utilization of the important genes involved．
In this research， a full-length cDNA library of the leaf of P. hainanense， a well known piper cultivar in its high
popularity in cultivation， was constructed with In-Fusion SMARTerTM Directional cDNA Library Construction Kit．
The library has a capacity of 1.3× 106 clones， and its recombination efficiency was about 100%， and PCR results
showed that the inserts sizes varied from 1.0 to 2.0 kb， suggesting that the cDNA library of P. hainanense was
successfully constructed for the use in further study．
Key words Piper hainanense； Leaf； CDNA library； Construction
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2013.04.010
第 4 期 范 睿等： 海南蒟 cDNA文库的构建及评价
海南、 广西、 广东等地， 为中国特有物种， 全株均
可入药， 可用于风湿关节痛、 慢性溃疡、 消化不
良、 胃冷痛和腹胀等症 [6-7]， 海南蒟具有中抗胡椒
瘟病、 果穗长、 果穗密集、 花芽分化较早等优良性
状， 为我国胡椒品种改良提供了优异材料来源。 目
前关于海南蒟的研究仅限于药用价值和地理分布等
方面， 分子生物学等信息知之甚少， 亟待开展。 通
过构建 cDNA表达文库不仅可保护濒危珍稀生物资
源， 而且可提供构建分子标记连锁图谱所用的探
针， 更重要的是可用于分离全长基因进而开展基因
功能的研究。 全长 cDNA文库是功能基因组学和比
较基因组学研究的基础 [8]， 利用其寻找克隆新基
因、 研究基因功能及其表达已成为基因组学研究中
的重要工作[9-11]。
为深入挖掘海南蒟潜在的基因资源， 本研究采
用先进的 SMART 技术构建全长 cDNA 文库， 为进
一步克隆胡椒功能基因开辟一条新的途径， 同时也
为开发胡椒抗病种质资源提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 以保存于中国热带农业科学院
香料饮料研究所农业部胡椒种质资源圃的海南蒟植
株为材料， 摘取幼嫩健康叶片， 每份 200 mg， 冻
存于液氮中备用。
1.1.2 主要试剂 In-Fusion SMARTerTM Directional
cDNA Library Construction Kit 和 Advantage 2 PCR
Kit 为 Clontech 公司产品， RNA 提取试剂盒 、 Gel
Extraction KIT 和质粒提取试剂盒均为 OMEGA 公
司产品 ， DH10B 感受态细胞为 Invitrogen 公司产
品， EcoRⅠ和 PstⅠ内切酶购于 NEB公司。 其它常
用药品均为国产分析纯试剂。
1.2 方法
1.2.1 RNA 的提取 称取海南蒟叶片 100 mg 左
右， 于加有液氮的研钵中快速研磨， 然后转移至无
RNAase 的 1.5 mL 离心管中 。 迅速加入 1 mL 的
TRIZOL 提取试剂， 充分混匀， 后续操作参照试剂
盒说明书进行。 产物于 1.2％琼脂糖凝胶电泳检测
RNA完整度， 并用紫外分光光度计测定含量。 -70℃
下保存备用。
1.2.2 cDNA 第一链的合成与 LD -PCR 参照
Clontench公司试剂盒说明书， 合成 cDNA第一链时
在无 RNAase 的 PCR 管中加入下列试剂： 3.75 μL
（约1.0 μg）RNA、 1 μL 3′In-Fusion SMARTer Primer
（12 μmol/L）； 72 ℃温育 3 min， 42 ℃ 2 min 后加入
2 μL 5×First Strand Buffer、 0.25 μL DTT（100 mmol/L）、
1.0 μL dNTP Mix（10 mmol/L）、 1.0 μL SMART Scribe
ReverseTranscriptase、1 μL SMARTerVOligonucleotide
（12μmol/L），混匀离心， 42 ℃置PCR仪上作用90 min，
68℃ 10 min后取出置于冰上终止第一链反应。
取2 μL第一链cDNA、 80 μL去离子水、 10 μL
10×Advantage 2 PCR Buffer、 2 μL 50×dNTP Mix、
2 μL 5′PCR引物、 2 μL CDSⅢ/3′PCR引物、 2 μL 50×
Advantage 2 Polymerase Mix于0.5 mL的PCR管中（总
体积为100 μL）轻轻混匀， 稍离心后置95 ℃预热的
PCR仪中， PCR反应条件为： 95 ℃变性1 min， 95 ℃
15 s、 65 ℃ 30 s、 68 ℃ 6 min， 15个循环， 循环结束
后取5 μL样品， 1.2％琼脂糖凝胶电泳检测产物。
1.2.3 cDNA 纯化及连接转化 产物经 0.8％琼脂
糖凝胶电泳， 切下产物的 1~3 kb 区域， 用胶回收
试剂盒回收， 其操作见说明书。
产物的连接转化： 用连接酶将纯化后的双链
cDNA 与 pSMAERT2IFD（试剂盒提供 ）载体连接 ，
反应体系为 ： 14 μL cDNA， 4 μL 5×In-Fusion HD
EnzymePremix，2μLpSMAERT2IFDLinearized Vector
（150 ng/μL）。 70℃变性10min，冰上放置5min， 终止
反应 。 取2 μL连接产物电击后转化到大肠杆菌
DH10B中， 迅速加入900 μL不含抗生素的SOC培养
基洗出转化产物， 37℃， 200 r/min振荡复苏培养1 h，
加入50％体积的80％甘油以液氮速冻后， 于-80℃
保存备用， 得到的菌液即为原始 cDNA文库。
1.2.4 cDNA 文库的滴度测定 从文库中取 1 μL
菌液用 LB 液体培养基分别稀释 10、 100、 1 000 倍
后， 各取 10 μL 涂于含氨苄青霉素 60 μg/mL 的 LB
培养基上， 过夜培养 12~16 h， 计算平板上的总菌
落数。 根据公式： 文库滴度=平板上的克隆数稀释
倍数/涂板体积； 文库容量=库包装体积×滴度 [12]，
分别计算出 cDNA文库滴度和库容量。
1.2.5 cDNA 文库的质量鉴定 鉴定 cDNA 文库
质量最基本的标准有 2个： 一是文库的重组率， 二
是文库重组克隆插入片段的大小。 从文库中随机挑
取单克隆加入到 LB 液体培养基中， 200 r/min 振荡
培养 12~16 h。 质粒 DNA 提取按照试剂盒操作说
明进行， 产物用 1.2％琼脂糖检测。
以质粒 DNA 为模板 ， 利用试剂盒中提供的
上游引物（TCACACAGGAAACAGCTATGA）和下游
引物 （CCTCTTCGCTATTACGCCAGC）进行重组克
隆插入片段的PCR扩增。 反应体系为25 μL： Taq酶
（5 U/μL）0.125 μL， 10×PCR缓冲液（不含Mg2+）2.5 μL，
MgCl2（2 mmol/L）1.5 μL， dNTPs（10 mmol/L）2 μL， 正
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第 34 卷热 带 作 物 学 报
图 1 胡椒叶片总 RNA 电泳图
28S
18S
1： 双链 cDNA； M： DL2000 marker。
图 2 LD-PCR 扩增产物琼脂糖凝胶电泳
2 000
1 000
750
500
250
100
bp
1 M
义引物与反义引物各 0.5 μL， 加双蒸水至终体积。
反应条件为： 95 ℃预变性 3 min； 95 ℃ 30 s、 65 ℃
30 s、 72 ℃ 3 min， 30 个循环； 72 ℃延伸 10 min。
用 1.2％琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物中重组克隆
插入片段的大小。
双酶切： 为了进一步验证重组克隆插入片段大
小， 使用双酶切的方法。 根据 clontech 说明， 用
EcoRⅠ和 PstⅠ进行双酶切， 以便更好的确认插入
片段的大小。 反应体系为 20 μL： 其中 EcoRⅠbuffer
2μL、 BSA0.2μL、 EcoRⅠ0.5μL、 PstⅠ0.5μL、 质粒
DNA10μL， 加双蒸水至终体积。 37 ℃反应 2 h， 产
物于 1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。
2 结果与分析
2.1 海南蒟叶片总 RNA质量检测
纯度高、 完整性好的总 RNA 是 cDNA 文库构
建等分子生物学研究的基础。 本研究使用试剂盒
从海南蒟叶片样品中获得 RNA 样品， 经 1.2％琼
脂糖凝胶检测， 发现 28S和 18S条带均比较整齐清
晰， 且 28S 条带的亮度是 18S 的 2 倍 ， 无 DNA、
蛋白质污染 （图 1） ； 经紫外分光光度计测定 ，
OD260/OD280≈2.03， 总 RNA 的浓度为 26.4 ng/μL。
说明该方法提取的总 RNA 纯度高、 浓度大、 完整
性好， 能够满足 cDNA 文库构建的需要。
2.2 双链 cDNA合成及纯化
植物中 mRNA 长度一般集中分布在 0.4~2.0 kb
之间， 因此反转录获得的全长 cDNA 只有分布在该
范围内才可能是高质量的 cDNA。 电泳检测发现，
LD-PCR 合成的双链 cDNA 主要分布在 0.4~5 kb，
呈现弥散条带（图 2）， 说明全长 cDNA 数量大、 种
类多、 序列完整， 可达到构建高质量全长 cDNA 文
库的要求。 合成的双链 cDNA 经过胶回收纯化后，
多数片段在 2 kb左右。
2.3 cDNA文库滴度鉴定
cDNA 与载体连接后， 电击法转化大肠杆菌
DH10B 感受态细胞， 转化产物均匀涂布含 Amp 抗
生素 LB固体培养基上， 于 37℃培养箱中培养过夜。
统计平板上的总菌落数， 经计算， 海南蒟叶片文库
滴度为 2.0×106 cfu/mL， 文库容量为 1.3×106 cfu。
2.4 文库插入片段检测
2.4.1 质粒 DNA 提取 随机挑取平板上生长的
20 个单菌落， 每个菌落加入到 10 mL 含有 Amp 抗
生素的 LB 培养基中， 过夜培养。 按照试剂盒说明
提取质粒 DNA， 经 1.2％琼脂糖凝胶电泳检测发
现， 质粒 DNA 结构完整， 带谱分别为超螺旋和线
性 DNA（图 3）。 说明质粒 DNA 条带完整、 含量高、
纯度好， 可以开展后续实验。
2.4.2 插入片段检测 用文库构建载体的通用引
物对质粒 DNA 进行 PCR 扩增， 来鉴定 cDNA 文库
插入片段大小。 由图 4可见， 扩增产物均在 1~2 kb
之间， 说明文库插入片段完整。
本实验设计了双酶切法进一步验证插入片段，
以防止 PCR 出现非特异性扩增影响重组率计算。
结果显示， 酶切产物均在 1~2 kb 之间（图 5）， 基
本与 PCR结果一致， 说明文库插入片段完整。
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第 4 期 范 睿等： 海南蒟 cDNA文库的构建及评价
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 M
图 4 PCR 扩增产物琼脂糖凝胶电泳
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 M
图 5 酶切产物琼脂糖凝胶电泳
通过 PCR 和酶切检测结果计算插入片段的重
组子数目及空载体数目。 PCR 和酶切法检测的海
南蒟叶片 cDNA 文库的 20 个克隆子中未发现空载
体。 根据公式计算得知 cDNA 文库的重组率约为
100％， 且所构建的文库中 cDNA 插入片段分布均
匀， 呈现大小不等的扩增条带， 表明本实验成功构
建了质量较高的海南蒟 cDNA文库， 为后续开发新
功能基因及遗传育种打下坚实基础。
3 讨论与结论
cDNA 文库是发现新基因和研究基因功能的基
础工具， 在生物学研究领域中有着广泛的用途， 目
前己发现的基因绝大部分是通过 cDNA 文库筛选而
得到的， 以胡椒为材料获得植物优良基因的研究尚
未见报道。 本研究首次以胡椒属野生种海南蒟为材
料 ， 通 过 提 取 叶 片 总 RNA， 采 用 In -Fusion
SMARTerTM Directional cDNA Library Construction
Kit 技术， 构建了海南蒟全长 cDNA 文库。 通过对
文库库容量、 重组率、 文库滴度、 cDNA 插入片段
大小等各项指标的测定， 结果表明 cDNA 文库质量
较高且可用于后续实验。
提取高质量的 RNA 是获得全长 cDNA 的基础，
RNA 的纯度和完整性决定着 cDNA 文库的构建质
量即序列信息的完整性 [13-14]。 本研究在提取高质量
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 M
图 3 质粒 DNA 电泳图
M： DL2000 marker； 1～20 个单菌落； 下同。
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第 34 卷热 带 作 物 学 报
总 RNA 的前提下， 不经过 mRNA 的纯化过程， 直
接用总 RNA 建库， 减少了 mRNA 的降解和损失，
使 mRNA最大限度地转化为 cDNA， 从而有效地保
证了 cDNA的完整性。 影响全长 cDNA 文库质量的
另一个重要因素是反转录 cDNA 第 1、 2 链的数量
和质量 [15]。 CLONTECH 的 SMART 反转录及 LD-
PCR（Long distance PCR）技术保证了合成第 1、 2
链 cDNA 的数量。 但片段不同， 其 PCR 扩增的效
率也存在差异。 为了提高第 1、 2 链 cDNA 质量，
本研究对该方法进行了优化， 严格控制 LD-PCR
循环次数。 如循环数过多可能会导致某些低丰度基
因的 “丢失”， 而且该循环次数对于 cDNA 的合成
大小及基因在文库片段中拷贝数分布也很重要 [16]。
因此， 本研究根据初始反应中 RNA 的含量 ， 在
LD-PCR 中设定了 15 个循环， 合成了足够量的高
质量双链 cDNA， 文库中包含了细胞表达的绝大部
分基因， 更重要的是使低丰度的基因表达序列在文
库中得到富集， 从而便于稀有 mRNA 的扩增和克
隆， 保证了文库的代表性。
文库滴度 、 重组率及插入片段大小是鉴定
cDNA 文库质量的指标 。 一般文库滴度能达到
105 cfu/mL 以上为有效文库 [17]。 本研究所获得的海
南蒟全长 cDNA 文库滴度为 2.0×106 cfu/mL， 文库
容量为 1.3×106 cfu， 插入片段平均长度为 1.5 kb，
没有空载体， 重组率接近 100％。 cDNA 片段与载
体连接之前除去过短的 cDNA 片段也非常重要，
若不能有效地去除短 cDNA 片段， 将会降低文库
平均插入片段的长度。 本研究采用胶回收法将小
于 1 000 bp的片段去除， 保证了文库中具有较大分
子的 cDNA， 减少短片段优先连接的机率， 提高长
片段的连接效率。 此外， 将回收后的 cDNA 片段与
载体按不同的比例分别进行连接， 并且取连接效率
较好的进行文库包装。 已有研究表明， 将 cDNA 片
段分级分离， 去除小片段后再与载体连接可提高大
片段克隆的比例 [18]。 因此， 本研究建立的 cDNA 文
库插入片段均大于 1 000 bp， 平均长度较长， 质量
较好。 本研究将为海南蒟基因组 DNA 精细作图、
连锁优良性状的分子标记、 有益基因分离与克隆等
奠定坚实基础， 为胡椒分子遗传育种和种质改良提
供重要的理论依据。
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责任编辑： 黄东杰
640- -