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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第12期
趋磁细菌产生的磁小体为新型纳米级（35-120
收稿日期 ：2012-06-14
基金项目 ：国家自然科学基金项目（20971050），江苏省科技支撑项目（BE2009651）
作者简介 ：王齐磊，男，硕士研究生，研究方向 : 微生物分子生物学 ; E-mail: yshb318@163.com
通讯作者 ：李相前，男，教授，硕士生导师，研究方向 : 酶工程，基因工程，食品生物技术 ; E-mail: lixq2002@126.com
趋磁菌 AMB-1 超氧化物歧化酶 Fe-SOD 在大肠杆菌中
的表达及生理活性研究
王齐磊1，2  李相前1，2   徐琳寓1，2  薛业敏3
（1 淮阴工学院生命科学与化学工程学院，淮安 223003 ；2 南京大学淮安高新技术研究院，淮安 223003 ；
3 南京师范大学金陵女子学院，南京 210097）
摘 要 ： 超氧化物歧化酶（SOD）可以减轻超阳阴离子 O2
-对细胞的毒害作用，提高菌体的抗氧化能力，从而改善菌株的生
理状态。利用 PCR 技术，将趋磁菌 AMB-1 的超氧化物歧化酶基因 fesod 克隆至原核表达载体 pET-20b（+），并在 E. coli BL21（DE3）
有效表达。重组菌株 BL21（DE3） / （pET-20b-fesod-histag）在 0.6 mmol/L IPTG 诱导浓度下进行发酵培养，在生长前期 2-14 h 生长
速率优于对照组 E. coli BL21（DE3） / （pET-20b）。通过亲和层析柱纯化后，重组酶蛋白纯度达电泳均一，超氧化物歧化酶 fesod 活
性最适作用温度为 25℃，在 25℃和 45℃下酶热稳定较好，pH4.2-8.2 之间酶活力稳定。趋磁菌 AMB-1 来源的 Fe-SOD 作为一种抗
氧化酶，在大肠杆菌中的有效表达从一定程度上改善了宿主菌的生长情况。
关键词 ： 超氧化物歧化酶（SOD）　克隆表达　生理活性　酶学性质　趋磁菌 AMB-1
Expression of Superoxide Dismutae Fe-SOD of Magnetospirillum
magneticum AMB-1 in Escherichia coli and Its Enzymatic
Characterization
Wang Qilei1，2 Li Xiangqian 1，2 Xu Linyu1，2 Xue Yemin3
（1Faculty of Life Science & Chemical Engineering，Huaiyin Institute of Technology，Huai’an 223003 ；2Huaian High-Tech Research Institute
of Nanjing University，Huai’an 223003 ；3Department of Food Science and Nutrition，Ginling College，
Nanjing Normal University，Nanjing 210097）
Abstract:  In this study, superoxide dismutaes genes fesod from Magnetospirillum AMB-1 were cloned and expressed in E.coil BL21
（DE3）. The SOD gene was obtained from the genome of AMB-1 through PCR amplification, and the resulting amplified gene was cloned into an
IPTG-inducible expression vector pET-20b, respectively. The expression vectors pET-20b-fesod-histag was further transformed into E.coil BL21
（DE3）. In contrast to the control BL21（DE3） / （pET-20b）, the growth curves of the recominent strains showed that the growth rates of BL21
（DE3） / （pET-20b-fesod-histag）was obviously higher than that of control. Superoxide dismutaes activity result showed that the SOD activity
level of BL21（DE3） / （pET-20b-fesod-histag）per OD600 was higher than that of control. SDS-PAGE analysis showed that fesod gene was
expressed effectively and the expression product was about 22 kD. Moreover, the expression level of an hypothetical SOD protein derived from
the host bacteria was gradually increasing during the IPTG inducible expression in BL21（DE3） / （pET-20b）. Molecular cloning of superoxide
dismutaes genes from AMB-1 and their expression in E.coli.
Key words:  Superoxide dismutaes Cloning and expression Physiological activity Enzymatic characterization Magnetospirillum
magneticum AMB-1
nm）磁性微球，单磁畴极晶体，具有良好的磁学效
2012年第12期 185王齐磊等 ：趋磁菌 AMB-1 超氧化物歧化酶 Fe-SOD 在大肠杆菌中的表达及生理活性研究
应，形态一致，大小均一，具有形态特异性和化学
成分特异性，较大的比面值。另外，颗粒外有磷脂
分子构成的生物膜包被，细胞毒性较低，生物相容
性和分散性极好［1-4］。因此，作为新一代纳米级磁
性材料的磁小体已在在生物工程、药物载体等领域
显示出不可估量的潜在应用价值［5，6］。
Magnetospirillum magneticum AMB-1 是由日本学
者 Matsunaga 等于 1991 年从淡水中分离到一株水生
微好氧趋磁螺菌。在微好氧或厌氧条件下生长条件
下，AMB-1 菌体内可形成 Fe3O4 型磁小体。研究发现，
氧浓度是影响磁小体合成的关键因素［7］，当氧分
压低于 2000 Pa 时，趋磁菌 AMB-l、MS-1 和 MRS-l
才合成磁小体，磁小体生物矿化的最适氧分压为
25 Pa［8］。生长环境的低氧或无氧状态是磁小体合成
的必需条件。AMB-1 在充分通氧培养条件下，菌体
生长量有所提高，但菌体不再合成磁小体 ；微好氧
及厌氧条件下，菌体产生磁小体，但菌体生长量很
低。由此，氧气浓度对趋磁螺菌 AMB-1 的生长及磁
小体的合成有较大的影响。在生物体内，氧气参与
呼吸过程中的氧化磷酸化过程，并产生能量。但是，
氧气在参与新陈代谢的同时，也会产生氧白由基
（oxygen free radical，OFR），引起细胞损伤［9］。生物
体为了维持正常的代谢过程，要求有相应的机制来
清除因频繁的氧化还原反应而产生的自由基。超氧
化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化
物酶（POD）是清除生物体内自由基的 3 种关键酶，
它们与降低氧气对机体的毒害作用有直接联系。而
在这 3 种酶中，SOD 能把生物体内多余的并对细胞
破坏力极强的超氧阴离子自由基岐化产生过氧化氢
和氧气，过氧化氢随后被体内的 CAT 或 POD 分解
或利用掉，解除超氧阴离子自由基的毒害，因此在
维持生物体内超氧阴离子自由基的产生与消除的动
态平衡中起到重要作用［10，11］。
AMB-1 作为一种微好氧菌，具有一定的耐氧
性，在氧浓度较低的条件下，菌体才产生较多磁小
体，溶解氧成为菌体生长及磁小体合成最主要的限
制因素。AMB-1 氧自由基清除系统与菌体生长、磁
小体合成间的联系还不是很清楚。一般认为微好氧
菌对氧气浓度要求严格是因为其缺少某种清除其体
内自由基的酶。超氧化物歧化酶（SOD）能专一地
清除生物氧化过程中产生的超氧阴离子自由基，细
菌的需氧程度和耐氧能力与菌体内的超氧化物岐化
酶（SOD）水平有很大关系，SOD 含量越高，菌体
的耐氧能力就越强。山东大学陈冠军课题组对趋磁
菌 AMB-1 氧代谢中过氧化物酶以及氮氧化物还原酶
等氧代谢相关基因功能进行了研究［12，13］。中国农业
大学李颖课题组尝试将大肠杆菌来源的 Fe 型超氧化
物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶 3 种
抗氧化酶在格瑞斯瓦尔德磁螺菌 MRS-1 中进行过量
表达，并分析过量表达这 3 种酶对趋磁螺菌 MSR-1
耐氧性的影响及产磁影响［14］，并在之后的研究中
认为磁小体的产生是为了消除 ROS 的胁迫作用［15］。
AMB-1 的抗氧化代谢系统与菌体生长以及磁小体合
成途径有着密不可分的联系，其中的机理问题有待
于探索研究。
趋磁螺菌 AMB-1 超氧化物歧化酶的相关研究还
较少，本研究对该菌 Fe 型超氧化物歧化酶从基因的
克隆、表达和纯化以及酶学性质方面进行初步研究，
同时也在一定程度上了解了趋磁菌来源 SOD 的酶学
特征。旨在通过代谢工程方法，提高 AMB-1 菌体中
超氧化物歧化酶的表达水平，消除菌体在代谢过程
中产生过多的氧自由基，提高菌体的抗氧化能力，
减轻氧自由基对菌体生长及磁小体合成的毒害作用，
最终可能达到提高 AMB-1 菌体生长量及磁小体得率
的目的。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌 株 与 质 粒 Magnetospirillum magneticum
AMB-1 由中国科学院青岛海洋所肖天研究员提供。
大肠杆菌 Escherichia coli DH10B（Promega）用于质
粒扩增和分子克隆的宿主 ；大肠杆菌 Escherichia coli
BL21（DE3）（Promega）作为目的基因的表达宿主 ；
质粒 pET-20b（Novagen）用于重组克隆表达载体的
构建 ；没有特殊说明时，大肠杆菌在 37℃下培养，
AMB-1 在 30℃下培养。
1.1.2 主要试剂 限制酶 Nde I、Xho I，T4 DNA 连接
酶和 PyrobestDNA 聚合酶购自宝生物工程公司 ；基
因组提取试剂盒购自天根生化科技有限公司 ；质粒
抽 提 QIAprep Spin Plasmid Miniprep Kit 和 QIAquick
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第12期186
Gel Extraction Kit 胶回收试剂盒购自 Qiagen 公司 ；
Ni-NTA 镍亲和层析系统 Rapid Affinity Purification Kit
购自 Novagen 公司。
1.1.3 基因扩增引物 N 端引物（5- GGAATTCCA-
TATGGCCTTCGAGCTTCCG -3）内为一个 Nde I 酶切
位点，该酶切位点包含起始密码子（ATG）；C 端引
物（5- CCGCTCGAGGCCGAGATTGGCTTCCAC -3）
内带有一个 Xho I 酶切位点，由上海生工生物工程技
术服务公司合成。
1.2 方法
1.2.1 培养基和培养条件 大肠杆菌培养用 LB 培养
基，大肠杆菌复苏电转化用 SOC 培养基，转化子的
选择用含有氨苄青霉素（Amp）抗性（100 μg/μL）的
LB 培 养 基［16］；Magnetospirillum magneticum AMB-1
培养所用的培养基配方为 MSGM 标准培养基，参考
文献［17］。
1.2.2 基因操作 基因组 DNA 提取、DNA 的内切
酶水解和连接、DNA 片段的分离、感受态细胞的
制备，以及基因的高效电转化方法均参照配方，见
文献［16］。质粒的提取、琼脂糖凝胶中分离回收
DNA 片段等操作按照 Qiagen 试剂盒使用指南进行。
1.2.3 重组表达载体的构建 以 AMB-1 基因组为模
板，利用 1.1.3 中的引物进行 PCR 扩增 fesod 目的基
因。PCR 扩增参数 ：95℃变性 5 min，添加 Pyrobest
DNA 聚 合 酶 ；94 ℃ 变 性 40 s，56 ℃ 退 火 40 min，
72 ℃ 延 伸 1 min， 循 环 35 次 后 72 ℃ 保 温 10 min。
PCR 扩增结束后，电泳检测并将 PCR 产物从胶回收
后，用 Nde I 和 Xho I 双酶切并纯化，以适当比例与
同样双酶切的 pET-20b（+）大片段混合并连接，转
化大肠杆菌 DH10B，构建含目的基因片段的原核表
达载体 pET-20b-fesod-histag。
1.2.4 fesod 基因在原核表达载体中的表达 将重组
质粒 pET-20b-fesod-histag 电转化 E.coli BL21（DE3），
挑取单菌落接入含 Amp 抗性的 4 mL LB 培养液，
37℃ 培养过夜，以 1.5% 比例转接至含 Amp 的新鲜
250 mL LB 培养液，37℃ 振荡培养至 OD600 达 0.8 左
右时，加入诱导剂 IPTG 至总浓度 0.6 mmol/L，继续
诱导培养 6 h。在菌体生长及诱导培养过程中，每隔
2 h 取菌液 3 mL，其中 1 mL 用于检测各样品细胞密
度，另外 2 mL 菌液 4℃ 6 000 × g 10 min 离心收集
菌体。 用 100 mmol/L 邻苯咪唑（pH6.75）重悬，经
超声细胞破碎仪破碎，10 000 × g 离心 30 min，上
清即为粗酶液，进行超氧化物歧化酶的测定。同时，
进行 SDS-PAGE 电泳蛋白表达分析（各样品等体积
上样），以检测重组质粒在宿主 E.coli BL21（DE3）
中的可溶性表达情况。超氧化物歧化酶活性测定方
法为邻苯三酚自氧化法。
1.2.5 超氧化物岐化酶（SOD）酶活性测定 SOD
酶活性测定方法按表 1 加入 pH 8.2 50 mmol/L 邻苯
咪唑缓冲液，（25±0.5）℃恒温水浴保温 10 min，加
入邻苯三酚，振荡器混匀，以不加 SOD 酶空白作对照，
准确反应 3 min，室温下放置 5 min 后，在 325 nm 波
长下测定 A325，自氧化速率控制在（0. 070±0.002）/
min。通过调节 SOD 样品浓度，使邻苯三酚氧化速率
控制在（0.035±0.002）/min。
酶活力单位的定义 ：在 l mL 反应液中，每分钟
抑制邻苯三酚自氧化速率达 50% 时的酶量定义为一
个酶活力单位。
表 1 SOD 活力测定加样表
试剂
加样量
空白 自氧化 样品
pH8.2 50 mmol/L 邻苯咪唑缓冲液（mL） 4.5 4.5 4.5
H2O（mL） 0.02 0.01 -
50 mmol/L 邻苯三酚（mL） - 0. 01 0. 01
SOD 样液（mL） - - 0.01
总体积 4.52 4.52 4.52
酶活力单位计算公式 ：
SOD 样品酶活力（mL） = （△A325 邻苯三酚 -△A325
酶）÷△A325 连 ×100%÷50%×V 反 应 液 总 体 积 ÷
V 样品液的体积 ×N 稀释倍数。
SOD 比活的计算公式 ：
比活（U/mg 蛋白）= 样品酶活力（U/mL 发酵
液）/ 样品蛋白浓度（mg/mL）。
1.2.6 Fe-SOD 重组酶的纯化 将培养好的菌液离
心收集细胞，离心条件为 6 000 × g，10 min，4℃。
收集得到的细胞用灭菌的 ddH2O 洗涤 3 次，彻底去
除残留的培养基溶液。然后估算细胞体积，用 3 倍
细胞体积的 1×Binding buffer 结合缓冲液重悬细胞。
2012年第12期 187王齐磊等 ：趋磁菌 AMB-1 超氧化物歧化酶 Fe-SOD 在大肠杆菌中的表达及生理活性研究
用高压细胞破碎仪将重悬的细胞在 1500 psi（1 psi =
6.897 kP）压力下破壁，破壁后的混浊液进行高速离
心，条件为 10 000 × g，30 min，4℃。确保细胞碎
片彻底去除。离心后的上清小心吸出，即为粗酶液。
以下纯化过程在 4℃冰箱进行，酶液中加入 0.02%
（wt/vol）的叠氮钠防止杂菌的污染。使用镍亲和层
析柱进一步纯化蛋白，具体操作参考 Novagen 公司
Ni-NTA 说明书，蛋白纯度由 SDS-PAGE 鉴定。并进
一步用透析袋（MW ：3500，BIOSHARP）透析置换
缓冲 pH 6.2 50 mmol/L 邻苯咪唑缓冲液。
1.2.7 Fe-SOD 重组酶酶学性质比较
1.2.7.1 超氧化物歧化酶酶活性的最适反应温度的
测定 酶反应在 pH8.2 50 mmol/L 的邻苯咪唑缓冲液
缓冲液中进行，缓冲液 pH 在室温 25℃下调配。反
应 体 系 分 别 在 20、25、30、35、40、45、50、55、
60、65℃下进行，分别测定超氧化物歧化酶酶活力。
以最高酶活力为 100%，计算相对活性，作酶活 -温
度曲线。
1.2.7.2 超氧化物歧化酶酶活性的热稳定性测定
分别将重组融合酶 100 μL 置于 25、45、65℃下保温
不同的时间后，分别取样，然后在 25℃，pH8.2（室
温条件下测定）测定残留活力，以保存于冰浴中（未
保温）的酶活力为 100%，计算相对活性，作温度稳
定性曲线，比较酶在不同温度条件下的稳定性。
1.2.7.3 超氧化物歧化酶酶活性的 pH 稳定性的测
定 分别将纯酶置于不同的 50 mmol/L pH4.0-10.0
的邻苯咪唑缓冲液中，在 25℃下保温 1 h，冷却后，
再于最适温度及 pH8.2（室温条件下测定）测定残
留活力性，以保存于冰浴中的酶活力为 100%，作
pH 稳定性曲线，比较酶在不同 pH 条件下的稳定性。
2 结果
2.1 趋磁菌AMB-1基因组的提取
提取 AMB-1 基因组 DNA，其结果如图 1 所示，
基因组 DNA 无杂带，符合作为 PCR 试验模板的要
求，可用于基因克隆。
2.2 重组质粒pET-20b-fesod-histag的构建及验证
为了消除信号肽对外源蛋白在大肠杆菌异源
表达及蛋白活性产生的影响，通过生物信息学方法
对 Fe-SOD 氨基酸序列进行信号肽分析，从而来确
定该蛋白是否含有信号肽序列。通过 SignalP-NN 和
SignalP-HMM 对 Fe-SOD 氨基酸序列进行信号肽分
析，Fe-SOD 并不含信号肽序列，该蛋白可能存在于
细胞质中（图 2）。
按照图 3-A 所示构建 pET-20b-fesod-histag 重组
质粒，在重组菌筛选培养基平板上筛选阳性转化子，
随机挑取 pET-20b-fesod-histag 转化子进行质粒抽提，
对质粒进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳分析。结果重
组质粒切出一条因大小约为 597 bp 的片段（图 3-B），
与 理 论 值 相 符 合。 送 样 测 序 表 明 pET-20b-fesod-
histag 中的基因序列正确。
2.3 Fe-SOD在大肠杆菌中的异源表达及对宿主菌
生长的影响
趋磁菌来源的超氧化物岐化酶基因 SOD 在大肠
杆菌 BL21（DE3）中的表达对菌体生长的影响如图
4-A 所示。BL21 （DE3） / （pET-20b） 重组菌株的培养
过程中，加入 IPTG 会明显抑制菌体的生长速度，但
是最终生长密度与不加 IPTG 的情况是一致的，说
明 IPTG 对菌体的重组菌株的生长是有一定的毒性作
用。同时，在 0.6 mmol/L IPTG 诱导浓度下进行诱导
发 酵 培 养，BL21 （DE3） / （pET-20b-fesod-histag） 在
生长阶段的前期（2-14 h），生长速率明显优于对照
组 BL21 （DE3） / （pET-20b），但二者最终生长密度
基本一致。
趋磁菌来源的超氧化物岐化酶基因 SOD 在大肠
19329
bp
M 1
7743
6223
4254
3472
2690
1882
1489
925
M. DNA marker（λ-EcoT14 I digest Marker）；1. AMB-1 genomic DNA
图 1 AMB-1 基因组的琼脂糖凝胶电泳图
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第12期188
杆菌 BL21（DE3）中的表达过程中，菌体内超氧化
物歧化酶酶活力变化如图 4 所示。每毫升菌液总酶
活的结果（图 4-B）分析，在 0.6 mmol/L IPTG 诱导
浓度下进行诱导发酵培养，菌株 BL21（DE3）/（pET-
20b-fesod-histag）菌体内的 SOD 处于较高的活力水
平， 而 BL21（DE3） / （pET-20b） 菌 体 的 SOD 则 一
直处于非常低的水平。同时，在不加 IPTG 诱导表达
的 BL21（DE3）/（pET-20b）菌株发酵培养中，菌
体自身 SOD 也存在一定的表达。每 OD 菌液 SOD 酶
活的结果（图 4-C）：在 0.6 mmol/L IPTG 诱导浓度下
进 行 诱 导 发 酵 培 养，BL21 （DE3） / （pET-20b-fesod-
histag）菌体细胞内 SOD 酶活力水平明显高于对照组
BL21 （DE3） / （pET-20b）。在 2-7 h 菌体培养阶段，
BL21 （DE3） / （pET-20b-fesod-histag）及 BL21（DE3） /
1.0
A
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
0 10 20 30 40 50 60 70
Position
MAFELPPLPFAIDALEPHISARTFEFHHGKHHAAYVTNLNNLTKDTDLASKSLEEVIKVAAADLPAKQGI
Sc
or
e
1.0
B
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
0 10 20 30 40 50 60 70
Position
MAFELPPLPFAIDALEPHISARTFEFHHGKHHAAYVTNLNNLTKDTDLASKSLEEVIKVAAADLPAKQGI
Sc
or
e
Y score
C scoreS score
c-region prob.
图 2 SignalP-NN（A）和 SignalP-HMM（B）对 Fe-SOD 的信号肽序列预测结果
T7 terminator
T7 promoter
Fesod
Nde l
Xho l
fesod
Nde l Xho l
PCR
AMB-1 genome
Ori
pET-20b-fesod-histag
f1 origin
1
Amp
T7 terminator
T7 promoter
MCS
Nde l
Xho l
OripET-20b
f1 origin
1
Amp
2000
bp bp bp
M1 1 M2 2 M3
1000
4254
3742
1000
750
500
250
750
500
250
A
B
M1. DL2000 Marker ；1. fesod 基因 PCR 扩增产物 ；M2. λ-EcoT14 I digest Marker ；
2. 重组质粒 pET-20b-fesod-histag NdeⅠ和 XhoⅠ双酶切 ；M3. DL2000 Marker
图 3 重组质粒 pET-20b-fesod-histag 的构建（A）及酶切分析（B）
2012年第12期 189王齐磊等 ：趋磁菌 AMB-1 超氧化物歧化酶 Fe-SOD 在大肠杆菌中的表达及生理活性研究
（pET-20b）（未诱导组）菌体内 SOD 酶活急剧上升， 之后逐渐趋于稳定水平（图 4-B，C）。
65
55
45
35
25
15
5
-5 0 3
,37*䈡ሬ ,37*䈡ሬ,37*䈡ሬ
6 9 12 15 18 21ᰦ䰤K0
0
1.0
2.0
3.0
3.5
2.5
1.5
0.5
⭏䮯
ᇶᓖ
OD
60
0
3 6 9 12 15 18 21ᰦ䰤K
65
55
45
35
25
15
5
-5 0 3 6 9 12 15 18 21ᰦ䰤K
SO
D
U/m
L
SO
D
U/O
D
60
0
A B C
◆. 未经 IPTG 诱导的含空质粒 pET-20b 的工程菌 ；▲. 经过 0.6 mmol/L IPTG 诱导的工程菌 pET-20b-fesod-histag ；
■. 经过 0.6 mmol/L IPTG 诱导的含空质粒 pET-20b 的工程菌
图 4 BL21 （DE3） / （pET-20b-fesod-histag）基因工程菌生长曲线及粗酶液 SOD 酶活性分析
94
kD
a b c
1 h
a b c
2 h
a b c
3 h
a b c
4 h
a b c
5 h
66.2
45
35
26
ᵚ⸕㳻ⲭ
Fe-SOD
BL21（DE3）/（pET-20b-fesod-histag）以及 BL21
（DE3）/（pET-20b） 工 程 菌 株 在 诱 导 发 酵 培 养 中
SOD 酶活性变化情况有较大的差别，两种工程菌株
的蛋白表达情况如图 5 所示。含有 pET-20b-fesod-
histag 重组质粒的 E.coli BL21（DE3）菌株培养 2 h
时，经过 0.6 mmol/L IPTG 诱导之后，在约 22 kD 处
有明显的条带（图 5 箭头所指条带），该条带大小与
fesod 基因编码产物分子量的理论值一致。同时，工
程菌株 BL21 （DE3） / （pET-20b）
上述结果表明表达载体 pET-20b-fesod-histag 在
E.coli BL21（DE3）菌株中成功地表达了 AMB-1 来
a. 未经 IPTG 诱导组 ；c. BL21（DE3）/（pET-20b-fesod-histag）；
b. BL21（DE3）/（pET-20b）
图 5 BL21 （DE3） / （pET-20b-fesod-histag） 基因工程菌超氧
化物歧化酶基因表达产物的 SDS-PAGE 分析
源 Fe-SOD。另外，未知蛋白的具体功能、其表达水
平与 SOD 活性以及菌体的生长的联系有待于进一步
研究。
2.4 Fe-SOD重组酶的纯化
His-tag 亲和层析柱纯化蛋白。SDS-PAGE 分析
结果（图 6）表明，重组酶 Fe-SOD 的大小约 22 kD，
达到电泳均一，与预期的蛋白分子量一致。
M. 蛋白质分子量标准 ；1. 经过纯化的重组酶 Fe-SOD
图 6 SDS-PAGE 电泳检测重组酶 Fe-SOD 的纯化
170
kD
M 1
130
95
72
55
43
34
26
17
2.5 Fe-SOD重组酶酶学性质分析
以邻苯三酚作为底物测定 SOD 酶活性，结果（图
7-A）显示，Fe-SOD 重组酶的最适温度为 25℃，温
度升高，酶活性逐步降低 ；Fe-SOD 重组酶在 25℃
及 45℃时，酶的热稳定极为相似且酶热稳定性较好，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第12期190
65℃时酶热稳定性极差（图 7-B）；FeSOD 重组酶的
pH 稳定性如图 7-C 所示，重组酶在 5.4-8.2 缓冲液
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⑙ᓖ℃ ᰦ䰤min pH
A B C
25℃
45℃
65℃
图 7 重组酶 Fe-SOD 的酶学性质
化能力，从而过剩氧自由基对菌体的生长产生一定
的抑制作用。趋磁菌 AMB-1 来源的 Fe-SOD 在大肠
杆菌中进行 IPTG 诱导表达，可能从一定程度上提高
了宿主菌的抗氧化能力，减轻细胞代谢过程中产生
的过剩氧自由基对菌体生长的毒害作用，从而改善
了宿主菌株的生理状态。
AMB-1 发酵生产磁小体一直受供氧条件的限制，
难以进一步实现其应用价值。趋磁菌 AMB-1 是微好
氧菌，AMB-1 基因组中含有两个超氧化物歧化酶基
因，一个含 597 bp 开放阅读框的蛋白 Fe-SOD 和一
个含 531 bp 开放阅读框的蛋白 Cu/Zn-SOD。同时，
AMB-1 含有 3 个过氧化物歧化酶基因（Perxidase 1，2，
3）［12］，一个磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶（Phospholipid
hydroperoxide glutathione peroxidase）以及一个谷胱甘
肽还原酶（Glutathione reductase），没有发现有过氧
化氢酶基因（Catalase）。AMB-1 含有抗氧化酶，在
有氧条件也能够生长，证明其可以进行有氧代谢产
生能量并具有一定的耐氧性。然而，AMB-1 的生长
密度较低，并不产生磁小体，这可能是其较弱的氧
自由基清除能力所致。好氧微生物大肠杆菌基因组
含有超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧
化物酶。其中，大肠杆菌中的诱导表达型超氧化物
歧化酶 Mn-SOD，在氧分压很高时才诱导表达，组
成型超氧化物歧化酶 Fe-SOD，在菌体生长整个周期
都有表达。与大肠杆菌相比，AMB-1 微好氧生长的
中保温 1 h 后（25℃），酶的残存酶活力保持在 90％
以上。
3 讨论
生物体既有自由基的生成体系，又有自由基的
清除系统。正常情况下，生物机体存在着一个完整
的抗氧化体系 ：抗氧化酶和抗氧化剂两大类。超氧
化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-
Px）、过氧化氢酶（CAT）等都属于机体的抗氧化酶系，
协同防止自由基的损伤，在机体的抗氧化方面起着
重要的作用，超氧化物歧化酶是消除过超氧阴离子
自由基的酶。提高如 SOD 等清除自由基酶类的水平
或通过额外添加抗氧化剂的方式可以有效消除机体
代谢过程中产生的过剩氧自由基对自身的毒害作用，
从而改善机体的生理状态［19，20］。研究发现大多数乳
酸菌是通过产 SOD 酶和谷光甘肽而清除经自由基和
过氧化氢，SOD 酶能直接减少活性氧自由基的毒性，
并阻止活性氧自由基向羟自由基的转变。
本 研 究 中 对 趋 磁 菌 AMB-1 来 源 的 Fe-SOD 在
E.coil BL21（DE3）中进行异源表达，该蛋白在大肠
杆菌中实现了高效可溶性表达。研究发现，在进行
基因工程菌的诱导发酵培养中，IPTG 的加入会明显
抑制宿主菌体的生长速度，同时对宿主菌自身 SOD
的表达有抑制作用。在 IPTG 诱导的情况下，宿主菌
中异源表达 Fe-SOD，能够明显的提高菌体 SOD 的
活力水平，同时也从一定程度上改善了 IPTG 的加入
对宿主菌生长的抑制作用。试验表明，IPTG 的加入
可能会抑制宿主菌 SOD 的表达，削弱宿主菌的抗氧
2012年第12期 191王齐磊等 ：趋磁菌 AMB-1 超氧化物歧化酶 Fe-SOD 在大肠杆菌中的表达及生理活性研究
可能原因 ：清除氧自由基酶系统相对简单，调节能
力较差，无法耐受较高的氧浓度。目前氧气对磁小
体合成的影响机制仍然不清楚，氧气可能作为呼吸
链末端电子受体，产生能量供磁小体合成。
本研究初步分析了 AMB-1 来源的 Fe-SOD 基本
酶学性质及其表达对宿主菌生长的影响作用，为揭
示该菌的耐氧机制提供一定的参考，同时也为探索
提高趋磁螺菌 AMB-1 耐氧性的新途径、降低趋磁菌
AMB-1 磁小体的生产成本提供理论基础。通过代谢
工程方法，提高 AMB-1 菌体中自身超氧化物歧化酶
的表达水平，消除菌体在代谢过程中产生过多的氧
自由基，提高菌体的抗氧化能力，最终减轻氧自由
基对菌体生长的毒害作用及对磁小体合成的抑制作
用，可能会达到提高 AMB-1 菌体生长量及磁小体得
率的目的。
4 结论
利 用 PCR 技 术， 将 趋 磁 菌 AMB-1 的 超 氧 化
物歧化酶基因 fesod 克隆至原核表达载体 pET-20b
（+）， 并 在 大 肠 杆 菌 BL21（DE3） 有 效 表 达， 重
组 菌 株 在 生 长 前 期 2-14 h 生 长 速 率 优 于 对 照 组
BL21 （DE3） / （pET-20b）。趋磁菌 AMB-1 来源的 Fe-
SOD 作为一种抗氧化酶，在大肠杆菌中的有效表达
从一定程度上改善了宿主菌的生长情况。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）