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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第9期
外切葡聚糖酶是纤维素酶系统中关键的一个
酶［1］。纤维素的生物降解涉及到一组复合的纤维
素酶系，酶系由 3 种作用方式不同但相互协同催
化水解纤维素的酶组成 ：内切葡聚糖酶（endo-1，
4-β-D-glucanase，EC3.2.1.4），这类酶作用于纤维素
分子内部的非结晶区，随机水解 β-1，4-糖苷键，产
生大量短纤维素链 ；外切葡聚糖酶（exo-1，4-β-D-
glucanase，EC3.2.1.91），这类酶作用于纤维素长链
收稿日期 ：2013-04-02
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31060125），广西科学院基本科研业务费项目（12YJ25SW05）
作者简介 ：庞浩，男，博士，副研究员，研究方向 ：分子酶学 ；E-mail ：panghouse@126.com
通讯作者 ：黄日波，男，教授，博士生导师，研究方向 ：分子酶学和酶工程 ；E-mail ：rbhuang@163.com
地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）外切葡聚糖酶
CelB 基因的发掘及功能鉴定
庞浩1，2  陈燕1  吴倩倩1  刘春宇1  郭媛2  林丽华2  黄日波1，2
（1. 广西大学生命科学与技术学院，南宁 530005 ；2. 国家非粮生物质能源工程技术研究中心 非粮生物质酶解国家重点实验室
广西科学院工业生物技术研究中心，南宁 530007）
摘 要 ： 从地衣芽孢杆菌的基因组数据中寻找与外切葡聚糖酶相似性高的 DNA 序列，发现在地衣芽孢杆菌基因组中 CelB
DNA 片段具有很高的序列相似性。在大肠杆菌中对来自地衣芽孢杆菌的 CelB 基因 DNA 片段进行表达并纯化蛋白质。CelB 蛋白质
对纤维素底物具有活性。根据糖基水解酶家族 48 的保守活性位点设计突变策略对 CelB 进行突变，突变体丧失对底物的活性，说
明它具有糖基水解酶家族 48 的外切葡聚糖酶的典型活性位点。
关键词 ： 外切葡聚糖酶 基因组信息学 地衣芽孢杆菌 蛋白质结构 定点突变
Exploring and Function Characteristics of Exo-1，4-β-D-glucanase
CelB Gene of Bacillus licheniformis
Pang Hao1，2 Chen Yan1 Wu Qianqian1 Liu Chunyu1 Guo Yuan2 Lin Lihua2 Huang Ribo1，2
（1. College of Life Science and Technology，Guangxi University，Nanning 530005 ；2. National Engineering Research Center for Non-Food
Biorefinery，State Key Laboratory of Non-Food Biomass and Enzyme Technology，Guangxi Key Laboratory of Biorefinery of Guangxi
Academy of Sciences，Nanning 530007）
Abstract:  Screening of DNA sequence similar with exo-1, 4-β-D-glucanase from the genome data of Bacillus licheniformis with
bioinformatic techniques, one DNA fragment CelB showed high similarity was found. This DNA was cloned, expressed, and the result protein was
purified. The CelB showed activity to cellulose substrate. Based on the conserved activity sites of glycoside hydrolase family 48 protein, amino
acid sites of CelB were choosed for mutation and the mutant of CelB lost the activity, thus it showed that CelB contain the typical active sites of
family 48. In this work, a exo-1, 4-β-D-glucanase gene was successfully found and cloned from B. licheniformis, it establishes the foundation for
the further study of the cellulase system and their working mechanism of B. licheniformis.
Key words:  Exo-1, 4-β-D-glucanase Genome informatics Bacillus licheniformis Protein structure Site-directed mutagenesis
的末端，水解 β-1，4-糖苷键，每次从长链上切下
一个纤维二糖分子 ；β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，
EC3.2.1.21），这类酶将纤维二糖水解成葡萄糖分
子［2］。在 3 类纤维素酶的协同作用下才能降解纤维
素。在 3 类酶中，外切葡聚糖酶被认为具有破坏纤
维素结晶区的作用，从而暴露出葡萄糖链，为后续
的内切葡聚糖酶奠定作用基础［3］。同时，外切葡聚
糖酶以进行性酶切的作用方式进行水解，与内切葡
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第9期152
聚糖酶形成协同作用，加速纤维素的水解进程［4，5］。
但是由于外切葡聚糖酶水解的特殊方式，它对
目前纤维素酶活测定常用的底物的活性很弱。例如，
外切葡聚糖酶对于羧甲基纤维素钠，这个在内切纤
维素酶活性测定中最常用的底物，活力很微弱［6］。
而人工合成的对硝基苯纤维二糖苷等荧光底物，只
有那些具备从还原端进行水解能力的外切葡聚糖酶
才能水解［7］。因而，在外切葡聚糖酶的酶活测定以
及基因筛选中，往往只能使用结晶纤维素作为底物
进行测定［8］。结晶纤维素是不溶解于水的固体底物，
使用这个底物进行活性筛选，需要较长的作用时间。
这些因素造成了外切葡聚糖酶筛选和测定的困难。
这也是在目前的纤维素酶的报道中，利用活性筛选
的方法极少有从自然环境中活性筛选酶发现外切葡
聚糖酶的原因［2］。
地衣芽孢杆菌是工业应用中一种重要的微生物，
它被用于生产具有重要工业价值的淀粉酶［9］。在这
个微生物中发现和报告了各种内切葡聚糖酶［10］，但
没有外切葡聚糖酶的克隆和鉴定的报道。本研究发
掘地衣芽孢杆菌微生物基因组信息，从中发现和活
性鉴定一个外切葡聚糖酶基因，旨在为进一步研究
地衣芽孢杆菌的纤维素酶系组成和作用方式奠定
基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌 株 和 质 粒 大 肠 杆 菌 Escherichia coli
XL1-blue 由 实 验 室 保 存， 地 衣 芽 孢 杆 菌 Bacillus
licheniformis 购买自中国普通微生物菌种保藏管理中
心。质粒 pQE30 购买自美国 Qiagen 公司。
1.1.2 主要试剂和仪器 细菌基因组提取试剂盒购
自 TIANGEN 公司 ；PrimeSTAR HS DNA 聚合酶、限
制性内切酶、T4 DNA ligase、DNA Marker 和 Protein
Marker 购自 TaKaRa 公司 ；羧甲基纤维素钠、微晶
纤维素、纤维二糖、纤维四糖购买自美国 Sigma-
Aldrich 公 司 ；异 丙 基 -β-D-硫 代 半 乳 糖 苷（IPTG）
购自 Calbiochem 公司 ；Yeast extract 和 Tryptone 购自
OXOID 公司 ；快速定点突变试剂盒 Quickchange 购
自 Stratagene 公司 ；Dpn I 为 Promega 产品 ；其它试
剂均为国产分析纯试剂。寡聚核苷酸由上海生工生
物公司合成。
1.2 方法
1.2.1 基因序列比较和蛋白质分析 利用 NCBI 的
GenBank 数据库（http ：//www.ncbi.nlm.nih.gov）进行
基因检索和 DNA 比对、CAZY 数据库（http ：//www.
cazy.org） 进 行 糖 基 水 解 酶 分 类 分 析 和 检 索［11］、
SMART 软 件（http ：//smart.embl-heidelberg.de/） 进
行蛋白质结构组件分析［12］。使用 Vector NTI 10.0 软
件进行引物设计。
1.2.2 克隆目的基因
1.2.2.1 地 衣 芽 胞 杆 菌 基 因 组 的 提 取 用 细 菌
基 因 组 DNA 试 剂 盒（TIANGEN 公 司 ） 提 取 B.
licheniformis 的基因组 DNA，0.8% 琼脂糖凝胶电泳
检测基因组 DNA 浓度。
1.2.2.2 目的基因的 PCR 扩增 根据 GenBank 数据
库公开的 B. licheniformis ATCC 14580 CelB 基因序列
设计 PCR 扩增引物 ：BP1 ：5-CGCGGATCCGATAA-
TAAAACACGTTTTATGC-3 和 BP2 ：5-ACGCGTCG-
ACTTATGCATTTCCATTAAAC-3 分别在上下游引物
的 5 端引入 BamH I 和 Sal I 酶切位点（下划线部
分）。以 B. licheniformis 的基因组 DNA 为模板进行
PCR 扩增，条件为：95℃ 2 min；95℃ 30 s，54℃ 30 s，
72℃ 2.5 min，30 个循环 ；72℃ 10 min。回收目的
PCR 产物，然后用 BamH I 和 Sal I 酶切后与经相同
限制性内切酶酶切的表达载体 pQE30 连接，连接产
物转化到大肠杆菌 XL1-blue 感受态细胞中，酶切鉴
定重组质粒，重组质粒命名为 pQE-CelB。所运用的
基因操作、质粒提取、大肠杆菌感受态细胞制备和
转化等操作按文献［13］进行。
1.2.3 目的蛋白的诱导表达与纯化 挑取含有 pQE-
CelB 的重组大肠杆菌单菌落接种到 LB 培养基中，
振荡培养至 OD600 为 0.4-0.6 时，加 IPTG 至终浓度
为 0.5 mmol/L，37℃诱导 8 h。表达的重组蛋白质
celB 使用 Ni-NTA 镍亲和层析纯化，再通过 30 kD 的
超滤膜脱盐处理。纯化的 CelB 蛋白质进行变性的聚
丙烯酰胺凝胶电泳分析。
1.2.4 重组蛋白 CelB 的外切葡聚糖酶活性的测定
1.2.4.1 CelB 水解纤维四糖的测定 取 2 μL 的 CelB
蛋白质以 1% 的纤维四糖为底物在 pH7.0 的磷酸缓
2013年第9期 153庞浩等 ：地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）外切葡聚糖酶 CelB 基因的发掘及功能鉴定
冲液中 40℃作用 2 h。然后将反应物放置沸水中反
应 10 min 终止酶反应，室温冷却，进行薄层层析分
析。薄层层析（TLC）是用展层剂 - 正丁醇∶醋酸∶
水 =2∶1∶1，层析约 4 h。用 50% 的硫酸（溶于甲
醇）喷涂后在 110℃中加热 10 min 显色［14］。
1.2.4.2 CelB 水解纤维素的测定 首先用浓磷酸处
理结晶纤维素（微晶纤维素）2 h 后，用蒸馏水反
复冲洗直至酸膨胀的纤维素的 pH 为中性。然后取 2
μL 的 Cel48B 蛋白质以 1% 的酸膨胀纤维素为底物在
pH7.0 的磷酸缓冲液中 40℃作用 4 h。将反应物放置
沸水中反应 10 min 终止酶反应，室温冷却，进行薄
层层析分析。
1.2.5 重组蛋白 CelB 的氨基酸定点突位
1.2.5.1 CelB 的蛋白质结构的建模和蛋白质的 3D
结 构 的 比 较 建 模 使 用 Jalview 软 件［15］ 对 具 有
3D 结构的来自热纤维梭 状 芽 孢 杆 菌（Clostridium
thermocellum）的纤维二糖水解酶（PDB code=1L1Y）、
来 自 解 纤 维 梭 菌（Clostridium cellulolyticum） 的 具
有顺序酶切功能的内切纤维素酶（PDB code=1F9D）
和 celB 进行序列分析查找蛋白质的保守序列。并以
这两个具有 3D 结构的纤维素酶为模板，使用 M4T
serve［16］和 SYBYL-X 1.1 对 celB 进行比较同源建模。
1.2.5.2 定点突变引物的设计 根据突变目的的氨
基酸序列，在上下游引物中的特定位置中引入相对
应的突变序列。
E38Q-1 ：5-AAACGCTCATATGCcaaGCGCCTG-
ATTACG-3，E38Q-2 ：5-TATGGCCGTAATCAGGCG-
CttgGCATAT-3。
D228N-1 ：5-TACACTAATGCGACCaacGCCG-
AT-3，D228N-2 ：5-ATCGGCgttGGTCGCATTAGTG-
TA-3。
1.2.5.3 突变体的获得 以构建好的重组质粒 pQE-
CelB 为模板，利用引物及一步反向 PCR 法扩增含
有目的突变序列的全长基因。PCR 扩增条件 ：95℃
2 min ；95℃ 30 s，51℃ 30 s，72℃ 2.5 min，30 个循
环 ；72℃ 10 min。E38Q、D228N 的退火温度 Tm 为
51℃。
PCR 扩增产物在 0.8% 琼脂糖凝胶电泳检测。
剩余的 PCR 产物用 Dpn I 消化 DNA 模板后，转化到
E.coli XL10-Gold。将获得的所有突变体委托上海生
工完成。每个突变体均重复测序 3 次，以确定获得
的 3 个重组突变体序列的正确性。
1.2.6 突变酶的表达、纯化及外切葡聚糖酶活性的
测定 分别提取测序正确的突变子的质粒 E38Q、
D228N，然后分别转化到E. coli XL1-blue中。按照1.2.3
中所述的方法进行表达和纯化，再根据 1.2.4 中所述
的水解纤维四糖的方法及 TLC 方法来测定突变酶的
外切葡聚糖的活性。
2 结果
2.1 CelB的生物信息学分析
以 B. licheniformis 的基因组在 NCBI 数据库中进
行比对分析，查找到来自 B. licheniformis ATCC14580
中有一个注析为糖基水解酶家族（glycoside hydrolase
family protein） 的 蛋 白 CelB（ 序 列 号 为 YP_0790-
54.1）。于是，使用 SMART 工具分析这个蛋白质的结
构组件发现，自 N 端的第 3-464 位和 483-701 位氨
基酸为家族 48 糖基水解酶（glycosyl hydrolase）功能
域（图 1-A）。同时使用 SignalP 4.1 Server 分析 CelB
的信号肽序列，结果（图 1-B）显示 CelB 无信号肽
序列。
A ：CelB 的蛋白质结构组件分析 ；B ：CelB 的信号肽序列分析
图 1 蛋白质生物信息学分析
2.2 重组表达质粒pQE-Cel48B的构建
以地衣芽胞杆菌的总 DNA 为模板扩增目的基因
CelB，产物经琼脂糖凝胶电泳分析有大小约为 2.1 kb
特异性扩增条带（图 2），与预期相符。将胶回收的
PCR 产物连接到表达载体 pQE30 上。
1.0
0.8
0.6
0.4Sc
or
e
0.2
0.0
0 10 20 30 40
Position
50 60 70
C-score
S-score
Y-score
Phr
Glyco_hydro_48
Pa
Glyco
A
B
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第9期154
2.3 重组蛋白CelB的诱导表达及纯化
CelB 基 因 表 达 产 物 的 SDS-PAGE 分 析（ 图 3）
表明，含有重组质粒的大肠杆菌菌株 XL1-blue 与对
照菌株相比在 88 kD 处有明显蛋白质特征条带出现，
蛋白分子量与由基因序列推测所得理论分子量一致；
经 Ni-NTA 镍亲和层析纯化获得 90% 纯度的 CelB 蛋
白（图 3，泳道 3）。
用 M4T server 蛋白质 3D 模拟服务器对 CelB 进
行同源建模。同时将通过同源建模获得的 CelB 3D
结构与 1L1Y 的 3D 结构进行了 3D 结构比较（图 6）。
在 1L1Y 和 CelB 的结构叠加比较中，两个蛋白质的
结构框架不是完全对称吻合。但是 celB 的假定催化
基团和 1L1Y 的催化基团是完全重叠的。
通过氨基酸序列的比对及蛋白质的 3D 结构的
比较建模分析，推断在 CelB 中 E38 和 D228 为可能
的催化基团和质子供体（图 5 的箭头所示）。
2.6 CelB基因的定点突变及突变体的诱导表达、
纯化
以 质 粒 pQE-CelB 为 模 板， 分 别 用 E38Q-1 和
E38Q-2、D228N-1 和 D228N-2 引 物 进 行 位 点 突 变。
含有突变体 E38Q 和 D228N 的重组大肠杆菌 XL1-
blue 菌株诱导表达后的粗酶，分别经 Ni-NTA 镍亲和
层析纯化。纯化获得 90% 以上纯度的蛋白质条带。
2.7 突变体E38Q和D228N的外切葡聚糖酶活性的
测定
突变体 E38Q 和 D228N 分别以 1% 纤维四糖为
底物进行酶反应。反应产物用 TLC 分析，结果（图
7）发现，突变体 E38Q 和 D228N 不能水解纤维四糖，
没有外切葡聚糖酶活性。
3 讨论
地衣芽孢杆菌是重要的工业微生物，该微生物
产酶如蛋白酶、脂肪酶以及淀粉酶在工业上被广泛
使用。芽孢杆菌属的许多微生物都拥有完整的纤维
素酶系，如苏云金杆菌就被发现拥有完整的 β-1，
4-外切葡聚糖酶、β-1，4-内切葡聚糖酶和葡萄糖苷
M1 M2 1
M1，M2 ：DNA 分子量标准 ；1 ：样品
图 2 celB 的 PCR 产物
M 1 2 3
M ：蛋白质分子量标准 ；1 ：空白对照菌株 ；2 ：表达菌株 ；3 ：纯化蛋白质
图 3 CelB 的表达产物的 SDS-PAGE 分析
2.4 CelB的外切葡聚糖酶活性的测定
用 TLC 检测 CelB 的外切酶活性，发现纤维四
糖被 CelB 水解为纤维二糖，说明该酶有外切葡聚
糖酶活性（图 4-A），而以酸膨胀纤维素为底物时，
CelB 能将酸膨胀纤维素降解为葡萄糖和纤维二糖
（图 4-B）。
2.5 CelB的氨基酸序列分析、比较建模及突变位
点的确定
将 CelB 蛋白质的氨基酸序列和已有晶体结构解
析的热纤维梭状芽孢杆菌的纤维二糖水解酶（1L1Y）
以及具有进行性酶切功能的解纤维梭菌的内切纤维
素酶（1F9D）的蛋白质序列进行比对（图 5）。
M 1 MA B 32
㪑㨴㌆
㓔㔤Ҽ㌆ 㪑㨴㌆㓔㔤Ҽ㌆
㓔㔤ഋ㌆
M ：标样 ；1 ：空白对照 ；2 ：纤维四糖水解样品 ；3 ：酸膨胀纤维素水解分析
图 4 以纤维四糖为底物（A）及酸膨胀纤维素为底物（B）
的 CelB 的水解产物的 TLC 分析
2013年第9期 155庞浩等 ：地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）外切葡聚糖酶 CelB 基因的发掘及功能鉴定
酶，这些酶的协同作用使苏云金杆菌可以降解纤维
素［17］。但是目前为止在地衣芽孢杆菌中都只报道了
β-1，4-内切葡聚糖酶，没有发现有 β-1，4-外切葡聚糖
酶的报道，对于地衣芽孢杆菌的 β-1，4-外切葡聚糖
酶是否存在有待验证。
通过检索基因组数据库，从地衣芽孢杆菌的
基因组信息中发现一个 CelB DNA 片段与 β-1，4-外
切葡聚糖酶具有较高的相似性。对这个 CelB 蛋白
质的 SMART 分析进一步确定这是一个纤维素酶蛋
白质序列，SMART 分析结果认为 CelB 蛋白质的第
3-464 位和 483-701 位氨基酸为家族 48 糖基水解酶
（glycosyl hydrolase）功能域。在 CAZY 数据库中糖
基水解酶家族 48（GH48）中含有 3 种酶，分别为从
还原末端作用的 β-1，4-外切葡聚糖酶（EC3.2.1.176）、
β-1，4-内 切 葡 聚 糖 酶（EC3.2.1.4） 和 几 丁 质 酶
（EC3.2.1.14）［18］。在 SMART 分析中没有提示 CelB
1
1
1
25
56
19
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图 5 CelB 与其它纤维素酶的氨基酸序列比对分析
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第9期156
具有信号肽序列，此后进行的 SignalP 4.1 Server 分
析也没有发现 CelB 具有信号肽序列。SignalP 是一
个信号肽预测服务器，它的功能是预测给定的氨基
酸序列中是否存在潜在的信号肽剪切位点及其所在，
被广泛用于原核生物和真核生物的信号肽序列预
测［19，20］。由于在生物信息学预测中没有发现有信号
肽序列，因而在后续的试验中 CelB 的完整序列被亚
克隆到表达载体上进行表达。在大肠杆菌中的表达
发现，在细胞外没有检测到 CelB 酶活，它是以胞内
表达的形式出现的，此外试验中利用载体上面设计
在 CelB 的 N 端的组氨酸标签也没有出现被剪切的现
象。芽孢杆菌的信号肽序列是可以被大肠杆菌识别
并行使功能的［21］，因而这些试验现象提示 CelB 蛋
白质没有包含有信号肽序列。
纯化的重组 CelB 蛋白质对纤维四糖和酸膨胀纤
维素具有水解功能，而对羧甲基纤维素的活性极其
微弱，这些酶活特征符合 β-1，4-外切葡聚糖酶的水
解特性［2］。通过蛋白质同源建模和保守氨基酸位点
预测确定在 CelB 蛋白质中 E38、D228 位点和糖基
水解酶家族 48 的外切酶的催化基团和质子供体位置
高度保守，在已知的功能确定并具有 3D 结构测定
结果的家族 48 的 β-1，4-外切葡聚糖酶中具有同样的
保守氨基酸位点［22］。利用分子突变技术对这两个位
点的突变证实 E38、D228 位点对于维持 CelB 的活
性不可缺少。因而 CelB 蛋白质具有糖基水解酶家族
48 中 β-1，4-外切葡聚糖酶的典型序列特征，在大肠
杆菌中表达的重组 CelB 具有外切纤维素酶的活性功
能特征，证实了 CelB 是一个 β-1，4-外切葡聚糖酶。
4 结论
从地衣芽孢杆菌基因组信息中获得一个 β-1，
4-外切葡聚糖酶基因序列，在大肠杆菌中进行这个
CelB 基因序列的表达和蛋白质纯化，并进行功能鉴
定。该蛋白质具有糖基水解酶家族 48 的典型序列特
征以及保守结构域，酶活特性符合外切葡聚糖酶的
水解特性。这些特征说明 CelB 蛋白质是一个属于糖
基水解酶家族 48 的 β-1，4-外切葡聚糖酶。这是首次
从地衣芽孢杆菌中克隆和活性验证 β-1，4-外切葡聚
糖酶。
参 考 文 献
［1］ Zhang ZS, Donaldson AA, Ma XX. Advancements and future
directions in enzyme technology for biomass conversion［J］.
Biotechnology Advances, 2012, 30（4）：913-919.
［2］ Percival Zhang YH, Himmel ME, Mielenz JR. Outlook for
cellulase improvement ：screening and selection strategies［J］.
Biotechnology Advances, 2006, 24（5）：452-481.
［3］ Morais S, Heyman A, Barak Y, et al. Enhanced cellulose degradation
by nano-complexed enzymes ：Synergism between a scaffold-
linked exoglucanase and a free endoglucanase［J］. Journal of
Biotechnology, 2010, 147（3-4）：205-211.
［4］ Jeon SD, Yu KO, Kim SW, et al. The processive endoglucanase
EngZ is active in crystalline cellulose degradation as a cellulosomal
subunit of Clostridium cellulovorans［J］. New Biotechnology, 2012,
29（3）：365-371.
图 6 CelB 蛋白质 3D 结构的比较建模
M ：标样 ；1-3 ：水解反应中 CelB，1 为 1 μg 蛋白质用量，2 为 2 μg
蛋白质用量，3 为 3 μg 蛋白质用量 ；4-6 ：水解反应中加入 D228N
突变体，4 为 1 μg 蛋白质用量，5 为 2 μg 蛋白质用量，6 为 3 μg 蛋
白质用量；7-9：水解反应中加入 E38Q 突变体，7 为 1 μg 蛋白质用量，
8 为 2 μg 蛋白质用量，9 为 3 μg 蛋白质用量
图 7 突变体的纤维四糖水解产物的 TLC 分析
M M M 7 8 94 5 61 2 3
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（责任编辑 马鑫）