全 文 ：·技术与方法·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第8期
乌 鳢（Channa argus）， 鲈 形 目（Perciformes）
鳢科（Channidae）鳢属（Channa）鱼类，俗称黑鱼，
又名北方蛇头鱼、乌鱼、乌棒、蛇头鱼、文鱼和才
鱼，是我国特有的名特优淡水鱼类，在我国广泛分布。
乌鳢肉质细嫩，口味鲜美，且营养价值颇高，在国
内市场广受欢迎，目前在我国被广泛养殖，具有较
高的经济价值。斑鳢（C.maculata）与乌鳢同属于
鳢科鳢属，从形态学方面与乌鳢类似，从形态学鉴
定有时并不一定准确，存在很强的主观因素，尤其
收稿日期 ：2014-01-03
基金项目 ：国家“863 计划”项目（2011AA100401），农业部公益性行业科研专项项目（200903045）
作者简介 ：董传举，男，博士研究生，研究方向 ：水产基因组学 ；E-mail ：cjd1989@126.com
通讯作者 ：徐鹏，男，研究员，研究方向 ：水产基因组学 ；E-mail ：xupeng@cafs.ac.cn
一种乌鳢与斑鳢线粒体 PCR-RFLP 鉴定方法
董传举1，2  张松皓1  陈坤慈3  宋迎楠1，2  徐鹏1  孙效文1
（1. 中国水产科学研究院生物技术研究中心，北京 100141 ；2. 上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306 ；
3. 中国水产科学院珠江水产研究所，广州 510380）
摘 要 ： 为了高效的鉴别乌鳢与斑鳢，采用 PCR-RFLP 技术，对乌鳢与斑鳢开展分子生物学鉴定方法研究。通过比对乌鳢
和斑鳢线粒体全序列，发现 1 处单核苷酸多态性位点，可以明确区分两个物种。利用 1 对引物对乌鳢与斑鳢线粒体基因组该区域
进行 PCR 扩增，用限制性内切酶 EcoR I 分别对扩增产物进行酶切，并用 1.5％的琼脂糖凝胶检测酶切结果。PCR-RFLP 检测结果显示，
斑鳢的 PCR 扩增产物被 EcoR I 酶切后生成两个不同大小的片段，分别为 315 bp 和 875 bp，乌鳢则保持不变。由此可将乌鳢与斑鳢
在酶切图谱上鉴别出来。
关键词 ： 乌鳢 斑鳢 线粒体基因组 PCR-RFLP 鉴定
A PCR-RFLP Method for Channa argus and Channa maculate
Discrimination
Dong Chuanju1，2 Zhang Songhao1 Chen Kunci3 Song Yingnan1，2 Xu Peng1 Sun Xiaowen1
（1. The Centre for Applied Aquatic Genomics，Chinese Academy of Fishery Sciences，Beijing 100141 ；2. College of Life Science and
Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306 ；3. Pearl River Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery
Sciences，Guangzhou 510380）
Abstract:  In order to identificate Channa argus and C. maculate efficiently. We developed a PCR-RFLP method to conduct research in
molecular biology. Briefly, two genomes of C. argus and C. maculate were aligned and compared, a SNP was identified which can discriminate
two Channa species. A pair of primers was designed to amplify the mitochondrial DNA of both species, then digested by restriction enzyme
EcoR I and test the digestion result by agarose gel of 1.5%. The result showed that the PCR product of C. maculate was digested by EcoR I that
generate two fragments of 315 bp and 875 bp, while the PCR product of C. argus can not be digested by EcoR I. Thus, two Channa species were
clearly discriminated.
Key words:  Channa argus Channa maculate mtDNA PCR-RFLP Identification
是在苗种期或者食品加工处理后的区分和鉴定比较
困难。由于消费习惯、养殖环境、营养价值和养殖
成本等原因，乌鳢和斑鳢的市场价值具有较大差异。
鉴于此，亟须开发出能够快速鉴定乌鳢和斑鳢的分
子检测技术，用于市场监管、种质鉴定等用途。
线 粒 体 DNA（Mitochondrial DNA，mtDNA） 作
为真核细胞的核外遗传因子，复制方式相对比较简
单，遵从严格的母系遗传，在世代传递过程中不发
生重组现象，并且结构基因排列紧凑，没有间隔序
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第8期60
列和内含子，编码效率高于核 DNA。mtDNA 的进化
速率是核 DNA 的 5-10 倍，且缺少有效的 DNA 损伤
修复机制，还有突变累加效应［1］。拷贝数量多，很
容易从组织中分离纯化。并且基因片段大小适中，
种间进化速率较快，对于探索物种系统发育极为有
效［2］。mtDNA 序列的差异可以表明遗传群体在进化
过程中的分离，单倍型频率可以揭示地理种群间的
转移［3］。由于线粒体 DNA 的这些特点，mtDNA 序
列也更多地用于研究驯养动物的亲缘关系、起源及
其多样性，如兔子、猪、山羊、水牛和马等［4-9］。
PCR-RFLP 技术是最早的分子标记技术之一，指基
于限制性内切酶消化不同长度的限制片段的多态现
象在 mtDNA 分析中广泛使用，由于扩增总 DNA，
所以可以有效避免纯化 mtDNA 的繁琐步骤，并且可
以通过 PCR 方法很好地控制 DNA 片段大小，酶切
位点数及扩大模板量，适用于微量组织样品的分析。
由于该技术结果可靠、准确、具有较高的稳定性，
并且检测中仅需要少量的组织材料，所以适用于对
物种各个发育阶段的鉴别研究［10］。
鳢科鱼类是一种颇受欢迎的淡水名贵经济鱼类。
我国是一个盛产乌鳢的国家，目前对乌鳢已进行了
大量的研究，在行为学、光照对其摄食的影响、最
适温度、繁殖特性和苗种培育、生活史、组织器官
的发生和发育、营养需求、营养价值以及核型分析
和杂交育种等各个方面都有所研究［11-21］。而对斑鳢
的研究报道相对少得多，仅见人工繁殖和苗种培育、
营养需求和营养价值等方面的研究［22，23］。本研究通
过对乌鳢与斑鳢的线粒体进行比对分析，找出差异
位点，利用 PCR-RFLP 技术快速鉴定，旨在为琼脂
糖凝胶电泳酶切产物快速准确的鉴定乌鳢和斑鳢提
供方法。
1 材料与方法
1.1 材料
本研究利用中国水产科学研究院珠江水产研究
所提供的乌鳢和斑鳢，活体剪取尾鳍一小部分放入
1.5 mL 离心管中，-80℃保存。仪器与试剂 ：限制性
内切酶和 PCR 试剂均购置于 NEB（北京）有限公
司，引物由生工生物工程公司合成，其他试剂均为
国产分析纯。PCR 仪为 Applied Biosystem 9700（Life
Technologies）。
1.2 方法
1.2.1 基因组 DNA 的提取 分别剪取 10 尾乌鳢和
10 尾斑鳢的尾鳍各 0.5 g，剪碎，放入 1.5 mL 离心
管中并分别编号 ：1-10 为乌鳢，11-20 为斑鳢，应
用酚 / 氯仿抽提法提取基因组 DNA，乙醇沉淀，-20℃
贮存备用。
1.2.2 引物设计 根据文献调研和检索 GenBank 数
据库获取了乌鳢和斑鳢的线粒体基因组序列［24，25］，
两个基因组序列编号分别为 JX978723（乌鳢）和
KC310861（斑鳢）。应用 MEGA5.1 软件［26］对乌鳢
和斑鳢线粒体基因组序列进行比对发现，在第 3 126
bp 位置存在单碱基差异，并且该位点为限制性内切
酶 EcoR I 识别位点。基于此，我们在该位点两侧相
对保守区域，利用 Primer5.0 软件设计引物序列，对
包含该单核苷酸多态性位点的线粒体基因组序列区
域进行扩增。
1.2.3 线 粒 体 DNA 的 PCR 扩 增 提 取 的 线 粒 体
DNA 使用设计的引物进行扩增。PCR 反应体系为
20 μL ：0.5 μL 浓度为 2 500 U/mL 的 Taq DNA 聚合
酶，2 μL 10×PCR 缓冲液，3.2 μL 浓度为 10 pm/μL
的 dNTPs，1 μL 所述基因组 DNA，0.5 μL 浓度为 10
pm/μL 的上游引物 No.1，0.5 μL 浓度为 10 pm/μL 的
下游引物 No.2，12.3 μL 无菌水。
PCR 扩增反应为 ：94℃预变性 5 min ；94℃变性
30 s，58℃退火 30 s，72℃延伸 45 s，共 35 个循环 ；
72℃延伸 10 min，4℃保存备用。
1.2.4 限制性内切酶 EcoR I 的酶切反应 所述酶切
反应体系为 20 μL ：2 μL 上述 PCR 产物，2 μL 10×
酶切缓冲液，1 μL 浓度为 20 000 U/mL 的 EcoR I 限
制性内切酶，15 μL 无菌水，所述酶切反应体系在
37℃反应 30 min，获得酶切产物。
1.2.5 琼脂糖凝胶电泳 将 PCR 产物和酶切产物进
行琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶浓度为 1.5%，电泳
结束后，用凝胶图像处理系统采集电泳图，收集数
据并分析。
2 结果
2.1 序列比对结果和引物设计
应用 MEGA5.1 软件对乌鳢和斑鳢的线粒体基因
2014年第8期 61董传举等 ：一种乌鳢与斑鳢线粒体 PCR-RFLP 鉴定方法
组序列进行比对，发现乌鳢与斑鳢的线粒体 DNA 在
第 3 126 bp 位置存在单核苷酸多态性。而在斑鳢中，
该位置位于限制性内切酶 EcoR I 识别位点区域（第
3 122 bp 和第 3 123 bp 碱基之间的磷酸二酯键为限
制性内切酶 EcoR I 酶切位点）；由于单核苷酸多态
性位点的差异，乌鳢无限制性内切酶 EcoR I 酶切位
点（图 1），故可以通过限制性内切酶 EcoR I 对上述
扩增片段进行酶切，从而对乌鳢与斑鳢进行区分和
C.maculata
C.argus
C.maculata
C.argus
C.maculata
C.argus
C.maculata
C.argus
C.maculata
C.argus
C.maculata
C.argus
C.maculata
C.argus
C.maculata
C.argus
C.maculata
C.argus
C.maculata
C.argus
C.maculata
C.argus
C.maculata
C.argus
C.maculata
C.argus
C.maculata
C.argus
C.maculata
C.argus
C.maculata
C.argus
C.maculata
C.argus
C.maculata
C.argus
C.maculata
C.argus
C.maculata
C.argus
60
60
120
120
180
180
240
240
300
300
360
360
EcoR I䞦࠷ս⛩
420
420
480
480
540
540
600
600
660
660
720
720
780
780
840
840
900
900
960
960
1020
1020
1080
1080
1140
1140
1190
1190
图 1 序列比对结果及酶切位点
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第8期62
1-10 ：乌鳢（C.argus）；11-20 ：斑鳢（C.maculata）；M ：2 000 bp 分子量标准
图 2 线粒体基因组 PCR 产物的一致性
1190
bp
1190
bp
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
鉴别。
通过 Primer5.0 设计引物（表 1）进行 PCR 扩增，
可以得到线粒体基因组 2 807-3 997 bp 之间的区域。
该扩增片段位于线粒体 DNA 的 tRNA-Leu 和 tRNA-
Gln 之间，包括部分 tRNA-Leu 和 tRNA-Gln 区域以
及全部 NADH dehydrogenase subunit I 区域和 tRNA-
Ile 区域，酶切位点位于 NADH dehydrogenase subunit
I 上。
表 1 PCR 扩增引物序列
引物名称 引物序列（5-3） 长度（bp）
No.1 ctaagccctttccacagaggttca 24
No.2 ggcccaaaagcttgtgttagctg 23
2.2 PCR扩增结果
通过上述引物的 PCR 扩增，乌鳢与斑鳢线粒体
DNA 均扩增出单一的片段，未发现其片段长度多态
性，如图 2 所示。
2.3 酶切结果分析
限制性内切酶 EcoR I 酶切结果，如图 3 所示。
将图 2 和图 3 进行比较，可见图 2 中乌鳢样本
（1-10） 的 条 带 经 过 酶 切 后 在 图 3 中（1-10） 没
有发生变化，说明没有发生酶切，图 2 中斑鳢样本
（11-20）的条带位置和数量在图 3 中（11-20）发
生了变化，说明发生了酶切反应。上述酶切位点为
距离斑鳢扩增多核苷酸序列 5 的第 315 和第 316 个
碱基之间的磷酸二酯键，而所述乌鳢扩增多核苷酸
序列 5 的第 315 和第 316 个碱基之间的磷酸二酯
键不会发生酶切。所以通过酶切反应，将斑鳢所述
PCR 产物（1 190 bp）包含的 DNA 分子切成了两段
1190
bp
875
315
bp
1˃ 2˃ 3˃ 4˃ 5˃ 6˃ 7˃ 8˃ 9˃ 10˃ M 11˃ 12˃ 13˃ 14˃ 15˃ 16˃ 17˃ 18˃ 19˃ 20˃
1-10 ：乌鳢（C.argus）；11-20 ：斑鳢（C.maculata）；M ：2000 bp 分子量标准
图 3 内切酶 EcoR I 的酶切产物
DNA 分子，大小分别为 315 bp 和 875 bp（表 2）。
表 2 乌鳢与斑鳢的 PCR-RFLP 片段大小
样本 片段大小（bp）
乌鳢（C.argus） 1190
斑鳢（C.maculata） 315，875
3 讨论
基于线粒体序列开发高效准确的分子鉴定方法
也广泛应用于对许多水产品易混物种的鉴定中。例
如，Aoyama 等［27］ 利 用 线 粒 体 DNA 的 PCR-RFLP
技术开发了欧洲鳗鲡和亚洲鳗鲡的快速鉴定方法 ；
Karaiskou 等［28］ 利 用 线 粒 体 DNA 的 PCR-RFLP 技
术对竹荚鱼属 3 个种进行了成功的分子鉴定等 ；庄
怡等［29］利用 PCR-RFLP 技术对鲫鱼 6 个不同品系
成功的进行鉴定 ；王淞等［30］对 3 个长江野生群体
以及一个人工繁殖群体，共 158 尾鲢 mtDNA D-loop
区段进行 PCR-RFLP 分析，从而鉴定 4 个不同群体
的差异 ；吴海防等［31］采用 PCR 技术对江西瑞昌、
湖南长沙、天津宁河 3 个群体的 144 尾草鱼线粒体
DNA（mtDNA）D-Loop 区段的限制性片段长度多态
性（RFLP）进行了分析，得出草鱼 mtDNA D-Loop
区段的遗传多样性较低的结论 ；文菁等［32］基于
570 bp 左右的线粒体 16S rRNA 基因片段，利用 3
2014年第8期 63董传举等 ：一种乌鳢与斑鳢线粒体 PCR-RFLP 鉴定方法
种核酸内切酶（Dde I，Hae III 和 Sty I）对 16 种海
参 PCR 产物进行酶切，分别产生 10 种、5 种和 5 种
单倍型，通过单倍型的组合，即能有效区分 16 种海
参的种类。
仅依据形态学鉴定并不能准确区分乌鳢与斑鳢，
从而造成相互混杂，直接影响育种效果。乌鳢与斑
鳢 mtDNA 的结构十分简单，并且与其它脊椎动物的
线粒体基因基本相同［33］：一个 mtDNA 控制区（D
-Loop 区），13 个蛋白质基因，其中一个是细胞色素
b 基因（cyt b）；两个是 ATP 酶亚基的基因（ATPase6,
ATPase 8）；3 个是细胞色素氧化酶的基因（CO I、
CO II 和 CO III）；7 个是呼吸链 NADH 脱氢酶亚基
的基因（ND1-6 和 ND4L），有两个 rRNA 基因，一
个是 12S rRNA，一个是 16S rRNA，22 个 tRNA 基因。
因此，本研究利用斑鳢和乌鳢纯种资源，通过线粒
体序列的比对分析，发掘斑鳢和乌鳢的特异性多态
性标签，开发一种基于 PCR-RFLP 技术的快速种质
鉴别方法。
乌鳢与斑鳢线粒体 PCR-RFLP 鉴定方法表明 ：
提取待检测样本的 DNA，设计一对相同的引物就可
以扩增出乌鳢与斑鳢的 mtDNA 片段，并且根据该区
域 mtDNA 的一个 SNP 位点的不同，通过限制性内
切酶 EcoR I 进行酶切，由于斑鳢在该区域具有限制
性内切酶 EcoR I 酶切位点，所以酶切后生成特异的
两条带 ；而乌鳢在该区域不具有酶切位点，故酶切
后仍为一条带，从而琼脂糖凝胶电泳后便可以把乌
鳢与斑鳢鉴别出来。本方法通过 PCR 扩增片段的限
制性酶切，得到的限制性酶切图谱，不但为乌鳢与
斑鳢的鉴定提供了分子标记，同时也为进一步构建
物理图谱，进化遗传学和育种研究打下了基础 ；更
有利于实际生产部门，科研部门快速鉴定所取样本，
提高了工作效率。
该方法不仅操作简单，而且在保证鱼种存活基
础上只需剪取少量鳍条，或者采集少许冷冻鱼肉或
鱼糜提取 DNA，便可快速准确的鉴别出乌鳢和斑鳢，
鉴定结果准确可靠，在群体遗传学、分子生态学和
水产品质量鉴定等方面均有较大的应用前景。
4 结论
本研究利用乌鳢和斑鳢线粒体之间的差异，设
计引物对包含该差异位点的区域进行扩增。对扩增
片段应用限制性内切酶 EcoR I 酶切，并对酶切产物
进行琼脂糖凝胶电泳。电泳结果中，电泳条带为一
条的为乌鳢，两条的为斑鳢。根据条带的数量，便
可以鉴定出乌鳢与斑鳢。
参 考 文 献
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（责任编辑 狄艳红）