全 文 ：生态科学2006年4月第25卷第2期 ECOLOGICSC ENCEApr．，2006，25(2)：11～154
斑鳢肝脏解偶联蛋囱知拼蛆核心筒断韵克隆及分析
崔郁敏，李贵生’，廖婉琴，梁旭方(暨南大学生命科学技术学院生物工程学系，广州510632)
【摘要】解偶联蛋白2(帅couplingpmtein2，UCP2)可使氧化磷酸化解偶联。本研究首次成功从斑鳢(国册一口打破c础砌)
肝脏通过简并引物克隆获得UcP2基因cDNA核心序列，该片段长502bp，编码167个氨基酸残基。使用vectorNTIsuite
6．O软件进行氨基酸同源性序列比较分析表明，斑鳢ucP2与真鲷、鲤鱼、草鱼、斑马鱼UCP2同源性高达-91％、73％、
72％、7l％，与人、大鼠、小鼠UCP2同源性较高为70％、71％、70％。ucP2编码区在鱼类、哺乳类中均具有较高保
守性，提示着脊椎动物UcP2可能在线粒体有氧呼吸代谢过程中承担某种最基本的生命功能。
关键词：解偶联蛋白2；基因克隆；斑鳢
中图分类号：Q785 文献标识码：A 文章编号：l008．8873(2006)02．151．04
Cbninga danalys虹ofthepartiaIcDNAsequence酊Taiwansn kehead(CA口棚坼肌口cH，口鲫uncoupUngprotein2Gene
CUI1rU．min，LIGui．sheng·，LIAoW|an．qin，LIANGXu．钿g(ColIegeofLi诧Sciencea dTbchnolo擘甄JinanUn verSity’
Shipai．Gu弛gzhou510632，Cbina)
Abstra“UncoupIingprotcin2couIdcauseoxidationph sphateuncoupling．ThecDNAf}agmentencodin叠167姗inoacidsof
502bpf}om廿leliverofTaiw觚snal【ehead((孺田l，阳m口c“肠f口)wereobtainedbyusingpCRtwode霉rene期tedprimerS．
Comparisonofthe锄inoacidsofTaiwansnak曲eadUCP2witIl他ds既bre啪(豳2，材譬m咖n，Carp“砌一聘淞“咖)，G豫ss
carp(c，明叩蛔秒哆g砒nf‘蛔妇)，Zebfafish(￡k拧胁册帕)，豫t僻口，，I龉HD，嘲咖淞)，mouse(肘酗m啦删，淞)aIldhum孤“％朋D
s印把船)UCP2sho、Vedthat。identityrespectivelyis91％、73％、72％、7l％、7l％、70％、70％．ThehigllhomoIogybetween
nleUCP2geneof矗eshwat盯fish觚d嘲mmalsmayexpl in幽especialfunctionoftllisg∞eUCP2maybeamech加ismfor
decr髓singttIeconcen仃ationsofreactiveoxygenspecies(R0}s)insidemitochon ria．
Keyword歌UnCouplingprotei2，Molecularlone，Taiwan吼lal∞h隐d
解偶联蛋白2(1mcouplingprotein2，UCP2)是线粒
体内膜上的阳离子载体蛋白，可引起质子的渗漏，使
氧化磷酸化解偶联，ATP合成减少，能量以热的形式
散失【1引，参与脂肪代谢和能量平衡的调节【3】。目前研
究认为，UCP2IIl】烈A广泛分布于动物各组织器官(如
褐色或白色脂肪组织、骨骼肌、心脏、肾脏、肺、脾、
’巨噬细胞、胸腺、骨髓、脑、胃肠道、胰科¨】，与该
家族其他成员的特异性分布不同。UCP2解偶联作用的
基本原理与UCPl相似，但其在组织中的丰度明显低于
UCPl，而UCPl的产热作用依赖于其丰度和自由脂肪
酸的激活【7】。因此，与UCP2相关的解偶联可能并不主
要用于产热。Echtay等【昏10l最新体外研究发现，过氧化
物促进UCP2基因表达可有效抑制线粒体内介导氧化
损伤的ROS(reactiveoxygenspecics)过量产生。研究
还发现UCP2与胰岛素调节和II型糖尿病有关【Il】，与心
颈血管疾病病理有关llz’”J。
UCP2氨基酸序列与UCPl和UCP3的同源性分别
为59％和73％，其三级结构由相似的3个结构域组成。
每个结构域约含100个氨基酸，分别形成两个跨膜螺
旋，由一个N末端和C末端具有胞液定向的基质环相
连。UCP2基因包含8个外显子和7个内含子，长分别约
为8kb和6．3l(b碱基。UCP2的转录单位由2个非编码外
显子和相邻的6个编码外显子组成，UCP2基因分别定
位于人类染色体llql3和小鼠染色体7上。为进一步探
讨UCP2的功能及其进化意义等，本研究首次从斑鳢
(劬硎，l口聊删肠细)肝脏成功克隆得了UCP2基因
cDNA核心序列，这将为脊椎动物UCP2基因结构与功
能研究提供新信息。
1材料与方法
1江材料
1．1．1实验鱼斑鳢(Ch鲫玎口m口c“z口幻)，于石牌市场
购得。
1．1．2试剂SVtotal融叮AIsolation尉t为美国Pmmega
公司产品，HigllQuali够&Quanti锣GelDNAEx仃action
飚tII为U-g锄e公司产品，Ta墨(aRaI斟ALAPCRTM
Kit(AMV)、，rer．1．1、pMD—T18V．ector、1。细DNA聚合
酶等为宝生物工程(大连)与有限公司产品，其它常
规试剂均为进口分装或者国产分析纯试剂。大肠杆菌
删109由本室保存。
1．2方法
1．2．1总RNA提取和cDNA第一链的合成总RNA
的提取与纯化按Promega公司的SVT0talRNA
收稿日期：2005一“·28，2006-03．20接受
作者简介：崔郁敏(1979一)，女，硕士研究生。主要从事动物免疫学的
研究
·通讯作者
万方数据
152 生态科学 25卷
IsolationSystem试剂盒推荐方法进行。cDNA．第一
链的合成使用TaKaRaNALAPCRlMKit(AMv)
Ver．1．1试剂盒，以斑鳢肝脏总RNA为模板，oligo(dT)18
为反转录引物，操作按试剂盒推荐方法进行。
1．2．2UCP2基因cDNA核心片段克隆根据脊椎
动物UCP2基因序列的保守区设计2条引物UCP20lF
和UCP20 R，其序列分别为：
UCP201F：5’．1’rrCCACTGGACACCGCAAGGT-3’，
UCP20 R：5’．GTGACAAACATAACCACGTI℃CA．3’，
以色譬的cDNA第一链为模板，参照№Ra公司M：础r；l：R孓PcR产物重组质粒鉴定
嘲m飚t说明书配制反应体系，PCR扩增条件均 M：marker；l：RT-PcRproducts
为：94℃预变性3min，94℃60s，40℃60s，72℃ 图2斑鳢ucP2RT_PcR电泳图
60s，共30个循环，最后72℃延伸5min。PcR产
Fig．2Ta蛔蛐3nakeheadR暑PcRpmduc‘吼
物经2％琼脂糖电泳切胶用试剂盒回收后，克隆至
pMD18．T载体(TaKaRa)，转化感受态E∞矗．"订109。
1．2．3克隆片段的测序及分析利用M13正反向引
物，通过PcR反应检测得到阳性克隆，阳性克隆由博
亚公司进行测序。用DNA分析软件vectorNTIsuite
6．O进行序列分析。
2结果
2．1斑鳢肝脏总I斟A提取
．堡据Pr0竺ega筌，的sV?taIRNA，1：：三竺竺摹廿粤 M：m砌(er；l，2，3：PcR产物重组质粒鉴定
明书提取斑鳢肝脏总RNA，并以l％琼脂糖凝胶电泳M：mark蠢i，2，3：PcRidentification0frecombinantplasmidof
检测，结果见图l。 器鼍鳢ucP2克隆菌落PcR电泳图
图l斑鳢肝脏总RNA电泳图
FIg．1TaiwansnakeheaduvertotalRNA
2．2斑鳢UCP2基因cDNA核心序列的克隆
根据已报道的人、鼠、犬、爪蟾、斑马鱼、真鲷
等数种脊椎动物UCP2序列的保守区域，设计2条引
物，以斑鳢肝脏总RNA为模板，以RT-PCR方法合成
其cDNA第一链，并进行琼脂糖电泳检测，初步表明
获得大小约为800bp的片段，结果见图2。
2．3PCR产物的克隆和筛选
将纯化的RT-PCR产物直接连接到pMDl8．T
载体中，转化EcD矗JM109感受态细胞，培养后挑选
白斑菌落。利用M13正反向引物进行菌落PCR，其
产物的电泳检测仍是约800bp条带，结果见图3。
2．4克隆片段的测序及分析
送克隆所得片段，进行正反两个方向的序列测定，
测序报告中核苷酸序列为503bp，其推测氨基酸序列
为167个氨基酸，结果见图4。经结构功能分析发现，
此段氨基酸序列包含线粒体内膜载体蛋白3个特征结
构之一：特征结构PTD、lr、，I72到8l位氨基酸。
2．5序列对比及分析
将得到的UCP2序列进行BLAsT分析表明所克
隆基因属新登录的基因。使用vectorNTIsuite6．0软
件进行氨基酸同源性序列比较发现，斑鳢UCP2与真
鲷、鲤鱼、草鱼、斑马鱼、大鼠、小鼠、人UCP2氨
基酸同源性较高，分别为9l％、73％、72％、7l％、
71％、70％、70％。uCP2编码区在鱼类、哺乳类中均
具有较高保守性，提示着脊椎动物UCP2可能在线粒
体有氧呼吸代谢过程中承担某种最基本的生命功能。
万方数据
2期 崔郁敏，等：斑鳢肝脏解偶联蛋白2cDNA核心片断的克隆及分析 153
l GGGACGATCAGTACCATGGTCCGCACAGAGGGCCCCAAGTCTCTGTACAACGG电CTGGTA
1 G T I S T M V R T E G P K S L Y N G L V
6l GCAGGTCTGTTGAGACAAGTGTGCTTCGCCTCCATCAGAATTGGCCTCTACGACAATGTC
20 A G L L R Q y C F A S I R I G L Y D N V
12l AAAAATTTCTATACAGGAGGAAAAGAAAATCCCGGTGTACTTGTACGTATTCTGGCTGGC
40 K N F Y T G G K E N P G V L V R I L A G
18l TGCACAACAGGTGCTATGGCGGTGTCCTTTGCACAACCCACTGATGTGGTCAAGGTTCGA
60 C T T G A M A V S F A Q 狂) T D V V K V RI
241 TTCCAAGCCCAGATGAACCTGGACGGTGTCGCTCGTCGGTACAACGGCACCATGCAGGCT
80 旷I Q A Q M N L D G V A R R Y N G T M Q A
301 TACAAACTCATCTTCCAGAACGAGGGCTTACGTGGACTCTGGAAAGGCACACTACCCAAC
100Y K L I F Q N E G L R G L W K G T L P N
36l ATTACAACAAATGCACTAGTCAACTGCACAGAGCTGGTTACATATGACCTAATCAAGGAG
l20 I T T N A L V N C T E L V T Y D L I K E
42l GCTATCCTTAAACATAACCTGATGCAGATAATCTACCAATGCCACTTTGTGTCTGCATTT
l40 A I L K H N L M Q I I Y Q C H F V S A F
481 GGTGGCTGGCTTTGTTACAACCG
160 G G W L C Y N
图4斑鳢解偶联蛋白2基因cDNA部分序列及其推导的氨基酸序列
Fig．4Thepanialnucleotidesequenceof1aiwansnakehead(C垤鲫一口肌口c世，㈣un∞upUngpIDtein2cDNAandputa6Veamino
acmsequence
线粒体内膜载体蛋白1个特征结构用方框表示。Amitochondrialca玎ierpmteinsignan∽motifsisbox酣．
斑鳢 l
真鲷 6
鲤鱼 65
草鱼 65
斑马鱼65
大鼠 64
小鼠 64
人 64
斑鳢 6l
真鲷 66
鲤鱼 125
草鱼 l25
斑马鱼 l25
大鼠 124
小鼠 l24
人 1 24
斑鳢 l21
真鲷 1 26
鲤鱼 184
草鱼 184
斑马鱼l84
大鼠 183
小鼠 l83
人 l83
GTISTMVRTEGPKSLYNGLVAGLLRQVCFASIRIGLYDNVKNFYTGGKENPGVLVRILAG60
GTISTMIKTEGPRSLYNGLVAGLQRQMCFASIRIGLYDNVKNFYTGGKDNPNVLIRILAG 65
GTISTMVRVEGPRSLYSGLVAGLQRQMSFASVRIGLYDSVKQFYTKGSEHVGIGSRLMAGl24
GTISTMVRVEGPRSLYSGLVAGLQRQMSFASVRIYDSVKQFYTKG DHVGIGSRLMAGl24
GTISTMVRVEGPRSLYSGLVAGLQRQMSFASVRIGLYDSVKQFYTKGSDHAGIGSRLMAG124
GTILTMVRTEGPRSLYNGLVAGLQRQMSFASVRIGLYDSVKQFYTKGSEHAGIGSRLLAG123
GTILTMVRTEGPRSLYNGLVAGLQRQMSFASVRIGLYDSVKQFYTKGSEHAGIGSRLLAG123
GTILTMVRTEGPRSLYNGLVAGLQRQMSFASVRIGLYDSVKQFYTKGSEHASIGSRLLAGl23
串事 奉木 宰 宰丰章 木幸木 木枣木木卓牛 宰木 毒卓宰 母宰奉宰掌掌 宰宰 宰宰宰 枣 奉宰
CTTGAMAVSFAQPTDVVKVRFQAQMNLDGVARRYNGTMQAYKLIF NEGLRGLWKGTLPNl20
CTTGAMAVSFAQPTDVVKVRFQAQSNLDGVARRYTGTMQAyKHIFQNEGMRGLWKGTLPN125
CTTGAMAVALAQPTDVVKVRFQAQ—NSAGANKRYHGTMDAYRTIAKEEGFRGLWKGTGPNl83
CTTGAMAVAVAQPTDVVKVRFQAQIGA—GANK YNGTMAAYRTIKEEGFRGLWKGTGPN183
CTTGAMAVAVAQPTDVVKVRFQAQVSA—GSSKRYHST研DAYRTIAKEEGFRGLWKG_rGPNl83
STTGALAVAVAQPTDVVKVRFQAQARAGG—GRRYQSTVEAYKTIAREEGIR LWKGTSPNl82
STTGALAVAVAQPTDVVKVRFQAQARAGG—GRRYQSTVEAYKTIAREEGIR LWKGTSPNl82
STTGALAVAVAQPTDVVKVRFQAQARAGG—GRRYQSTVNAYKTIAREEGFRGLWKGTSPN182
木掌幸木 半木 奉枣术幸木木奉幸木木枣木木唪 丰宰 十’I}木，I宰奉宰
ITTNALVNCTELVTYDLIKEAILKHN MSDNLPCHFVSAFGAGFVTTl67
ITRNALVNCTELVTYDLIKEAILKHN LSDNLPCHFVSAFGAGFVTTl72
ITRNAIVNCTELVTYDLIKDAL KSSLMTDDLPCHFTSAFGAGFCTT230
ITRNAIVNCTELVTYDLIKDALLKSSLMTDDLPCHFTSAFGAGFCTT230
ITRNAIVNCTELVTYDLIKDALLKSSLMTDDLPCHFTSAFGAGFCTT230
VARNAIVNCTELVTYDLIKDTLLKANLMTDDLPCHFTSAFGAGFCTT229
VARNAIVNCAELVTYDLIKDTLLKANLMTDDLPCHFTSAFGAGFCTT229
VARNAIVNCAELVTYDLIKDALLKANLMTDDLPCHFISAFGAGFCTT229
掌半 率术奉 术书掌书事掌搴车 掌搴 掌车 搴，#丰掌謇书事 搴事
图5斑鳢uCP2与其他脊椎动物uCP2基因氨基酸序列同源性比较
Fig．5Alignmentofthededucedamlnoacmsequenc麟oftheUCP2fhmTaiwansnakehead(C知口一糟口肼们础啦)wl恤蚀esquenc∞
Ofo抽ervenebr8tes
序列为：真鲷(凡咿w脚q，or’GeIlBaIll(：AAL92117)’鲤鱼(0’pr加淞c口甲f0，G咖aIll(：cAB46248)，草鱼(o翻印_Il口例增砒一触批，G柚狮k：AA)(49553)，斑马鱼
(D册如册．jD，GcnB锄k=AAH56737)大鼠(尺口妇s加忡曙ic时GeIlBaIll(：B从28832)，小鼠(胁s聊岱删，l博，G吼B柚k：AFll1999)’人(胁肿D印泐拈 G蜘Bmk：
从B48411)。“．，’表示保守的氨基酸残基。
Thescquenccsa化reds蛆b陀啪(P‘曙r淞研巧Dr，G舶B觚k：从L92117)，c咖monc州铆r加船c口，pjo，G曲B柚k：cAB46248)，grasscarp(强一pP^叼硼g协I^如妇，
G蜘B皿k：AAX49553)，zcb随fish(D册如，w如，G髓B吼k：AAH56737)m“詹口砌s加n馏记驸，GcIlBarIl(：B从28832)’mo璐e(胁5埘淞cl|船rG锄B锄kAFlll蜊，
hum柚(舶mDs口p如邶， GeIlB肌k：从B48411)．111econserv dcsiducsinallsequ朋cesarejndicatedbyasterisk(+)．
万方数据
万方数据
斑鳢肝脏解偶联蛋白2cDNA核心片断的克隆及分析
作者： 崔郁敏， 李贵生， 廖婉琴， 梁旭方， CUI Yu-min， LI Gui-sheng， LIAO Wan-qin，
LIANG Xu-fang
作者单位： 暨南大学生命科学技术学院生物工程学系,广州,510632
刊名： 生态科学
英文刊名： ECOLOGIC SCIENCE
年，卷(期)： 2006,25(2)

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